2-trifluorometyylianiliininukleotidi metallivälitteisenä 19F NMR-koettimena Mahdollinen alaotsikko Bio-orgaaninen tutkimusryhmä pro gradu -tutkielma Laatija: Assi Lepistö 20.06.2024 Turku Turun yliopiston laatujärjestelmän mukaisesti tämän julkaisun alkuperäisyys on tarkastettu Turnitin OriginalityCheck -järjestelmällä. Pro gradu -tutkielma Oppiaine: Lääkekehityksen kemia Tekijä: Assi Lepistö Otsikko: 2-trifluorometyylianiliininukleotidi metallivälitteisenä 19F NMR-koettimena Ohjaaja(t): Professori Tuomas Lönnberg, professori Pasi Virta Sivumäärä: 40 sivua Päivämäärä: 20.06.2024 Biologisesti merkittävien sekvenssien tunnistamiseen keskittyvien hybridisaatiokoettimien käyttö terapeuttisissa ja diagnostisissa sovelluksissa asettaa useita vaatimuksia koettimen rakenteelle. Hybridisaatiokoettimen pariutuessa luonnollisen vastinjuosteen kanssa, sen on vähintään jäljiteltävä mittasuhteiltaan ja fysikokemiallisilta ominaisuuksiltaan luonnollista juostetta. Hybridisaatiokoettimen pariutumista on kyettävä seuraamaan siten, että se erottuu biologisesta taustastaan. Hybridisaatiokoettimella tavoitellaan usein korkeampaa affiniteettia komplementaariseen juosteeseen. Metallit ovat osa nukleiinihappojen normaalia toimintaa ja ylläpitävät fysiologisissa olosuhteissa sen rakennetta. Metalli-ionien yhteensopivuutta onkin hyödynnetty jo vuosikymmenten ajan luonnollisten nukleiinihappojen ominaisuuksien ja toiminnallisuuden muokkaamiseen. Metallit muodostavat nukleiinihappojen kanssa koordinaatiosidoksia- ja komplekseja, jotka ovat usein liian labiileja laimeissa ja vähämetallisissa olosuhteissa. Metalli-ionien kovalenttinen sitoutuminen hybridisaatiokoettimessa olevaan nukleotidianalogiin tarjoaa merkittävän edun pysyvyydessä koordinaatiosidoksiin verrattuna. Erityisesti elohopeaionin kovalenttinen sitoutuminen nukleotidianalogiin on tuottanut potentiaalisia hybridisaatiokoettimia vähämetallisiin ja laimeisiin liuoksiin, joilla on korkea affiniteetti ja selektiivisyys komplementaarisiin vastinjuosteisiin. Tässä pro gradu -tutkimusprojektissa valmistettiin oligonukleotidi, jonka tarkoituksena oli toimia lineaarisena metallivälitteisenä koettimena. Hybridisaation lähiympäristön tutkimista varten koetin leimattiin trifluorimetyyliryhmällä, joka mahdollisti 19F NMR-spektroskopian käytön. Koetin koostui 11 nukleotidin pituisesta juosteesta, jossa yksi kanoninen nukleotidi korvattiin C-nukleotidianalogilla. C-nukleotidianalogissa nukleoemäksenä toimi aniliini, joka oli leimattu trifluorimetyyliryhmällä C2-hiilestä. Nukleotidianalogin sijainti nukleiinihappoketjussa oli joko 3’-päässä, 5’ päässä tai ketjun keskellä. Viimeiseksi mainittua juostetta, jossa nukleosidianalogi sijaitsi ketjun keskellä, yritettiin merkuroida aniliinin C5 hiilestä siinä onnistumatta. Turun Yliopiston bio-orgaaninen tutkimusryhmä sai sittemmin ratkaistua merkurointiongelman ja juoste merkuroitiin onnistuneesti. Avainsanat: metallivälitteinen emäspariutuminen, lineaarinen koetin, merkurointi, 19F-NMR Sisällysluettelo 1 Johdanto 7 1.1.1 Vetysidos on merkittävä kaksoiskierteen geometriaa ylläpitävä tekijä 9 1.2 Watson-Crick pariutuminen 9 1.2.1 Vaihtoehtoiset emäspariutumisen muodot 10 1.3 Keinotekoinen pariutuminen 10 1.3.1 Hybridisaatiokoetin 11 1.4 Metallit ja nukleiinihapot 11 1.4.1 HSAB-teoria 11 1.4.2 Metallivälitteisessä pariutumisessa vetysidokset korvataan metallisidoksilla 12 1.5 Metallivälitteisen emäspariutumisen rajoitteet terapeuttisissa ja diagnostisissa sovelluksissa 12 1.5.1 Metallien koordinaatiogeometria 13 1.5.2 Organometallinen koordinaatiokompleksi 13 1.5.3 Metallointi 14 1.6 Metallin valinta metallivälitteiseen emäspariutumiseen biologisesti merkittävien sekvenssien tunnistamisessa 15 1.7 Palladium 16 1.8 Elohopea 17 1.8.1 5-merkurisytosiini 17 1.8.2 3-fluori-2-merkuri-6-metyylianiliini 18 1.8.3 Molekulaarinen majakkakoetin 20 1.8.4 Karbatsolit: 1,8-dimerkuri-6-fenyylikarbatsoli, 1-merkuri-6-fenyylikarbatsoli ja 8-merkuri- 6-fenyylikarbatsoli 21 1.9 Metallivälitteisen hybridisaation analysointi termodynaamisin menetelmin 22 1.9.1 UV-spektroskopia 23 1.9.2 Ympyrädikroismispektroskopia (CD) 24 1.10 Yleisimmät tutkimusmenetelmät metallivälitteisten makromolekyylien atomitason seurantaan: NMR ja röntgenkristallografia 25 1.10.1 Röntgenkristallografia 26 1.10.2 19F NMR-spektroskopia 27 1.11 SNP-tunnistus elohopeavälitteisten hybridisaatiokoettimien potentiaalisena sovelluskohteena 28 2 Tulokset ja tulosten tarkastelu 30 2.1.1 Yleiset menetelmät 33 2.1.2 Metyyli-2-deoksi-α,β-D-ribofuranosidi (2) 33 2.1.3 Metyyli-3,5-bis-O-(tert-butyylidimetyylisilyyli)-2-deoksi-α,β-D-ribofuranosidi (3) 33 2.1.4 3,5-Bis-O-(tert-butyylidimetyylisilyyli)-1,2-didehydro-1,2-dideoksi-D-ribofuranoosi (4) 34 2.1.5 3-O-(tert-butyylidimetyylisilyyli)-1,2-didehydro-1,2-dideoksi-D-ribofuranoosi (5) 34 2.1.6 4-Jodi-2-(trifluorimetyyli)fenyylitrifluoriasetamidi (7) 35 2.1.7 {4-[3-O-(tert-butyylidimetyylisilyyli)-2-deoksi-2,3-didehydro--D-erythro- pentofuranosyyli]-2-trifluorimetyylifenyyli}trifluoriasetamidi (8) 35 2.1.8 2-trifluori-N-(4-((2R,5R)-5-(hydroksimetyyli)-4-oxotetrahydrofuran-2-yyli)-2- (trifluorometyyli)fenyyli)asetamidi (9) 36 2.1.9 2-trifluori-N-(4-((2R,4S,5R)-4-hydroksi-5-(hydroksimetyyli)tetrahydrofuran-2-yyli)-2- (trifluorimetyyli)fenyyli)asetamidi (10) 37 2.1.10 N-(4-((2R,4S,5R)-5-((bis(4-metoksifenyyli)fenyyli)metoksi)metyyli)-4- hydroksitetrahydrofuran-2-yyli)-2-(trifluorimetyyli)fenyyli)-2,2,2-trifluoriasetamidi (11) 37 2.1.11 (2R,3S,5R)-2-((bis(4-metoksifenyyli)(fenyyli)metoksi)metyyli)-5-(4-(2,2,2- trifluoriasetamidi)-3-(trifluorimetyyli)fenyyli)tetrahydrofuran-3-yl(2- syanoetyyli)diisopropyylifosforiamidiitti (12) 38 2.1.12 Oligonukleotidikoettimen valmistus 39 2.2 Johtopäätökset 40 Lähteet 43 Liitteet 58 Liite 1. Lisämateriaali 58 Lyhenteet A adeniini ACN asetonitriili aq. vesiliuos CD ympyrädikroismi Cy2NMe N,N-disykloheksyylimetyyliamiini D donoriatomi DCM dikloorimetaani dd dupletin dupletti ddd dupletin dupletin dupletti DMTrCl 4,4-dimetoksitrityylikloridi DNA deoksiribonukleiinihappo DSC differentiaalinen pyyhkäisykalorimetri dt dupletin tripletti EDTA etyleenidiamiinitetraetikkahappo ESI-TOF elektronisumutusionisaatio yhdistettynä lentoajan mittaukseen FRET fluoresenssi-resonanssi-energiansiirto G guaniini HPLC korkean erotuskyvyn nestekromatografia HRMS korkean resoluution massa spektrometria HSAB kova-pehmeä happo-emäs teoria HSQC heteronukleaarinen lyhyen kantaman korrelaatiospektroskopia ITC isoterminen titrauskalorimetria J J-kytkentä M metalli-ioni m multipletti MAD moniaaltoinen anomaalinen diffraktio NMR ydinmagneettinen resonanssi Ph fenyyliryhmä Py pyridiini q kvartetti Rf retentiotekijä RNA ribonukleiinihappo RP HPLC käänteisfaasin korkean erotuskyvyn nestekromatografia C sytosiini s singletti SNP yhden nukleotidin monimuotoisuus STAB natriumasetoksiboorihydridi T tymiini t tripletti TBAF tetrabutyyliammoniumfluoridi TBDMS tert-butyylimetyylisilyyli t-Bu tert-butyylitolueeni TFAA trifluorietikkahappoanhydridi THF tetrahydrofuraani TLC ohutkerroskromatografia Tm sulamislämpötila TMS-OTf trimetyylisilyylitrifluorometaanisulfonaatti U urasiili UV ultravioletti WC Watson-Crick 1 Johdanto Nukleiinihapot kuuluvat elämälle välttämättömiin biologisiin makromolekyyleihin. Tärkeimmät nukleiinihapot ovat DNA eli deoksiribonukleiinihappo ja RNA eli ribonukleiinihappo. DNA:n pääasiallinen tehtävä on toimia varastona perinnölliselle tiedolle ja välittää perimätietoa eteenpäin tuleville sukupolville. RNA:n toiminnot ovat sen sijaan hyvinkin moninaiset. RNA osallistuu muun muassa geenien ilmentämiseen, proteiinisynteesiin ja geneettisen tiedon säätelemiseen, sekä moniin muihin biologisiin prosesseihin. Nukleiinihapot ovat polymeerejä, joiden yksikkörakenteita eli monomeereja kutsutaan nukleotideiksi. Nukleotidit koostuvat sokeriosasta, fosfaattiosasta sekä emäsosasta. Nukleosidi on nimitys rakenteelle ilman fosfaattiosaa. Nukleotidit muodostavat nukleiinihappoja fosfodiesterisidoksella, jossa sidos muodostuu sokeriosan 5’ hiilestä seuraavan nukleotidin sokeriosan 3’ hiileen. Nukleiinihappojen emäsjärjestys ilmoitetaan 5’-päästä 3’-päähän. Eli ensimmäisenä olevan nukleotidin sokeriosan 5’-hiilessä on vapaa hydroksyyliryhmä ja vastaavasti viimeisenä olevan nukleotidin sokeriosan 3’-hiilessä on vapaa hydroksyyliryhmä. Oligonukleotideillä viitataan nukleiinihappoketjuihin, jotka ovat lyhyitä. Oligo- etuliiteellä tarkoitetaan muutamaa (3–10 kpl)1, mutta käytännössä oligonukleotideilla voidaan viitatata myös nukleiinihappoketjuihin, joissa on satoja perättäisiä nukleotidejä. Kaksoiskierteissä juosteet asettuvat tai rakentuvat kaksoiskierteisiksi rakenteiksi niin, että koodaava juoste ja vastinjuoste ovat vastakkaissuuntaiset. Juosteet ovat siis rinnakkain siten, että koodaavan juosteen suunta on 5’3’ ja vastinjuosteen suunta on 3’5’. DNA esiintyy pääasiassa kaksoiskierteenä, kun taas RNA yksijuosteisena. Nukleotidin sokeriosa on viisihiilinen pentoosisokeri, DNA:ssa 2’-deoksiriboosi ja RNA:ssa riboosi. Pentoosisokeri määrittää vahvasti toiminnallisen eron DNA:n ja RNA:n välillä. DNA:ssa pentoosisokerin C2’-hiileen on kiinnittynyt vety, kun taas RNA:ssa tilalla on hydroksyyliryhmä. Hydroksyyliryhmä tekee RNA:sta merkittävästi labiilimman kuin DNA, sillä C2’- hydroksyyliryhmän läsnäolo RNA:ssa mahdollistaa muun muassa lähellä olevien fosfodiesterisidoksien pilkkoutumisen.2,3 Labiilius mahdollistaa RNA:n reaktiivisuuden ja sen moninaiset tehtävät, kun taas perintötekijöiden säilymiselle DNA:n sisältämän deoksiriboosin stabiilimpi rakenne on eduksi. RNA:ssa C2’-hydroksyyliryhmä määrittää RNA:n muodostaman kaksoiskierteen sekundaarirakenteen A-kierteeksi, kun taas pääosin (fysiologisissa nesteissä) B- kierteinen DNA voi esiintyä myös A, B, D tai Z-kierteisenä.4,5 Fosfaattiosa vastaa isoilta osin DNA:n ja RNA:n fysikaalisista ominaisuuksista. Fosfaattiosa yhdessä sokeriosan kanssa muodostaa nukleiinihappojen tukirungon. Nukleiinihappoketjussa säännöllisesti toistuva polyanionisuus on tärkeässä asemassa useasta syystä. 1. Tukirangan toistuva varaus ohjaa emäsosien suuntautumista toisiaan kohden siten, että vetysidosten muodostuminen oikeaan kohtaan olisi mahdollinen6. 3.Varaus estää kaksoiskierteitä poimuttumasta6,7. 3. Tukirangan fysikaalinen vaikutus rakenteeseen on niin merkittävä, ettei pienet rakenteen muutokset, kuten emästen vaihtuminen tai muuttuminen estä DNA:n kahdentumista, mahdollistaen evolutiiviset muutokset6,8– 10. 4. Tukirangan varaukset lisäävät nukleiinihappojen vesiliukoisuutta.5 Emäsosat ovat typpipitoisia, tasomaisia heterosyklisiä molekyylejä. Emäsosat luokitellaan kahteen tyyppiin rengasrakenteiden määrän perusteella: pyrimidiinit koostuvat yhdestä renkaasta ja puriineissa renkaita on kaksi. Pyrimidiinejä ovat tymiini (T, vain DNA:ssa), sytosiini (C), urasiili (U, vain RNA:ssa) ja puriineja ovat guasiini (G) ja adeniini (A). Edellä mainittuja kutsutaan kanonisiksi emäksiksi. Emäsosat yhdistyvät sokeriosaan N-glykosidisidoksella siten, että pentoosisokerin anomeerisestä hiilestä C1’ on sidos joko pyrimidiiniemäksen N1-typpeen tai puriiniemäksen N9- typpeen. Glykosidisidoksen stereokemialla on merkitystä. Luonnollisissa nukleiinihapoissa glykosidisidos on aina β-sidos, jossa emäsosa on samalla puolella sokeriosan tasoa kuin sokeriosan 5’ hiilen hydroksyyliryhmä. α-glykosidisidoksessa emäsosa ja 5’ hiilen hydroksyyliryhmä ovat eri puolella tasoa. Keinotekoisissa nukleosideissa luonnollinen N-glykosidisidos korvataan usein C- glykosidisidoksella, joka on vähemmän labiili. Nukleiinihappoketjun vierekkäisten emäsosien pinoutumisella on merkittävä vaikutus DNA kaksoiskierteen stabiiliuteen11. Pinoutumisen lisäksi emäsosat vuorovaikuttavat kaksoiskierteessä vastakkaisen juosteen eli komplementaarisen juosteen kanssa myös vetysidoksin. Vetysidoksia muodostuu kaksi kappaletta adeniinin ja tymiinin (RNA:ssa urasiilin) välille, sekä guaniinin ja sytosiinin välille kolme kappaletta. Vetysidosten muodostumista edellä mainittujen emäsparien välille kutsutaan Watson-Crick-pariutumiseksi.12 Kuva 1. Kanoniset emäkset: guaniini (G), adeniini (A), sytosiini (C), tymiini (T) ja urasiili (U). 1.1.1 Vetysidos on merkittävä kaksoiskierteen geometriaa ylläpitävä tekijä Vetysidoksen sidosenergia koostuu useista voimista (Ekokonais = Eelektrostaattinen + Epolarisaatio + Evarauksen siirto + Edispersio + Evaihtoenergia) sidoksen muodostavien atomien ja niiden ympäristön yhteisvaikutuksesta, joista elektrostaattisilla voimilla on suurin vaikutus nukleoemästen välisissä vetysidoksissa. Toisiaan lähellä olevien vetysidosten sidosenergiat eivät ole suoraan yhteenlaskettavissa, sillä vetysidokset muodostavat usein toisiinsa vaikuttavia verkostoja. Yksittäisten vetysidoksien sidosenergiat nukleoemäksiä vastaavissa vuorovaikutuksissa ovat kuitenkin pääosin noin 1 kcal mol-1 suuruisia. Lineaarisuus on vetysidosten karakteristinen geometrinen piirre ja sidoksen lineaarisuuden vuoksi vetysidoksella on merkittävä, geometriaa säätelevä vaikutus.13,14 Vastakkaisten emäsparien välillä olevien vetysidosten yhdessä pitävät voimat ovat suhteellisen pieniä. Alhaisilla sidosenergioilla on kuitenkin biologista merkitystä, sillä se mahdollistaa muun muassa kaksoiskierteisen DNA:n ”hengittämisen” (engl. DNA breathing)15 eli kaksoiskierteen avautumisen ja uudelleen pariutumisen. DNA:n ”hengittäminen” mahdollistaa DNA:n sisältämän geneettisen informaation käyttöönoton. 1.2 Watson-Crick pariutuminen Watson-Crick-pariutumisessa pyrimidiini- ja puriiniemäkset muodostavat vetysidosten välityksellä emäsparit. Muodostuvat emäsparit lukkiutuvat lähes tasomaiseksi rakenteeksi suhteessa tukirankaan, kuten tikkaiden porrasaskelmat16. Guaniinin ja sytosiinin välille muodostuu kolme vetysidosta ja adeniinin ja tymiinin (RNA:ssa urasiilin) välille kaksi vetysidosta. Watson-Crick-emäspariutumisessa DNA:n toiminnalliset ominaisuudet pysyvät muuttumattomina sekvenssin eli emäsjärjestyksen vaihtelusta huolimatta, mahdollistaen perimätiedon monipuolisen koodaamisen ja RNA:n synteesin koodin mukaisesti. Fysiologisissa olosuhteissa Watson-Crick-parit A-T/U ja G-C ovat energeettisesti suotuisimmat ja siten yleisimmin esiintyvät emäsparit DNA- kaksoiskierteissä.17 Yllä mainittuihin ominaisuuksiin vaikuttaa useat tekijät, joista mainittakoon kolme tärkeää piirrettä: 1. Watson-Crick-parit A-T/U ja G-C ovat mittasuhteiltaan lähes identtiset18. Parien mittasuhteiden samankaltaisuus auttaa pitämään tukirankaan kohdistuvia avaruudellisia muutoksia mahdollisimman vähäisinä emäsjärjestyksen vaihtelusta huolimatta19. 2. Watson-Crick- pariutuminen pitää emäkset avaruudellisesti suotuisassa asennossa emäspinoutumisen näkökulmasta (kuten vaaka-askelmat tikkaissa)13 3. Watson-Crick-pariutumisessa tukirankaan kohdistuu vain vähäistä kiertymistä.5 Tarkat mittasuhteet ja pariutumissäännöt toimivat myös varmistuksena perimän eheydelle. Muutokset voivat käynnistää DNA:n tehokkaan korjauskoneiston20–22, apoptoosin eli geneettisesti ohjelmoidun solukuoleman tai pysäyttää solusyklin.23,24 1.2.1 Vaihtoehtoiset emäspariutumisen muodot Nukleiinihapot pariutuvat myös muilla tavoilla kuin Watson-Crick-pariutumisella25–27. Vaihtoehtoiset pariutumismuodot tuottavat yleensä muita kolmiulotteisia rakenteita kuin kaksoiskierteitä ja näillä rakenteen muutoksilla on tärkeä merkitys eliöiden nukleiinihappojen toiminnassa, erityisesti RNA:ssa28. Esimerkiksi Hoogsteen-emäspareilla on geenien toiminnan säätelyssä korvaamaton rooli29–31. Vallitseva emäspariutumisen muoto riippuu niin emäsjärjestyksestä kuin ympäröivistä olosuhteista, eikä Watson-Crick-pariutuminen ole kaikissa olosuhteissa optimaalisin. Emäspariutumisen pariutumismuotoon vaikuttavat intramolekulaariset vuorovaikutukset: vetysidokset emäsparien välillä, viereisten emästen pinoutumisvuorovaikutukset ja rakenteen muodostumiseen liittyvä entropian alenema. Ympäristön vaikuttavia tekijöitä ovat muun muassa liuoksen vastaionit ja hydraatio.32 Kuva 2. Watson-Crick-pariutuminen DNA:n kaksoiskierteessä. 1.3 Keinotekoinen pariutuminen Keinotekoisissa nukleiinihapoissa yhteen tai useampaan nukleotidiin on lisätty tai poistettu kemiallisia ryhmiä tai ne on kokonaan korvattu analogisilla molekyyleillä. Muunnelmat voivat kohdistua fosfaattiosaan, sokeriosaan tai emäsosaan. Pariutumisen näkökulmasta kiinnostuksen kohde on yleensä emäsosa, sen ollessa määrittävä tekijä juosteiden komplementaarisuudessa ja selektiivisyydessä. 1.3.1 Hybridisaatiokoetin Hybridisaatiolla tarkoitetaan kahden yksijuosteisen nukleiinihapon pariutumista komplementaarisesti kaksoiskierteeksi. Kun tutkitaan hybridisaatiota, yleensä toinen juosteista on hybridisaatiokoetin. Hybridisaatiokoetin voi olla luonnollinen tai keinotekoinen nukleiinihappoketju, johon on lisätty jokin kemiallinen ryhmä eli leima. Leimaus mahdollistaa kemiallisen ympäristön muutoksen, kuten pariutumisen, todentamisen. Kemiallinen leima voi olla esimerkiksi radioaktiivinen, fluoresoiva tai sisältää NMR-aktiivisia ytimiä. Hybridisaatiotutkimuksilla voidaan tutkia juosteiden komplementaarisuutta, selektiivisyyttä, kaksoiskierteen muotoa ja pysyvyyttä. Erityisesti keinotekoisten nukleiinihappojen kohdalla molekyylitason muutoksien vaikutus kaksoiskierteeseen tuo merkittävää tietoa. Kaksoiskierteitä yhdessä pitävät voimat ovat suhteellisen pieniä, jotta nukleiinihappojen purkautuminen tarvittaessa, esimerkiksi replikaatiota tai korjaamista varten, olisi mahdollinen. Ympäristön lämpötilan nosto aiheuttaa kaksoiskierteen purkautumisen, jota kutsutaan tässä yhteydessä sulamiseksi. Siirtymää kaksoiskierteestä erillisiksi juosteiksi voidaan seurata usealla eri menetelmällä. Tällaisia menetelmiä ovat UV-sulamislämpömittaukset, ympyrädikroismispektroskopia (circular dichroism, CD), NMR-spektroskopia ja viskositeettitutkimus.19 1.4 Metallit ja nukleiinihapot Polyanionisen rakenteensa vuoksi DNA ja RNA esiintyvät aina yhdessä kationien eli positiivisesti varautuneiden ionien kanssa. Kationeina fysiologisessa ympäristössä ovat polyamiinit sekä metalli- ionit, pääasiassa Na+, K+, Mg2+ ja Ca2+.33,34 Tämän lisäksi metalleilla on muita, DNA/RNA:n toiminnalle välttämättömiä funktioita.35,36 Metalli-ioneilla on suuri vaikutus DNA:n ja RNA:n rakenteeseen ja toimintaan. Metallien vuorovaikutusta DNA:n ja RNA:n kanssa on tutkittu laajalti, niin fysiologisen toiminnan näkökulmasta, ympäristön tuomien metallien vaikutuksen kartoittamiseksi kuin niiden käyttämiseen nanoteknologisiin tarkoituksiin, muokaten luonnollisten nukleiinihappojen ominaisuuksia.35–40 1.4.1 HSAB-teoria Metallit vuorovaikuttavat kaikkien nukleotidien osien kanssa (emäs-, fosfaatti- ja sokeriosan).33–35,41– 43 Kullekin metallille suosiollisin sitoutumiskohta riippuu useista tekijöistä, kuten metalli-ionin varauksesta, koosta, pKa:sta ja geometriasta. Metallien sitoutumista voidaan arvioida HSAB-teorian avulla (HSAB = engl. Hard and Soft Acid Base theory, teoria kovista ja pehmeistä hapoista ja emäksistä). Teorian mukaan metallit (Lewis hapot) ja ligandit (Lewis emäkset) ovat pehmeitä tai kovia riippuen niiden taipumuksesta muodostaa ionisidoksia (kovat) tai kovalenttisia sidoksia (pehmeät).44–46 Ligandilla tarkoitetaan keskusatomiin, yleensä metalliin, sitoutuneita ryhmiä. 1.4.2 Metallivälitteisessä pariutumisessa vetysidokset korvataan metallisidoksilla Metallivälitteisessä pariutumisessa emästen väliset vetysidokset N−H⋅⋅⋅O/N−C korvataan X−M−X koordinaatiosidoksilla (X= määrittelemätön atomi, M= metalli-ioni). Koordinaatiosidos on kovalenttisen sidoksen erikoismuoto, joka eroaa kovalenttisesta sidoksesta muun muassa jaettujen sidoselektronien alkuperän ja sidoksen rikkoutuessa syntyvien hajoamistuotteiden47 perusteella. Koordinaatiosidos voi olla sidosluonteeltaan hyvinkin kovalenttinen tai ioninen, riippuen vuorovaikutuksessa olevista atomeista48. Vetysidosten korvaaminen metallivälitteisillä koordinaatiosidoksilla nostaa emästen välistä sidosenergiaa ja saattaa johtaa kaksoiskierteen pysyvyyden merkittävään kasvuun.48–51 Koordinaatiosidokset muodostuvat pääosin pyrimidiinien N3- ja puriinien N1 ja N7-typpiatomien välille.52 Näillä tyypillisillä, endosyklisten typpiatomien välisillä koordinaatiosidoksilla, on kuitenkin yksi merkittävä rajoittava tekijä, nimittäin heikko pysyvyys laimeissa ja vähämetallisissa ympäristöissä kuten solun sisäisissä nesteissä.51 1.5 Metallivälitteisen emäspariutumisen rajoitteet terapeuttisissa ja diagnostisissa sovelluksissa Metallivälitteistä emäspariutumista on tutkittu laajalti muun muassa nanoteknologisissa sovelluksissa, metallisensoreina ja geneettisen koodiston laajentamisen näkökulmasta.37,38,53 Näissä sovelluksissa nukleiinihappojen muokkaukset on voitu tehdä yhtä lailla molempiin pariutumisessa osallisina oleviin emäksiin. Biologisesti merkittävien sekvenssien tunnistamiseen keskittyvät terapeuttiset ja diagnostiset sovellukset sen sijaan perustuvat keinotekoisen ja luonnollisen nukleiinihapon hybridisaatioon, jolloin mahdollisuutta muokata vastinjuostetta ei ole. Lisähaastetta tuo koordinaatiokompleksien dissosiaatioalttius fysiologisissa nesteissä.54 Nukleiinihapot poistuvat elimistöstä nopeasti: nukleotideja poistuu virtsan mukana, muokkaamattomien nukleiinihappojen puoliintumisaika plasmassa vaihtelee muutamasta minuutista muutamaan tuntiin55–59 ja solun sisällä ne pilkkoutuvat tehokkaasti nukleaasien toimesta60,61. Nukleiinihappojen nopea poistuminen tai hajoaminen elimistössä johtaa usein riittämättömiin farmakologisiin vaikutuksiin. Jotta riittävä vaste syntyy, nukleiinihappojen on säilytettävä toiminnallisuutensa siihen asti, että kontakti luonnollisen vastinjuosteen kanssa on mahdollinen.56,62,63 1.5.1 Metallien koordinaatiogeometria Metallivälitteisessä emäspariutumisessa, jossa vastinjuoste on luonnollinen nukleiinihappo, mahdollisten koordinaatiorakenteiden määrä on rajallinen. Lineaarinen, kolmikulmainen tasomainen tai kolmikulmainen pyramidi, nelikulmainen tasomainen ja oktaedri ovat koordinaatiorakenteita, jotka on onnistuttu liittämään nukleiinihappojen kaksoiskierteeseen.54,64–70 Vetysidoksilla on keskeinen, geometriaa säätelevä rooli nukleoemästen orientaatiossa: emästen on oltava tasomaisia, päällekkäisiä ja tietyssä kulmassa toisiinsa nähden, jotta emäspinoutuminen on mahdollista. Emäspinoutuminen on yksi tärkeimmistä kaksoiskierteen pysyvyyteen vaikuttavista tekijöistä. Kun vetysidokset korvataan metallisidoksilla, metallisidoksien koordinaatiorakenne on pääosin vastuussa emästen orientaatiosta. Optimaalinen metallien koordinaatiorakenne emäspariutumisessa joko jäljittelee vetysidosten geometriaa tai ylläpitää muutoin emästen suuntautumista toisiinsa nähden. Emästen orientaation ylläpitämisen lisäksi myös koko on rajoittava tekijä. Liikaa tilaa vievä koordinaatiorakenne saattaa muuttaa kaksoiskierteen mittasuhteita, jolla voi olla vaikutuksia kaksoiskierteen fysikokemiallisiin ominaisuuksiin ja mittasuhteiden vääristymä voi indusoida nukleiinihappoja korjaavia tai tuhoavia tekijöitä terapeuttisessa käytössä. Metallisidoksien tuoma sidosenergia kasvu ei yksinään riitä parantamaan kaksoiskierteen pysyvyyttä, jos kaksoiskierteen rakenteen muutos on epäsuotuisa51. Teoriassa nelikulmainen tasomainen koordinaatiorakenne on ainoa kaksoiskierteeseen soveltuva koordinaatiorakenne, joka lukitsisi molempien pariutuvien emästen orientaation tasomaiseksi, mikäli nukleotidianalogi ja vastinemäs sitoutuisivat keskusmetallin kaksihampaisesti (ligandi, joka sitoutuu keskusmetalliin kahdella eri sidoksella). Muut kaksoiskierteeseen soveltuvat koordinaatiorakenteet mahdollistavat yhden tai useamman koordinaatiosidoksen rotaation. Koordinaatiosidosten rotaatiota ja sitä kautta ligandien kiertymistä estäviä tekijöitä ovat myös ligandiin emästen kanssa samassa tasossa muodostuvat vetysidokset. 1.5.2 Organometallinen koordinaatiokompleksi Organometallisessa kompleksissa on vähintään yksi sidos, jossa hiili on sitoutunut atomiin, jonka elektronegatiivisuus on pienempi kuin hiilen. Elektronegatiivisuuseron takia sidos on polaarinen C- δ−M+δ. Sidoksen ioniluonne kasvaa elektronegatiivisuuseron mukana.46,71,72 Hiili muodostaa kuitenkin useiden metallien kanssa sidoksia, jotka ovat luonteeltaan kovalenttisia. Koordinaatiokomplekseihin verrattuna, jotka saavuttavat yleensä riittävän korkean affiniteetin vähämetallisissa ja laimeissa olosuhteissa vain kelatoitumisen (ligandi muodostaa enemmän kuin yhden sidoksen keskusmetallin kanssa) kautta, organometallikompleksien etu on, että jopa yksi hiili– metallisidos voi riittää tarpeeksi pysyvän kompleksin saavuttamiseksi. Tällöin metalli-ioni jää suurelta osin paljaaksi ja antaa näin enemmän vapautta lisävuorovaikutusten toteuttamiseen.51 1.5.3 Metallointi Nukleiinihappojen ja metalli-ionien väliset koordinaatiokompleksit saadaan kätevästi itsejärjestymisen kautta, edellyttäen, että nukleiinihapoilla on sopiva korkean affiniteetin sitoutumispaikka ja metalli-ionit riittävän labiileja kineettisesti. Tämä on toimiva tapa yksinkertaisissa tapauksissa ja lyhyillä nukleiinihapoilla.73–78 Monimutkaisemmissa ja oligonukelotidiketjun pituuden kasvaessa todennäköisyys odottamattomille koordinaatiosidoksille kuitenkin lisääntyy.51 Nukleiinihapon metallointi kovalenttisesti ”lukitsee” metallin valittuun kohtaan.79–83 Organometallisen koordinaatiokompleksin haasteita ovat sen sijaan valmistus ja puhdistus.51 Organometallisen koordinaatiokompleksin valmistamisessa on kolme lähestymistapaa. Ensimmäinen, ja teoriassa helpoin lähestymistapa on organometallisen kompleksin sisällyttäminen yhdeksi rakenneyksiköksi perinteiseen automaattisella syntetisaattorilla toteutettavaan fosforiamidiittikytkentään. Tämä on onnistunut vain muutamalla organometallisella koordinaatiokompleksilla, joissa keskusmetallien koordinaatioluku on ollut täynnä, kuten ferroseenilla84,85 ja tetra-alkyylitinalla86. Toinen vaihtoehto on post-synteettinen kovalenttinen metallaatio keinotekoisen nukleiinihapon kanssa, jossa on valmiina reaktiivinen kohta. Tämä lähestymistapa muistuttaa tyypillistä koordinaatiokompleksin valmistusta. Tällä lähestymistavalla on onnistuttu liittämään elohopeaioni Hg(II) kovalenttisesti siten, että reaktiiviseksi kohdaksi on riittänyt vain yksi elektronegatiivinen endosyklinen hiiliatomi87–91. Platinaryhmän metallien kovalenttinen liittäminen on vaatinut ohjaavan ligandin92–94. Haasteena on, että usein on käytettävä kymmenien ekvivalenttien ylimäärää metallisuoloja ja metalloidun nukleiinihapon puhdistaminen metallisuolasta ja reagoimattomista nukleiinihapoista vaatii useita kromatografisia puhdistuskertoja.51 Huomattavaa on myös, että elohopeaioni Hg(II) sitoutuu kovalenttisesti jo miedoissa olosuhteissa myös sytosiinin ja urasiilin C5- hiiliin.87 Tästä syystä keinotekoisen nukleiinihapon sytosiinit ja urasiilit on korvattu 5- metyylisytosiineilla ja tymiineillä, jotta merkurointi on saatu ohjattua haluttuun kohtaan. Lyhyillä nukleiinihapoilla selektiivinen merkurointi edellä mainituilla muokkauksilla on onnistunut.88,90,91,95– 98 Kolmantena vaihtoehtona on valmistaa koko nukleoemäs metallikomplekseineen erillään nukleiinihaposta. Nukleiinihappo muokataan siten, että halutusta reaktiokohdasta löytyy uniikki ”kahva”, jonka kanssa nukleoemäs muodostaa liitoksen esimerkiksi Michael-addition kautta.99–106 Tämän vaihtoehdon merkittävänä etuna on eri reaktio-olosuhteet nukleiinihapolle ja metalloidulle nukleoemäkselle sekä reaktiokohdan tarkka säätely. Haittapuolena on tilaa vievät liitoskohdat. 1.6 Metallin valinta metallivälitteiseen emäspariutumiseen biologisesti merkittävien sekvenssien tunnistamisessa Organometallisia, nukleiinihappoihin kovalenttisesti sitoutuneita metalli-ioneja ovat tähän mennessä koboltti107–110, rauta85, elohopea89, palladium79, platina111 ja tina86,112,113. Keinotekoisen nukleiinihapon käyttötarkoitus kuitenkin rajaa käytettävien metallien määrää. Biologisesti merkittävien sekvenssien tunnistamiseen tarkoitettujen korkea-affiniteettisten nukleiinihappojen sisältämien organometallisten koordinaatiokompleksien tulee olla vähintäänkin fysikokemiallisilta ominaisuuksiltaan pysyviä fysiologisissa nesteissä, kuten plasmassa ja solun sisäisissä nesteissä, koordinaatiokompleksi ei saa olla niin tilaa vievä että se vääristäisi kaksoiskierteen avaruudellisia mittasuhteita, sen tulee ylläpitää emästen tasomaista orientaatiota tukirankaan nähden sekä koordinaatiokompleksin sisältämän metalli-ionin tulee olla kykeneväinen pariutumaan (kineettisesti riittävän labiili), eli muodostamaan koordinaatiosidos vähintään yhden biologisesti esiintyvän nukleoemäksen kanssa. Turun Yliopiston bio-orgaaninen tutkimusryhmä on tällä hetkellä ainoa metallivälitteistä pariutumista edellä mainituilla kriteereillä tutkiva ryhmä. Tutkimusryhmän tutkimia metalli-ioneja ovat olleet Hg(II) ja Pd(II). Tutkimusryhmä on tutkinut kaikkien esiteltyjen nukleotidianalogien hybridisaatiota samalla 11 emäksen pituisella sekvenssillä (Kuva 3). Kuva 3. Turun Yliopiston bio-orgaanisen tutkimusryhmän käyttämä sekvenssi metallivälitteisen emäspariutumisen tutkimiseen ja sen komplementaarinen juoste. X = nukleotidianalogi, Y= adeniini, sytosiini, guaniini tai tymiini, M = kovalenttisesti nukleotidianalogiin sitoutunut metalli-ioni. *Elohopeavälitteisessä pariutumisessa keinotekoisen nukleiinihapon sytosiinit on korvattu 5-metyylisytosiinilla. 1.7 Palladium Palladium-ioni Pd(II) täyttää teoriassa edellisen kappaleen kriteerit. Pd(II)-ioni muodostaa koordinaatiogeometrialtaan pääosin nelikulmaisia tasomaisia koordinaatiorakenteita, jotka soveltuvat kaksoiskierteen sisälle niin emäspinoutumisen kuin mittasuhteidensa näkökulmasta, mikäli ligandit eivät ole liian tilaa vievät. 54,114 Pd(II)-ionin ja hiilen välinen sidos on luonteeltaan vahvasti kovalenttinen ja siten dissosiaatioalttius fysiologisissa nesteissä on vähäinen. Pd(II) on pehmeä metalli, ja sen affiniteetti nukleoemäksiin on korkea, joten koordinaatiosidoksen muodostuminen luonnollisen emäksen kanssa on todennäköinen.51,54 Organometallisen palladiumkompleksin valmistaminen onnistuu post-synteettisellä metalloinnilla. Ohjaavia ligandeja sisältävät aromaattiset rengasrakenteet osallistuvat syklopalladointiin miedoissa reaktio-olosuhteissa, joita nukleiinihapot kestävät.51,93,100 Kuva 4. Turun Yliopiston bio-orgaanisessa tutkimusryhmässä tutkitut organometalliset palladiumkompleksit.93,115 Palladiumvälitteinen metallipariutuminen ja sen tutkiminen on osoittautunut kuitenkin haasteellisiksi (kuva 4). Pd(II)-välitteisten emäsparien muutokset lämpötilan vaikutuksesta ovat monimutkaisia ja hitaita, mikä vaikuttaa sulamiskäyrien tulkintaan ja tekee UV-sulamislämpömittauksista vähemmän luotettavia.51 UV-sulamislämpömittaukset perustuvat nukleiinihappojen ”hengittämiseen”, eli kaksoiskierteiden aukeamiseen ja uudelleensulkeutumiseen. Luonnollisten nukleiinihappojen kaksoiskierteet avautuvat ja sulkeutuvat nopeasti (DNA:n ”hengittäminen”, kappale 1.1.1) ja yksivaiheisesti (kiinni− auki−kiinni) lämpötilan noustessa ja laskiessa. Pd(II)-välitteisen emäsparin sisältävät kaksoiskierteet aukeavat sen sijaan monivaiheisesti (esimerkiksi, kiinni−osittain auki−kokonaan auki−osittain kiinni−kiinni) ja usein kaksoiskierteen purkautumisen ja uudelleen sulkeutumisen välillä on havaittu hystereesiä, eli muutoksen hitautta ja kaksoiskierteen aukeamisen ja uudelleensulkeutumisen sulamiskäyrien merkittävää eroavuutta.93,116,117 UV- sulamislämpötilamittauksia on yritetty korvata FRET-analyyseillä117 (FRET = engl. fluorescent resonance energy transfer, fluoresenssi-resonanssi-energiansiirto) ja 15NMR spektroskopialla115 keskinkertaisin tuloksin.51 Tutkimusmetodien haasteiden lisäksi tutkittujen palladiumkompleksien havaittiin olevan kaksoiskierteiden päissä stabiloivia ja keskellä epästabiloivia. Tämä on tyypillistä koordinaatiokomplekseilla, jotka eivät täysin sovi geometrialtaan kaksoiskierteen sisään.118,119 Parhaimmillaan kaksoiskierteiden sulamislämmöt nousivat lähelle muokkaamattomia kaksoiskierteitä.51 1.8 Elohopea Elohopeaioni Hg(II) muodostaa pääosin koordinaatiokemialtaan lineaarisia koordinaatiorakenteita. Se on HSAB-teorian mukaan pehmeä metalli ja Pd(II):n tavoin sillä on korkea affiniteetti nukleoemäksiin ja se kykenee muodostamaan hiilen kanssa koordinaatiosidoksia, jotka ovat luonteeltaan vahvasti kovalenttisia. Keinotekoisten nukleiinihappojen metallointi onnistuu post- synteettisesti (kts. kappale 1.5.3). Ensimmäinen ja tutkituin metallivälitteinen emäspari oli Hg(II)-ionin vakauttama T:T väärinpariutuma, jossa Hg(II) muodosti metallisillan tymiinien N3-atomeihin, muodostaen N3−HgII−N3 koordinaatiokompleksin. Koordinaatiokompleksi nosti merkittävästi väärinpariutuman sisältävän kaksoiskierteen pysyvyyttä, sekä osoittautui mukailevan Watson-Crick-emäsparin mittasuhteita120–125. 1.8.1 5-merkurisytosiini Koska Hg(II) sitoutuu kovalenttisesti miedoissa olosuhteissa sytosiinien ja urasiilien C5-atomeihin87, 5-merkurisytosiini oli luonteva ensimmäinen ehdokas organometallisen metallivälitteisen emäspariutumisen tutkimiseen Turun Yliopiston bio-orgaanisessa tutkimusryhmässä. 5- merkurisytosiinissa kompleksoituva Hg(II)-ioni ei sijaitse emäksen Watson-Crick-laidalla, vaan emäspariutuminen edellyttää sytosiinin glykosidisidoksen C1’−N1 rotaatiota siten, että emäksen asento muuttuu anti-asennosta syn-asentoon (kuva 5).88 Anti-asennossa Watson-Crick laita on kohti vastakkaista emästä ja emäs on pääosin työntynyt kohti kaksoiskierteen keskustaa. Syn-asennossa Watson-Crick-laita on kohti tukirankaa. Luonnollisissa emäksissä anti- ja syn-asennot ovat matalaenergisimmät orientaatiot emäksille, anti-asennon ollessa kaikkien neljän emäksen kohdalla energeettisesti edullisin.5 Kuva 5. A) 5-merkurisytosiini B) Sytosiinin ja guaniinin muodostama Watson-Crick emäspari C) 5- merkurisytosiinin elohopeavälitteinen emäspari guaniinin kanssa. Täten tutkittavalla emäsanalogilla on ”kahdet kasvot” jotka olivat kykeneväisiä muodostamaan emäsparin. 5-merkurisytosiinin havaittiin pariutuvan vahvasti deprotonoituvien tymiinin ja guaniinin kanssa, kun taas adeniinin ja sytosiinin kanssa pariutuminen oli heikompaa kuin yhdenkään luonnollisen emäksen muodostaman väärinpariutuman. Hybridisaatiokoetimella, jonka pariutuminen perustuisi 5-merkurisytosiinin muodostamaan metallivälitteiseen emäspariin, kyettäisiin erottamaan UV-sulamislämpötilamittauksilla guaniini adeniinista ja sytosiini tymiinistä, mutta ei adeniinia sytosiinista. 1.8.2 3-fluori-2-merkuri-6-metyylianiliini Avaruudellisesta näkökulmasta isoin muutos sytosiinin ja 3-fluoro-2-merkuri-6-metyylianiliinin (kuva 6) välillä on varmasti okso-substituentin poistuminen para-asemasta merkuroituun kohtaan nähden. Kuva 6. A) 3-fluori-2-merkuri-6-metyylianiliini B) 3-fluori-2-merkuri-6-metyylianiliinin ehdotettu metallivälitteinen pariutuminen guaniinin kanssa. Pyrimidiiniemäksien suurempi taipumus anti-asentoon perustuu osin siihen, että syn-asennossa nimenomaan happi on epäsuotuisassa kontaktissa 5’-fosfaattiryhmän kanssa. Pyrimidiiniien ollessa syn-asennossa happiatomi on para-asemassa C5-hiileen (merkuroituvaan hiileen) nähden5. N- glykosidisidoksen vaihtaminen C-glykosidisidokseen vähentää glykosidisidoksen labiiliutta.126 Tymiinin rengasrakenteen vaihto aniliinin helpottaa substituenttien synteesiä ja niiden vaikutusten hallintaa merkurointia ohjaavina ryhminä (kuva 7). Kuva 7. Aromaattisen renkaan substituentilla (X) on usein vaikutusta, mihin asemaan (ortho, meta, para) elektrofiili Y substituoituu. 3-fluori-6-metyylianiliinissa on myös yksi merkittävä lisäys, nimittäin fluori C3-hiilessä. Deaktivoiva fluoriryhmä C3-hiilessä ja aktivoiva aminoryhmä C1-hiilessä vahvistavat toistensa ortho-ohjaavaa vaikutusta C2-hiilen merkurointiin (taulukko 1). Fluoriryhmä on pääasiassa para-asemaan ohjaava, mutta metyyliryhmä C6-hiilessä estää merkuroitumisen para-asemaan. Ohjaavan vaikutuksen lisäksi fluoriryhmä toimii myös leima-aineena 19F-NMR-spektroskopiassa. Fluorileima mahdollistaa metallivälitteisen pariutumisen sekundaarirakenteen ja atomitason seurannan aniliinissa, joka ei sisällä endosyklisiä, 15N-leimaukseen soveltuvia typpiatomeja. Taulukko 1. Eri substituenttien vaikutuksia aromaattisen renkaan elektrofiiliseen subsituutioon. Elektronegatiivinen vaikutus Ryhmä/yhdiste Aktivaatio Suunta elektronien luovutus konjugaation kautta aniliinin -NH2 vahvasti aktivoiva ortho, para elektronien luovutus induktiivisesti alkyyli aktivoiva ortho, para, vähäisemmässä määrin meta elektronien luovutus konjugaatiolla ja elektronien vetäminen induktiivisesti -F deaktivoiva para, vähäisemmässä määrin ortho elektronien vetäminen induktiivisesti -CF3 deaktivoiva meta elektronien luovutus konjugaation kautta -NR2 vahvasti aktivoiva ortho, para 3-fluori-2-merkuri-6-metyylianiliinin metallivälitteinen pariutuminen nosti kaksoiskierteiden sulamislämpötiloja kaikkien kanonisten vastinemästen kohdalla, erityisesti tymiinin, verrattuna merkuroitumattomaan nukleotidianalogiin. Guaniinin ja tymiinin kohdalla metallivälitteisen pariutumisen sulamislämpötilat olivat korkeammat kuin kanonisen Watson-Crick A-T parin. Sulamislämpötilat erottuivat toisistaan vähintään 6 celsiusasteella, mahdollistaen kanonisten emästen luotettavan erotuskyvyn UV-sulamislämpötilamittauksilla. Saadut sulamislämpötilat olivat suuruusjärjestyksessä A3.0.CO;2-U. (14) Desiraju, G. R. A Bond by Any Other Name. Angewandte Chemie - International Edition; 2011, 50 (1), 52- 59. https://doi.org/10.1002/anie.201002960. (15) Von Hippel, P. H.; Johnson, N. P.; Marcus, A. H. Fifty Years of DNA “Breathing”: Reflections on Old and New Approaches. Biopolymers; 2013, 99 (12), 923-954. https://doi.org/10.1002/bip.22347. (16) Seeman, N. C.; Rosenberg, J. M.; Suddath, F. L.; Kim, J. J. P.; Rich, A. RNA Double-Helical Fragments at Atomic Resolution: I. The Crystal and Molecular Structure of Sodium Adenylyl-3′,5′-Uridine Hexahydrate. Journal of Molecular Biology; 1976, 104 (1), 109-144. https://doi.org/10.1016/0022-2836(76)90005-X. (17) Travers, A.; Muskhelishvili, G. DNA Structure and Function. FEBS Journal; 2015, 282 (12), 2279-2295. https://doi.org/10.1111/febs.13307. (18) Rosenberg, J. M.; Seeman, N. C.; Day, R. O.; Rich, A. RNA Double-Helical Fragments at Atomic Resolution: II. The Crystal Structure of Sodium Guanylyl-3’,5’-Cytidine Nonahydrate; 1976, 104 (1), 145- 167. https://doi.org/10.1016/0022-2836(76)90006-1. (19) Marky, L. A.; Lee, H.; Garcia, A. Watson–Crick Base Pairs and Nucleic Acids Stability. Encyclopedia of Life Sciences; John Wiley & Sons, 2010. https://doi.org/10.1002/9780470015902.a0003126.pub2. (20) Rajski, S. R.; Jackson, B. A.; Barton, J. K. DNA Repair: Models for Damage and Mismatch Recognition. Mutation Research - Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis; 2000, 447 (1), 49-72. https://doi.org/10.1016/S0027-5107(99)00195-5. (21) Jaciuk, M.; Nowak, E.; Skowronek, K.; Tañska, A.; Nowotny, M. Structure of UvrA Nucleotide Excision Repair Protein in Complex with Modified DNA. Nature Structural & Molecular Biology; 2011, 18 (2), 191- 197. https://doi.org/10.1038/nsmb.1973. (22) Jain, V.; Hilton, B.; Lin, B.; Patnaik, S.; Liang, F.; Darian, E.; Zou, Y.; MacKerell, A. D.; Cho, B. P. Unusual Sequence Effects on Nucleotide Excision Repair of Arylamine Lesions: DNA Bending/Distortion as a Primary Recognition Factor. Nucleic Acids Research; 2013, 41 (2), 869-880. https://doi.org/10.1093/nar/gks1077. (23) Roos, W. P.; Kaina, B. DNA Damage-Induced Cell Death by Apoptosis. Trends in Molecular Medicine; 2006, 12 (9), 440-450. https://doi.org/10.1016/j.molmed.2006.07.007. (24) Norbury, C. J.; Zhivotovsky, B. DNA Damage-Induced Apoptosis. Oncogene; 2004, 23 (16), 2797-2808. https://doi.org/10.1038/sj.onc.1207532. (25) Leontis, N. B.; Stombaugh, J.; Westhof, E. The Non-Watson-Crick Base Pairs and Their Associated Isostericity Matrices. Nucleic Acids Research; 2002, 30 (16), 3497-3531. https://doi.org/10.1093/nar/gkf481. (26) Nikolova, E. N.; Kim, E.; Wise, A. A.; O’Brien, P. J.; Andricioaei, I.; Al-Hashimi, H. M. Transient Hoogsteen Base Pairs in Canonical Duplex DNA. Nature; 2011, 470 (7335), 498-502. https://doi.org/10.1038/nature09775. (27) Varani, G.; McClain, W. H. The G·U Wobble Base Pair. EMBO Reports; 2000, 1 (1), 18–23. https://doi.org/10.1093/embo-reports/kvd001. (28) Šponer, J. E.; Špačková, N. D. A.; Leszczynski, J.; Šponer, J. Principles of RNA Base Pairing: Structures and Energies of the Trans Watson-Crick/ Sugar Edge Base Pairs. Journal of Physical Chemistry B; 2005, 109 (22), 11399-11410. https://doi.org/10.1021/jp051126r. (29) Varshney, D.; Spiegel, J.; Zyner, K.; Tannahill, D.; Balasubramanian, S. The Regulation and Functions of DNA and RNA G-Quadruplexes. Nature Reviews Molecular Cell Biology; 2020, 21 (8), 459-474. https://doi.org/10.1038/s41580-020-0236-x. (30) Balasubramanian, S.; Neidle, S. G-Quadruplex Nucleic Acids as Therapeutic Targets. Current Opinion in Chemical Biology; 2009, 13 (3), 345–353. https://doi.org/10.1016/j.cbpa.2009.04.637. (31) Nikolova, E. N.; Zhou, H.; Gottardo, F. L.; Alvey, H. S.; Kimsey, I. J.; Al-Hashimi, H. M. A Historical Account of Hoogsteen Base-Pairs in Duplex DNA. Biopolymers; 2013, 99 (12), 955-968. https://doi.org/10.1002/bip.22334. (32) Takahashi, S.; Sugimoto, N. Watson-Crick versus Hoogsteen Base Pairs: Chemical Strategy to Encode and Express Genetic Information in Life. Accounts of Chemical Research; 2021, 54 (9), 2110-2120. https://doi.org/10.1021/acs.accounts.0c00734. (33) Zhou, W.; Saran, R.; Liu, J. Metal Sensing by DNA. Chemical Reviews; 2017, 117 (12), 8272-8325. https://doi.org/10.1021/acs.chemrev.7b00063. (34) Sigel, H. Interactions of Metal Ions with Nucleotides and Nucleic Acids and Their Constituents. Chemical Society Reviews; 1993, 22 (4), 255-267. https://doi.org/10.1039/CS9932200255. (35) Müller, J. Functional Metal Ions in Nucleic Acids. Metallomics; 2010, 2 (5), 318-327. https://doi.org/10.1039/c000429d. (36) Hadjiliadis, N.; Sletten, E. Metal Complex-DNA Interactions; John Wiley & Sons, 2009. https://doi.org/10.1002/9781444312089. (37) Naskar, S.; Guha, R.; Müller, J. Metal-Modified Nucleic Acids: Metal-Mediated Base Pairs, Triples, and Tetrads. Angewandte Chemie - International Edition; 2020, 59 (4), 1397–1406. https://doi.org/10.1002/anie.201905913. (38) Jash, B.; Müller, J. Metal-Mediated Base Pairs: From Characterization to Application. Chemistry - A European Journal; 2017, 23 (68), 17166–17178. https://doi.org/10.1002/chem.201703518. (39) Müller, J.; Lippert, B. Modern Avenues in Metal-Nucleic Acid Chemistry; CRC Press, 2023. https://doi.org/10.1201/9781003270201. (40) Lobinski, R.; Becker, J. S.; Haraguchi, H.; Sarkar, B. Metallomics: Guidelines for Terminology and Critical Evaluation of Analytical Chemistry Approaches (IUPAC Technical Report). Pure and Applied Chemistry; 2010, 82 (2), 493-504. https://doi.org/10.1351/PAC-REP-09-03-04. (41) Ono, A.; Torigoe, H.; Tanaka, Y.; Okamoto, I. Binding of Metal Ions by Pyrimidine Base Pairs in DNA Duplexes. Chemical Society Reviews; 2011, 40 (12), 5855-5866. https://doi.org/10.1039/c1cs15149e. (42) Kazakov, S. A.; Hecht, S. M. Nucleic Acid–Metal Ion Interactions. Encyclopedia of Inorganic and Bioinorganic Chemistry; John Wiley & Sons, 2005. https://doi.org/10.1002/9781119951438.eibc0152. (43) Martin, R. B. Nucleoside Sites for Transition Metal Ion Binding. Accounts of Chemical Research; 1985, 18 (2), 32-28. https://doi.org/10.1021/ar00110a001. (44) Pearson, R. G. Hard and Soft Acids and Bases. Journal of the American Chemical Society; 1963, 85 (22), 3533-3539. https://doi.org/10.1021/ja00905a001. (45) Jensen, W. B. The Lewis Acid-Base Definitions: A Status Report. Chemical Reviews; 1978, 78 (1), 1-22. https://doi.org/10.1021/cr60311a002. (46) Crabtree, R. H. The Organometallic Chemistry of the Transition Metals; John Wiley & Sons, 2009. (47) Haaland, A. Covalent versus Dative Bonds to Main Group Metals, a Useful Distinction. Angewandte Chemie International Edition in English; 1989, 28 (8), 992-1007. https://doi.org/10.1002/anie.198909921. (48) Nimmermark, A.; Öhrström, L.; Reedijk, J. Metal-Ligand Bond Lengths and Strengths: Are They Correlated? A Detailed CSD Analysis. Zeitschrift fur Kristallographie; 2013, 228, 311-317. https://doi.org/10.1524/zkri.2013.1605. (49) Ghosh, S.; Defrancq, E. Metal-Complex/DNA Conjugates: A Versatile Building Block for DNA Nanoarrays. Chemistry - A European Journal; 2010, 16 (43), 12780-12787. https://doi.org/10.1002/chem.201001590. (50) Rodgers, M. T.; Armentrout, P. B. Noncovalent Metal-Ligand Bond Energies AS Studied by Threshold Collision-Induced Dissociation. Mass Spectrometry Reviews; 2000, 19 (4), 215-247. https://doi.org/10.1002/1098-2787(200007)19:4<215::AID-MAS2>3.0.CO;2-X. (51) Kotammagari, T. K.; Saleh, L. Y.; Lönnberg, T. Organometallic Modification Confers Oligonucleotides New Functionalities. Chemical Communications; 2024, 60 (23), 3118-3128. https://doi.org/10.1039/d4cc00305e. (52) Kim, S. H.; Martin, R. B. Binding Sites and Stabilities of Transition Metal Ions with Nucleosides and Related Ligands. Inorganica Chimica Acta; 1984, 91 (1), 19-24. https://doi.org/10.1016/S0020- 1693(00)84213-9. (53) Takezawa, Y.; Shionoya, M. Metal-Mediated DNA Base Pairing: Alternatives to Hydrogen-Bonded Watson- Crick Base Pairs. Accounts of Chemical Research; 2012, 45 (12), 2066-2076. https://doi.org/10.1021/ar200313h. (54) Taherpour, S.; Golubev, O.; Lönnberg, T. Inorganica Chimica Acta On the Feasibility of Recognition of Nucleic Acid Sequences by Metal-Ion-Carrying Oligonucleotides. Inorganica Chimica Acta; 2016, 452, 43– 49. https://doi.org/10.1016/j.ica.2016.01.025. (55) He, C.; Yue, H.; Xu, L.; Liu, Y.; Song, Y.; Tang, C.; Yin, C. SiRNA Release Kinetics from Polymeric Nanoparticles Correlate with RNAi Efficiency and Inflammation Therapy via Oral Delivery. Acta Biomaterialia; 2020, 103, 213-222. https://doi.org/10.1016/j.actbio.2019.12.005. (56) Larcher, L. M.; Pitout, I. L.; Keegan, N. P.; Veedu, R. N.; Fletcher, S. DNAzymes: Expanding the Potential of Nucleic Acid Therapeutics. Nucleic Acid Therapeutics; 2023, 33(3), 178-192. https://doi.org/10.1089/nat.2022.0066. (57) Behlke, M. A. Progress towards in Vivo Use of SiRNAs. Molecular Therapy; 2006, 13(4), 644-670. https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2006.01.001. (58) Yang, E.; van Nimwegen, E.; Zavolan, M.; Rajewsky, N.; Schroeder, M.; Magnasco, M.; Darnell, J. E. Decay Rates of Human MRNAs: Correlation with Functional Characteristics and Sequence Attributes. Genome Research; 2003, 13 (8), 1863-1872. https://doi.org/10.1101/gr.1272403. (59) Bäckström, E.; Bonetti, A.; Johnsson, P.; Öhlin, S.; Dahlén, A.; Andersson, P.; Andersson, S.; Gennemark, P. Tissue Pharmacokinetics of Antisense Oligonucleotides. Molecular Therapy Nucleic Acids; 2024, 35 (1), 1-13. https://doi.org/10.1016/j.omtn.2024.102133. (60) Bost, J. P.; Barriga, H.; Holme, M. N.; Gallud, A.; Maugeri, M.; Gupta, D.; Lehto, T.; Valadi, H.; Esbjörner, E. K.; Stevens, M. M.; El-Andaloussi, S. Delivery of Oligonucleotide Therapeutics: Chemical Modifications, Lipid Nanoparticles, and Extracellular Vesicles. ACS Nano; 2021, 15 (9), 13993-14021. https://doi.org/10.1021/acsnano.1c05099. (61) Gagliardi, M.; Ashizawa, A. T. The Challenges and Strategies of Antisense Oligonucleotide Drug Delivery. Biomedicines; 2021, 9 (4), 433. https://doi.org/10.3390/biomedicines9040433. (62) Guo, P.; Coban, O.; Snead, N. M.; Trebley, J.; Hoeprich, S.; Guo, S.; Shu, Y. Engineering Rna for Targeted Sirna Delivery and Medical Application. Advanced Drug Delivery Reviews; 2010, 62 (6), 650-666. https://doi.org/10.1016/j.addr.2010.03.008. (63) Miteva, M.; Kirkbride, K. C.; Kilchrist, K. V.; Werfel, T. A.; Li, H.; Nelson, C. E.; Gupta, M. K.; Giorgio, T. D.; Duvall, C. L. Tuning PEGylation of Mixed Micelles to Overcome Intracellular and Systemic SiRNA Delivery Barriers. Biomaterials; 2015, 38, 97-107. https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2014.10.036. (64) Switzer, C.; Shin, D. A Pyrimidine-like Nickel(II) DNA Base Pair. Chemical Communications; 2005, 10, 1342-1344. https://doi.org/10.1039/b415426f. (65) Heuberger, B. D.; Shin, D.; Switzer, C. Two Watson-Crick-like Metallo Base-Pairs. Organic Letters; 2008, 10 (6), 1091-1094. https://doi.org/10.1021/ol703029d. (66) Meggers, E.; Holland, P. L.; Tolman, W. B.; Romesberg, F. E.; Schultz, P. G. A Novel Copper-Mediated DNA Base Pair [6]. Journal of the American Chemical Society; 2000, 122 (43), 10714-10715. https://doi.org/10.1021/ja0025806. (67) Tanaka, K.; Tengeiji, A.; Kato, T.; Toyama, N.; Shiro, M.; Shionoya, M. Efficient Incorporation of a Copper Hydroxypyridone Base Pair in DNA. Journal of the American Chemical Society; 2002, 124 (42), 12494- 12498. https://doi.org/10.1021/ja027175o. (68) Richters, T.; Krug, O.; Kösters, J.; Hepp, A.; Müller, J. A Family of “Click” Nucleosides for Metal-Mediated Base Pairing: Unravelling the Principles of Highly Stabilizing Metal-Mediated Base Pairs. Chemistry - A European Journal; 2014, 20 (25), 7811-7818. https://doi.org/10.1002/chem.201402221. (69) Richters, T.; Müller, J. A Metal-Mediated Base Pair with a [2+1] Coordination Environment. European Journal of Inorganic Chemistry; 2014, 2014 (3), 437-441 . https://doi.org/10.1002/ejic.201301491. (70) Hensel, S.; Megger, N.; Schweizer, K.; Müller, J. Second Generation Silver(I)-Mediated Imidazole Base Pairs. Beilstein Journal of Organic Chemistry; 2014, 10 (1), 2139-2144. https://doi.org/10.3762/bjoc.10.221. (71) Mehrotra, R. C. Organometallic Chemistry; New Age International, 2007. (72) Bhatt, V. Essentials of Coordination Chemistry: A Simplified Approach with 3D Visuals; Academic Press, 2015. (73) Clever, G. H.; Carell, T. Controlled Stacking of 10 Transition-Metal Ions inside a DNA Duplex. Angewandte Chemie - International Edition; 2007, 46 (1–2), 250-253. https://doi.org/10.1002/anie.200603099. (74) Kondo, J.; Tada, Y.; Dairaku, T.; Hattori, Y.; Saneyoshi, H.; Ono, A.; Tanaka, Y. A Metallo-DNA Nanowire with Uninterrupted One-Dimensional Silver Array. Nature Chemistry; 2017, 9 (10), 956-960. https://doi.org/10.1038/nchem.2808. (75) Ono, A.; Kanazawa, H.; Ito, H.; Goto, M.; Nakamura, K.; Saneyoshi, H.; Kondo, J. A Novel DNA Helical Wire Containing HgII-Mediated T:T and T:G Pairs. Angewandte Chemie - International Edition; 2019, 58 (47), 16991-16994. https://doi.org/10.1002/anie.201910029. (76) Liu, Y.; Liu, G.; Hnatowich, D. J. A Brief Review of Chelators for Radiolabeling Oligomers. Materials; 2010, 3 (5), 3204-3217. https://doi.org/10.3390/ma3053204. (77) Lesnikowski, Z. DNA as Platform for New Biomaterials. Metal-Containing Nucleic Acids. Current Organic Chemistry; 2007, 11 (4), 355-381. https://doi.org/10.2174/138527207780059358. (78) Zhou, W.; Liu, J. Multi-Metal-Dependent Nucleic Acid Enzymes. Metallomics; 2018, 10 (1), 30-48. https://doi.org/10.1039/c7mt00268h. (79) Ukale, D.; Maity, S.; Hande, M.; Lönnberg, T. Synthesis and Hybridization Properties of Covalently Mercurated and Palladated Oligonucleotides. Synlett; 2019, 30 (15), 1733-1737. https://doi.org/10.1055/s- 0037-1611821. (80) Duprey, J. H. A.; Tucker, J. H. R. ChemInform Abstract: Metal—Carbon Bonds in Biopolymer Conjugates: Bioorganometallic Nucleic Acid Chemistry. ChemInform; 2014, 45 (24), 157-163. https://doi.org/10.1002/chin.201424282. (81) Collado, A.; Gómez-Gallego, M.; Sierra, M. A. Nucleobases Having M–C Bonds: An Emerging Bio- Organometallic Field. European Journal of Organic Chemistry; 2018, 2018 (14), 1617-1623. https://doi.org/10.1002/ejoc.201800135. (82) Kowalski, K. Organometallic Nucleosides—Synthesis, Transformations, and Applications. Coordination Chemistry Reviews; 2021, 432, 213705. https://doi.org/10.1016/j.ccr.2020.213705. (83) Lönnberg, T. Metals in Genotyping. Modern Avenues in Metal-Nucleic Acid Chemistry; 2023. https://doi.org/10.1201/9781003270201-9. (84) Mucic, R. C.; Herrlein, M. K.; Mirkin, C. A.; Letsinger, R. L. Synthesis and Characterization of DNA with Ferrocenyl Groups Attached to Their 5′-Termini: Electrochemical Characterization of a Redox-Active Nucleotide Monolayer. Chemical Communications; 1996, 4, 555-557. https://doi.org/10.1039/CC9960000555. (85) Zatsepin, T. S.; Andreev, S. Y.; Hianik, T.; Oretskaya, T. S. Ferrocene-Containing Nucleic Acids. Synthesis and Electrochemical Properties. Russian Chemical Reviews; 2003, 72 (6), 537-554. https://doi.org/10.1070/rc2003v072n06abeh000807. (86) Dougan, H.; Hobbs, J. B.; Weitz, J. I.; Lyster, D. M. Synthesis and Radioiodination of a Stannyl Oligodeoxyribonucleotide. Nucleic Acids Research; 1997, 25 (14), 2897-2901. https://doi.org/10.1093/nar/25.14.2897. (87) Dale, R. M. K.; Martin, E.; Livingston, D. C.; Ward, D. C. Direct Covalent Mercuration of Nucleotides and Polynucleotides. Biochemistry; 1975, 14 (11), 2447-2457. https://doi.org/10.1021/bi00682a027. (88) Ukale, D.; Shinde, V. S.; Lönnberg, T. 5-Mercuricytosine : An Organometallic Janus Nucleobase. Chemistry-A European Journal; 2016, 22 (23) 7917–7923. https://doi.org/10.1002/chem.201600851. (89) Ukale, D.; Lönnberg, T. Organomercury Nucleic Acids: Past, Present and Future. ChemBioChem; 2021, 22 (10), 1733-1739. https://doi.org/10.1002/cbic.202000821. (90) Aro-Heinilä, A.; Lönnberg, T.; Virta, P. 3-Fluoro-2-Mercuri-6-Methylaniline Nucleotide as a High-Affinity Nucleobase-Specific Hybridization Probe. Bioconjugate Chemistry; 2019, 30 (8), 2183–2190. https://doi.org/10.1021/acs.bioconjchem.9b00405. (91) Aro-Heinilä, A.; Lepistö, A.; Äärelä, A.; Lönnberg, T. A.; Virta, P. 2-Trifluoromethyl-6-Mercurianiline Nucleotide, a Sensitive 19F NMR Probe for Hg(II)-Mediated Base Pairing. Journal of Organic Chemistry; 2022, 87 (1), 137-146. https://doi.org/10.1021/acs.joc.1c02056. (92) Martín-Ortíz, M.; Gõmez-Gallego, M.; Ramírez De Arellano, C.; Sierra, M. A. The Selective Synthesis of Metallanucleosides and Metallanucleotides: A New Tool for the Functionalization of Nucleic Acids. Chemistry - A European Journal; 2012, 18 (40), 12603-12608. https://doi.org/10.1002/chem.201202327. (93) Maity, S. K.; Lönnberg, T. Oligonucleotides Incorporating Palladacyclic Nucleobase Surrogates. Chemistry - A European Journal 2018, 24 (6), 1274-1277. https://doi.org/10.1002/chem.201705797. (94) Cope, A. C.; Siekman, R. W. Formation of Covalent Bonds from Platinum or Palladium to Carbon by Direct Substitution. Journal of The American Chemical Society; 1965, 87 (14), 3272-3273. https://doi.org/10.1021/ja01092a063. (95) Ukale, D. U.; Lönnberg, T. 2,6-Dimercuriphenol as a Bifacial Dinuclear Organometallic Nucleobase. Angewandte Chemie - International Edition 2018, 57 (49), 16171-16175. https://doi.org/10.1002/anie.201809398. (96) Aro-Heinilä, A.; Lönnberg, T.; Virta, P. Covalently Mercurated Molecular Beacon for Discriminating the Canonical Nucleobases. ChemBioChem 2021, 22 (2), 354-358. https://doi.org/10.1002/cbic.202000575. (97) Kotammagari, T. K.; Tähtinen, P.; Lönnberg, T. Oligonucleotides Featuring a Covalently Mercurated 6- Phenylcarbazole Residue as High-Affinity Hybridization Probes for Thiopyrimidine-Containing Sequences. Chemistry - A European Journal 2022, 28 (69), e202202530. https://doi.org/10.1002/chem.202202530. (98) Ukale, D. U.; Tähtinen, P.; Lönnberg, T. 1,8-Dimercuri-6-Phenyl-1H-Carbazole as a Monofacial Dinuclear Organometallic Nucleobase. Chemistry - A European Journal 2020, 26 (10), 2164-2168. https://doi.org/10.1002/chem.201905434. (99) Moreau, J.; Dendane, N.; Schöllhorn, B.; Spinelli, N.; Fave, C.; Defrancq, E. Synthesis and Characterization of Oligonucleotide Conjugates Bearing Electroactive Labels. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters; 2013, 23 (4), 955-958. https://doi.org/10.1016/j.bmcl.2012.12.057. (100) Maity, S. K.; Lönnberg, T. A. Synthesis of Organometallic Oligonucleotides through Oximation with Metalated Benzaldehydes. ACS Omega 2019, 4 (20), 18803-18808. https://doi.org/10.1021/acsomega.9b02804. (101) Ge, D.; Levicky, R. A Comparison of Five Bioconjugatable Ferrocenes for Labeling of Biomolecules. Chemical Communications 2010, 46 (38), 7190-7192. https://doi.org/10.1039/c0cc02044c. (102) Ferapontova, E. E.; Olsen, E. M.; Gothelf, K. V. An RNA Aptamer-Based Electrochemical Biosensor for Detection of Theophylline in Serum. Journal of the American Chemical Society; 2008, 130 (13), 4256-4258. https://doi.org/10.1021/ja711326b. (103) Anne, A.; Bouchardon, A.; Moiroux, J. 3′-Ferrocene-Labeled Oligonucleotide Chains End-Tethered to Gold Electrode Surfaces: Novel Model Systems for Exploring Flexibility of Short DNA Using Cyclic Voltammetry. Journal of the American Chemical Society; 2003, 125 (5), 1112-1113. https://doi.org/10.1021/ja028640k. (104) Anne, A.; Demaille, C. Dynamics of Electron Transport by Elastic Bending of Short DNA Duplexes. Experimental Study and Quantitative Modeling of the Cyclic Voltammetric Behavior of 3′-Ferrocenyl DNA End-Grafted on Gold. Journal of the American Chemical Society; 2006, 128 (2), 542-557. https://doi.org/10.1021/ja055112a. (105) Hillier, S. C.; Frost, C. G.; Jenkins, A. T. A.; Braven, H. T.; Keay, R. W.; Flower, S. E.; Clarkson, J. M. An Electrochemical Study of Enzymatic Oligonucleotide Digestion. Bioelectrochemistry; 2004; 63 (1-2), 307- 310. https://doi.org/10.1016/j.bioelechem.2003.10.028. (106) Takenaka, S.; Uto, Y.; Kondo, H.; Ihara, T.; Takagi, M. Electrochemically Active DNA Probes: Detection of Target DNA Sequences at Femtomole Level by High-Performance Liquid Chromatography with Electrochemical Detection. Analytical Biochemistry; 1994, 218 (2), 436-443. https://doi.org/10.1006/abio.1994.1203. (107) Olejniczak, A. B.; Plešek, J.; Křiž, O.; Lesnikowski, Z. J. A Nucleoside Conjugate Containing a Metallacarborane Group and Its Incorporation into a DNA Oligonucleotide. Angewandte Chemie - International Edition 2003, 42 (46), 5918-5921. https://doi.org/10.1002/anie.200352505. (108) Olejniczak, A. B.; Kierzek, R.; Wickstrom, E.; Lesnikowski, Z. J. Synthesis, Physicochemical and Biochemical Studies of Anti-IRS-1 Oligonucleotides Containing Carborane and/or Metallacarborane Modification. Journal of Organometallic Chemistry; 2013, 747, 201-210. https://doi.org/10.1016/j.jorganchem.2013.05.022. (109) Hunger, M.; Mutti, E.; Rieder, A.; Enders, B.; Nexo, E.; Kräutler, B. Organometallic B12-DNA Conjugate: Synthesis, Structure Analysis, and Studies of Binding to Human B12-Transporter Proteins. Chemistry - A European Journal 2014, 20 (41), 13103-13107. https://doi.org/10.1002/chem.201404359. (110) Mutti, E.; Hunger, M.; Fedosov, S.; Nexo, E.; Kräutler, B. Organometallic DNA–B12 Conjugates as Potential Oligonucleotide Vectors: Synthesis and Structural and Binding Studies with Human Cobalamin- Transport Proteins. ChemBioChem 2017, 18 (22), 2280-2291. https://doi.org/10.1002/cbic.201700472. (111) Boisten, F.; Maisuls, I.; Schäfer, T.; Strassert, C. A.; Müller, J. Site-Specific Covalent Metalation of DNA Oligonucleotides with Phosphorescent Platinum(Ii) Complexes. Chemical Science; 2023, 14 (9), 2399-2404. https://doi.org/10.1039/d2sc05916a. (112) Ortiz, M.; Debela, A. M.; Svobodova, M.; Thorimbert, S.; Lesage, D.; Cole, R. B.; Hasenknopf, B.; O’Sullivan, C. K. PCR Incorporation of Polyoxometalate Modified Deoxynucleotide Triphosphates and Their Application in Molecular Electrochemical Sensing of Yersinia Pestis. Chemistry - A European Journal 2017, 23 (44), 10597-10603. https://doi.org/10.1002/chem.201701295. (113) Debela, A. M.; Ortiz, M.; Beni, V.; Thorimbert, S.; Lesage, D.; Cole, R. B.; O’Sullivan, C. K.; Hasenknopf, B. Biofunctionalization of Polyoxometalates with DNA Primers, Their Use in the Polymerase Chain Reaction (PCR) and Electrochemical Detection of PCR Products. Chemistry - A European Journal 2015, 21 (49), 17721-17727. https://doi.org/10.1002/chem.201502247. (114) Müller, J.; Freisinger, E.; Lax, P.; Megger, D. A.; Polonius, F. A. Interaction of Pt(II) and Pd(II) Complexes of Terpyridine with 1-Methylazoles: A Combined Experimental and Density Functional Study. Inorganica Chimica Acta; 2007, 360 (1), 255-263. https://doi.org/10.1016/j.ica.2006.07.031. (115) Toiviala, M.; Kleemola, V.; Maity, S.; Lönnberg, T. Still Elusive – Pd(II)-Mediated Base Pairing by an Acetophenone Oxime Palladacycle within 15N-Labelled Double-Helical Oligonucleotides. European Journal of Organic Chemistry; 2023, 26 (10), e202201443. https://doi.org/10.1002/ejoc.202201443. (116) Räisälä, H.; Lönnberg, T. Covalently Palladated Oligonucleotides Through Oxidative Addition of Pd 0. Chemistry - A European Journal 2019, 25 (18), 4751-4756. https://doi.org/10.1002/chem.201806022. (117) Hande, M.; Maity, S.; Lönnberg, T. Sequence Dependence of Pd(II)-Mediated Base Pairing by Palladacyclic Nucleobase Surrogates. Journal of Inorganic Biochemistry; 2021, 222, 111506. https://doi.org/10.1016/j.jinorgbio.2021.111506. (118) Golubev, O.; Turc, G.; Lönnberg, T. Pd2 +-Mediated Base Pairing in Oligonucleotides. Journal of Inorganic Biochemistry; 2016, 155, 36-43. https://doi.org/10.1016/j.jinorgbio.2015.11.008. (119) Taherpour, S.; Lönnberg, H.; Lönnberg, T. 2,6-Bis(Functionalized) Purines as Metal-Ion-Binding Surrogate Nucleobases That Enhance Hybridization with Unmodified 2′-O-Methyl Oligoribonucleotides. Organic & Biomolecular Chemistry; 2013, 11 (6), 991-1000. https://doi.org/10.1039/c2ob26885j. (120) Miyake, Y.; Togashi, H.; Tashiro, M.; Yamaguchi, H.; Oda, S.; Kudo, M.; Tanaka, Y.; Kondo, Y.; Sawa, R.; Fujimoto, T.; Machinami, T.; Ono, A. MercuryII-Mediated Formation of Thymine-HgII-Thymine Base Pairs in DNA Duplexes. Journal of the American Chemical Society; 2006, 128 (7), 2172-2173. https://doi.org/10.1021/ja056354d. (121) Katz, S. The Reversible Reaction of Hg (II) and Double-Stranded Polynucleotides a Step-Function Theory and Its Significance. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Specialized Section on Nucleic Acids and Related Subjects; 1963, 68, 240-253. https://doi.org/10.1016/0926-6550(63)90435-3. (122) Tanaka, Y.; Oda, S.; Yamaguchi, H.; Kondo, Y.; Kojima, C.; Ono, A. 15N-15N J-Coupling across HgII: Direct Observation of HgII-Mediated T-T Base Pairs in a DNA Duplex. Journal of the American Chemical Society; 2007, 129 (2), 244-245. https://doi.org/10.1021/ja065552h. (123) Šebera, J.; Burda, J.; Straka, M.; Ono, A.; Kojima, C.; Tanaka, Y.; Sychrovský, V. Formation of a Thymine- HgII-Thymine Metal-Mediated DNA Base Pair: Proposal and Theoretical Calculation of the Reaction Pathway. Chemistry - A European Journal 2013, 19 (30), 9884-9894. https://doi.org/10.1002/chem.201300460. (124) Kondo, J.; Yamada, T.; Hirose, C.; Okamoto, I.; Tanaka, Y.; Ono, A. Crystal Structure of Metallo DNA Duplex Containing Consecutive Watson-Crick-like T-HgII-T Base Pairs. Angewandte Chemie - International Edition 2014, 53 (9), 2385-2388. https://doi.org/10.1002/anie.201309066. (125) Yamaguchi, H.; Šebera, J.; Kondo, J.; Oda, S.; Komuro, T.; Kawamura, T.; Dairaku, T.; Kondo, Y.; Okamoto, I.; Ono, A.; Burda, J. V.; Kojima, C.; Sychrovský, V.; Tanaka, Y. The Structure of Metallo-DNA with Consecutive Thymine-Hg II-Thymine Base Pairs Explains Positive Entropy for the Metallo Base Pair Formation. Nucleic Acids Research; 2014, 42 (6), 4094-4099. https://doi.org/10.1093/nar/gkt1344. (126) Nicotra, F. Synthesis of C-Glycosides of Biological Interest. Synthesis of Substrate Analogs and Mimetics; 1997, 55-83. https://doi.org/10.1007/bfb0119253. (127) Tyagi, S.; Kramer, F. R. Molecular Beacons: Probes That Fluoresce Upon Hybridization. Nature biotechnology; 1996, 14 (3), 303-308. https://doi.org/10.1038/nbt0396-303. (128) Zheng, C.; Black, K. A.; Dos Santos, P. C. Diverse Mechanisms of Sulfur Decoration in Bacterial Trna and Their Cellular Functions. Biomolecules. 2017, 7 (1), 33. https://doi.org/10.3390/biom7010033. (129) Shigi, N. Biosynthesis and Functions of Sulfur Modifications in TRNA. Frontiers in Genetics. 2014, 5, 81975. https://doi.org/10.3389/fgene.2014.00067. (130) McKenney, K. M.; Alfonzo, J. D. From Prebiotics to Probiotics: The Evolution and Functions of TRNA Modifications. Life. 2016, 6 (1), 13. https://doi.org/10.3390/life6010013. (131) Jäger, G.; Leipuviene, R.; Pollard, M. G.; Qian, Q.; Björk, G. R. The Conserved Cys-X1-X2-Cys Motif Present in the TtcA Protein Is Required for the Thiolation of Cytidine in Position 32 of TRNA from Salmonella Enterica Serovar Typhimurium. Journal of bacteriology; 2004, 186 (3), 750-757. https://doi.org/10.1128/JB.186.3.750-757.2004. (132) Agris, P. F. Wobble Position Modified Nucleosides Evolved to Select Transfer RNA Codon Recognition: A Modified-Wobble Hypothesis. Biochimie; 1991, 73 (11), 1345-1349. https://doi.org/10.1016/0300- 9084(91)90163-U. (133) Urbonavičius, J.; Qian, Q.; Durand, J. M. B.; Hagervall, T. G.; Björk, G. R. Improvement of Reading Frame Maintenance Is a Common Function for Several TRNA Modifications. EMBO Journal; 2001, 20 (17), 4863- 4873. https://doi.org/10.1093/emboj/20.17.4863. (134) Ikeuchi, Y.; Shigi, N.; Kato, J. I.; Nishimura, A.; Suzuki, T. Mechanistic Insights into Sulfur Relay by Multiple Sulfur Mediators Involved in Thiouridine Biosynthesis at TRNA Wobble Positions. Molecular cell; 2006, 21 (1), 97-108. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2005.11.001. (135) Ogle, J. M.; Brodersen, D. E.; Clemons, J.; Tarry, M. J.; Carter, A. P.; Ramakrishnan, V. Recognition of Cognate Transfer RNA by the 30S Ribosomal Subunit. Science; (1979) 2001, 292 (5518), 897-902. https://doi.org/10.1126/science.1060612. (136) Yarian, C.; Townsend, H.; Czestkowski, W.; Sochacka, E.; Malkiewicz, A. J.; Guenther, R.; Miskiewicz, A.; Agris, P. F. Accurate Translation of the Genetic Code Depends on TRNA Modified Nucleosides. Journal of Biological Chemistry; 2002, 277 (19), 16391-16395. https://doi.org/10.1074/jbc.M200253200. (137) Wei, F. Y.; Zhou, B.; Suzuki, T.; Miyata, K.; Ujihara, Y.; Horiguchi, H.; Takahashi, N.; Xie, P.; Michiue, H.; Fujimura, A.; Kaitsuka, T.; Matsui, H.; Koga, Y.; Mohri, S.; Suzuki, T.; Oike, Y.; Tomizawa, K. Cdk5rap1-Mediated 2-Methylthio Modification of Mitochondrial TRNAs Governs Protein Translation and Contributes to Myopathy in Mice and Humans. Cell metabolism; 2015, 21 (3), 428-442. https://doi.org/10.1016/j.cmet.2015.01.019. (138) Wei, F. Y.; Suzuki, T.; Watanabe, S.; Kimura, S.; Kaitsuka, T.; Fujimura, A.; Matsui, H.; Atta, M.; Michiue, H.; Fontecave, M.; Yamagata, K.; Suzuki, T.; Tomizawa, K. Deficit of TRNALys Modification by Cdkal1 Causes the Development of Type 2 Diabetes in Mice. Journal of Clinical Investigation; 2011, 121 (9), 3598- 3608. https://doi.org/10.1172/JCI58056. (139) Torres, A. G.; Batlle, E.; Ribas de Pouplana, L. Role of TRNA Modifications in Human Diseases. Trends in Molecular Medicine. 2014, 20 (6), 306-314. https://doi.org/10.1016/j.molmed.2014.01.008. (140) Yasukawa, T.; Kirino, Y.; Ishii, N.; Holt, I. J.; Jacobs, H. T.; Makifuchi, T.; Fukuhara, N.; Ohta, S.; Suzuki, T.; Watanabe, K. Wobble Modification Deficiency in Mutant TRNAs in Patients with Mitochondrial Diseases. FEBS Letters 2005, 579 (13). https://doi.org/10.1016/j.febslet.2005.04.038. (141) Yasukawa, T.; Suzuki, T.; Ishii, N.; Ohta, S.; Watanabe, K. Wobble Modification Defect in TRNA Disturbs Codon-Anticodon Interaction in a Mitochondrial Disease. EMBO Journal; 2001, 20 (17), 2948-2952. https://doi.org/10.1093/emboj/20.17.4794. (142) Kirino, Y.; Suzuki, T. Human Mitochondrial Diseases Associated with TRNA Wobble Modification Deficiency. RNA Biology. 2005, 2 (2), 41-44. https://doi.org/10.4161/rna.2.2.1610. (143) Kirino, Y.; Yasukawa, T.; Ohta, S.; Akira, S.; Ishihara, K.; Watanabe, K.; Suzuki, T. Codon-Specific Translational Defect Caused by a Wobble Modification Deficiency in Mutant TRNA from a Human Mitochondrial Disease. Proceedings of the National Academy of Sciences; 2004, 101 (42), 15070-15075. https://doi.org/10.1073/pnas.0405173101. (144) Guan, M. X.; Yan, Q.; Li, X.; Bykhovskaya, Y.; Gallo-Teran, J.; Hajek, P.; Umeda, N.; Zhao, H.; Garrido, G.; Mengesha, E.; Suzuki, T.; Del Castillo, I.; Peters, J. L.; Li, R.; Qian, Y.; Wang, X.; Ballana, E.; Shohat, M.; Lu, J.; Estivill, X.; Watanabe, K.; Fischel-Ghodsian, N. Mutation in TRMU Related to Transfer RNA Modification Modulates the Phenotypic Expression of the Deafness-Associated Mitochondrial 12S Ribosomal RNA Mutations. The American Journal of Human Genetics; 2006, 79 (2), 291-302. https://doi.org/10.1086/506389. (145) Mikulecky, P. J.; Feig, A. L. Heat Capacity Changes Associated with Nucleic Acid Folding. Biopolymers; 2006, 81 (1), 38-58. https://doi.org/10.1002/bip.20457. (146) Schroeder, S. J.; Turner, D. H. Optical Melting Measurements of Nucleic Acid Thermodynamics. Methods Enzymology; 2009, 468, 371–387. https://doi.org/10.1016/s0076-6879(09)68017-4. (147) Kypr, J.; Kejnovská, I.; Renčiuk, D.; Vorlíčková, M. Circular Dichroism and Conformational Polymorphism of DNA. Nucleic Acids Research. 2009, 37 (6), 1713–1725. https://doi.org/10.1093/nar/gkp026. (148) Gray, D. M.; Ratliff, R. L.; Vaughan, M. R. [19] Circular dichroism spectroscopy of DNA. Circular Dichroism Spectroscopy of DNA; 1992, 211, 389-406. https://doi.org/10.1016/0076-6879(92)11021-A. (149) Marky, L. A.; Breslauer, K. J. Calculating Thermodynamic Data for Transitions of Any Molecularity from Equilibrium Melting Curves. Biopolymers; 1987, 26 (9), 1601–1620. https://doi.org/10.1002/bip.360260911. (150) Puglisi, J. D.; Tinoco, I. Absorbance Melting Curves of RNA. Methods in Enzymology; 1989, 180, 304-325. https://doi.org/10.1016/0076-6879(89)80108-9. (151) Mergny, J.-L.; Lacroix, L. Analysis of Thermal Melting Curves; 2003, 13 (6), 515-537. https://doi.org/10.1089/154545703322860825. (152) Privalov, P. L.; Crane-Robinson, C. Forces Maintaining the DNA Double Helix. European Biophysics Journal 2020, 49 (5), 315-321. https://doi.org/10.1007/s00249-020-01437-w. (153) Lane, A. N.; Jenkins, T. C. Thermodynamics of Nucleic Acids and Their Interactions with Ligands. Quarterly Reviews of Biophysics; 2000, 33 (3), 255-306. https://doi.org/10.1017/S0033583500003632. (154) Morrison, L. E.; Stols, L. M. Sensitive Fluorescence-Based Thermodynamic and Kinetic Measurements of DNA Hybridization in Solution. Biochemistry; 1993, 32 (12), 3095–3104. https://doi.org/10.1021/bi00063a022. (155) Applequist, J.; Damle, V. Thermodynamics of the Helix-Coil Equilibrium in Oligoadenylic Acid from Hypochromicity Studies. Journal of The American Chemical Society; 1965, 87 (7), 1450-1458. https://doi.org/10.1021/ja01085a007. (156) Ikeya, T.; Ban, D.; Lee, D.; Ito, Y.; Kato, K.; Griesinger, C. Solution NMR Views of Dynamical Ordering of Biomacromolecules. Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects; 2018, 1862 (2), 287-306. https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2017.08.020. (157) Gimenez, D.; Phelan, A.; Murphy, C. D.; Cobb, S. L. 19F NMR as a Tool in Chemical Biology. Beilstein Journal of Organic Chemistry; 2021, 17 (1), 293–318. https://doi.org/10.3762/BJOC.17.28. (158) Chen, H.; Viel, S.; Ziarelli, F.; Peng, L. F NMR: A Valuable Tool for Studying Biological Events. Chemical Society Reviews; 2013, 42 (20), 7971–7982. https://doi.org/10.1039/c3cs60129c. (159) Marsh, E. N. G.; Suzuki, Y. Using 19F NMR to Probe Biological Interactions of Proteins and Peptides. ACS Chemical Biology; 2014, 9 (6), 1242–1250. https://doi.org/10.1021/cb500111u. (160) Håkon Hope. Cryocrystallography of Biological Macromolecules: A Generally Applicable Method. Acta Crystallographica Section B: Structural Science; 1988, 44 (1), 22-26. https://doi.org/10.1107/S0108768187008632 (161) Hendrickson, W. A.; Ogata, C. M. [28] Phase Determination from Multiwavelength Anomalous Diffraction Measurements. Methods in Enzymology; 1997, 276, 494-523. https://doi.org/10.1016/S0076- 6879(97)76074-9. (162) Correli, C. C.; Freeborn, B.; Moore, P. B.; Steitz, T. A. Use of Chemically Modified Nucleotides to Determine a 62-Nucleotide Rna Crystal Structure: A Survey of Phosphorothioates, Br, Pt and Hg. Journal of Biomolecular Structure and Dynamics; 1997, 15 (2), 165–172. https://doi.org/10.1080/07391102.1997.10508183. (163) Yang, W.; Steitz, T. A. Crystal Structure of the Site-Specific Recombinase Resolvase Complexed with a 34 Bp Cleavage Site. Cell; 1995, 82 (2), 193-207. https://doi.org/10.1016/0092-8674(95)90307-0. (164) Brändén, G.; Neutze, R. Advances and Challenges in Time-Resolved Macromolecular Crystallography. Science. 2021. https://doi.org/10.1126/science.aba0954. (165) Gräwert, T. W.; Svergun, D. I. Structural Modeling Using Solution Small-Angle X-Ray Scattering (SAXS). Journal of Molecular Biology; 2020, 432 (9), eaba0954. https://doi.org/10.1016/j.jmb.2020.01.030. (166) Da Vela, S.; Svergun, D. I. Methods, Development and Applications of Small-Angle X-Ray Scattering to Characterize Biological Macromolecules in Solution. Current Research in Structural Biology; 2020, 2, 164- 170. https://doi.org/10.1016/j.crstbi.2020.08.004. (167) Bai, X. chen; Gonen, T.; Gronenborn, A. M.; Perrakis, A.; Thorn, A.; Yang, J. Challenges and Opportunities in Macromolecular Structure Determination. Nature Reviews Molecular Cell Biology; 2024, 25 (1), 7-12. https://doi.org/10.1038/s41580-023-00659-y. (168) Kirsch, P. Modern Fluoroorganic Chemistry: Synthesis, Reactivity, Applications; John Wiley & Sons, 2013. https://doi.org/10.1002/9783527651351. (169) Suzuki, Y.; Brender, J. R.; Soper, M. T.; Krishnamoorthy, J.; Zhou, Y.; Ruotolo, B. T.; Kotov, N. A.; Ramamoorthy, A.; Marsh, E. N. G. Resolution of Oligomeric Species during the Aggregation of Aβ1-40 Using 19F NMR. Biochemistry; 2013, 52 (11), 1903-1912. https://doi.org/10.1021/bi400027y. (170) O’Hagan, D.; Deng, H. Enzymatic Fluorination and Biotechnological Developments of the Fluorinase. Chemical Reviews; 2015, 115 (2), 634–649. https://doi.org/10.1021/cr500209t. (171) Tredwell, M.; Gouverneur, V. Comprehensive Chirality; Elsevier Ltd, 2012. https://doi.org/10.1016/B978-0- 08-095167-6.00106-3. (172) Harris, R. K.; Becker, E. D.; Cabral De Menezes, S. M.; Goodfellow, R.; Granger, P. NMR Nomenclature. Nuclear Spin Properties and Conventions for Chemical Shifts (IUPAC Recommendations 2001). Pure and Applied Chemistry; 2001, 73 (11), 1795-1818. https://doi.org/10.1351/pac200173111795. (173) Granqvist, L. Novel 19 F Nmr Sensors for the Characterization of Higher-Order Secondary Structures of Dna and Rna; Väitöskirja, 2018. ISBN 978-951-29-7253-1. (174) Granqvist, L.; Virta, P. 4′-C-[(4-Trifluoromethyl-1 H -1,2,3-Triazol-1-Yl)Methyl]Thymidine as a Sensitive 19F NMR Sensor for the Detection of Oligonucleotide Secondary Structures. The Journal of Organic Chemistry; 2014, 79 (8), 3529–3536. https://doi.org/10.1021/jo500326j. (175) Granqvist, L.; Virta, P. Sensor for the Detection of RNA Secondary Structures. The Journal of Organic Chemistry; 2015, 80 (16), 2–11. https://doi.org/10.1021/acs.joc.5b00973. (176) Xiao, G.; Parsons, J. F.; Tesh, K.; Armstrong, R. N.; Gilliland, G. L. Conformational Changes in the Crystal Structure of Rat Glutathione Transferase M1-1 with Global Substitution of 3-Fluorotyrosine for Tyrosine. Journal of Molecular Biology; 1998, 281 (2), 323-339. https://doi.org/10.1006/jmbi.1998.1935. (177) Labroo, V. M.; Hebel, D.; Kirk, K. L.; Cohen, L. A.; Lemieux, C.; Schiller, P. W. Direct Electrophilic Fluorination of Tyrosine in Dermorphin Analogues and Its Effect on Biological Activity, Receptor Affinity and Selectivity. International Journal of Peptide and Protein Research; 1991, 37 (5), 430-439. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1991.tb00758.x. (178) Sanders Sevall, J. Factor V Leiden Genotyping Using Real-Time Fluorescent Polymerase Chain Reaction. Molecular and Cellular Probes; 2000, 14 (4), 249-253. https://doi.org/10.1006/mcpr.2000.0313. (179) Farzan, V. M.; Markelov, M. L.; Skoblov, A. Y.; Shipulin, G. A.; Zatsepin, T. S. Specificity of SNP Detection with Molecular Beacons Is Improved by Stem and Loop Separation with Spacers. Analyst; 2017, 142 (6), 945-950. https://doi.org/10.1039/c6an02441f. (180) Kim, S.; Misra, A. SNP Genotyping: Technologies and Biomedical Applications. Annual Review of Biomedical Engineering; 2007, 9, 289–320. https://doi.org/10.1146/annurev.bioeng.9.060906.152037. (181) Davis, P. B. Cystic Fibrosis since 1938. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine; 2006, 173 (5), 475-482. https://doi.org/10.1164/rccm.200505-840OE. (182) Sachidanandam, R.; Weissman, D.; Schmidt, S. C.; Kakol, J. M.; Stein, L. D.; Marth, G.; Sherry, S.; Mullikin, J. C.; Mortimore, B. J.; Willey, D. L.; Hunt, S. E.; Cole, C. G.; Coggill, P. C.; Rice, C. M.; Ning, Z.; Rogers, J.; Bentley, D. R.; Kwok, P. Y.; Mardis, E. R.; Yeh, R. T.; Schultz, B.; Cook, L.; Davenport, R.; Dante, M.; Fulton, L.; Hillier, L.; Waterston, R. H.; McPherson, J. D.; Gilman, B.; Schaffner, S.; Van Etten, W. J.; Reich, D.; Higgins, J.; Daly, M. J.; Blumenstiel, B.; Baldwin, J.; Stange-Thomann, N.; Zody, M. C.; Linton, L.; Lander, E. S.; Altshuler, D. A Map of Human Genome Sequence Variation Containing 1.42 Million Single Nucleotide Polymorphisms. Nature; 2001, 409 (6822), 928-933. https://doi.org/10.1038/35057149. (183) Wang, D. G.; Fan, J. B.; Siao, C. J.; Berno, A.; Young, P.; Sapolsky, R.; Ghandour, G.; Perkins, N.; Winchester, E.; Spencer, J.; Kruglyak, L.; Stein, L.; Hsie, L.; Topaloglou, T.; Hubbell, E.; Robinson, E.; Mittmann, M.; Morris, M. S.; Shen, N.; Kilburn, D.; Rioux, J.; Nusbaum, C.; Rozen, S.; Hudson, T. J.; Lipshutz, R.; Chee, M.; Lander, E. S. Large-Scale Identification, Mapping, and Genotyping of Single- Nucleotide Polymorphisms in the Human Genome. Science; 1998, 280 (5366), 1077-1082. https://doi.org/10.1126/science.280.5366.1077. (184) Brookes, A. J. The Essence of SNPs. Gene; 1999, 234 (2), 177-186. https://doi.org/10.1016/S0378- 1119(99)00219-X. (185) Guzey, C.; Spigset, O. Genotyping as a Tool to Predict Adverse Drug Reactions. Current Topics in Medicinal Chemistry; 2005, 4 (13), 1409-1419. https://doi.org/10.2174/1568026043387791. (186) Clever, G. H.; Shionoya, M. Metal-Base Pairing in DNA. Coordination Chemical Reviews; 2010, 254 (19– 20), 2391-2402. https://doi.org/10.1016/j.ccr.2010.04.014. (187) Takezawa, Y.; Müller, J.; Shionoya, M. Artificial DNA Base Pairing Mediated by Diverse Metal Ions. Chemistry Letters; 2017, 46 (5), 622-633. https://doi.org/10.1246/cl.160985. (188) Jash, B.; Scharf, P.; Sandmann, N.; Fonseca Guerra, C.; Megger, D. A.; Müller, J. A Metal-Mediated Base Pair That Discriminates between the Canonical Pyrimidine Nucleobases. Chemical Science; 2017, 8 (2), 1337-1343. https://doi.org/10.1039/c6sc03482a. (189) Hashino, K.; Ito, M.; Ikawa, K.; Hosoya, C.; Nishioka, T.; Matsumoto, K. Application of a Lanthanide Fluorescent Chelate Label for Detection of Single-Nucleotide Mutations with Peptide Nucleic Acid Probes. Analytical Biochemistry; 2006, 355 (2), 278-284. https://doi.org/10.1016/j.ab.2006.06.003. (190) Matsumoto, K. Recent Developments in Lanthanide Chelates as Luminescent Labels for Biomedical Analyses. Handbook on the Physics and Chemistry of Rare Earths; Elsevier, 2020. https://doi.org/10.1016/bs.hpcre.2020.07.002. (191) Paleček, E. Fifty Years of Nucleic Acid Electrochemistry. Electroanalysis: An International Journal Devoted to Fundamental and Practical Aspects of Electroanalysis; 2009, 21 (3-5), 239-251. https://doi.org/10.1002/elan.200804416. (192) Paleček, E.; Bartošík, M. Electrochemistry of Nucleic Acids. Chemical Reviews; 2012, 112 (6), 3427-3481. https://doi.org/10.1021/cr200303p. (193) Minuth, M.; Richert, C. A Nucleobase Analogue That Pairs Strongly with Adenine. Angewandte Chemie; 2013, 125 (41), 11074-11077. https://doi.org/10.1002/ange.201305555. (194) Zhang, D.-W.; Li, Z.-T. Intramolecular N-H···X (X = F, Cl, Br, I, and S) Hydrogen Bonding in Aromatic Amide Derivatives - The X-Ray Crystallographic Investigation. Current Trends in X-Ray Crystallography; InTechOpen, 2011. https://doi.org/10.5772/28876. (195) Chopra, D. Is Organic Fluorine Really “Not” Polarizable? Crystal Growth and Design; 2012, 12 (2), 541- 546. https://doi.org/10.1021/cg201498u. (196) Dunitz, J. D.; Taylor, R. Organic Fluorine Hardly Ever Accepts Hydrogen Bonds. Chemistry - A European Journal; 1997, 3 (1), 89-98. https://doi.org/10.1002/chem.19970030115. (197) Dunitz, J. D. Organic Fluorine: Odd Man Out. ChemBioChem; 2004, 5 (5), 614-621. https://doi.org/10.1002/cbic.200300801. (198) Howard, J. A. K.; Hoy, V. J.; O’Hagan, D.; Smith, G. T. How Good Is Fluorine as a Hydrogen Bond Acceptor? Tetrahedron; 1996, 52 (38), 12613–12622. https://doi.org/10.1016/0040-4020(96)00749-1. (199) Chaudhari, S. R.; Mogurampelly, S.; Suryaprakash, N. Engagement of CF3 Group in N-H···F-C Hydrogen Bond in the Solution State: NMR Spectroscopy and MD Simulation Studies. Journal of Physical Chemistry B; 2013, 117 (4), 1123-1129. https://doi.org/10.1021/jp310798d. Liitteet Liite 1. Lisämateriaali Pro gradu Tarkentavat tiedot 2-trifluorometyylianiliininukleotidi metallivälitteisenä 19F NMR-koettimena Assi Lepistö Tuomas Lönnberg, Pasi Virta Sisältö 1H-NMR -spektri yhdisteestä 4 1 13C-NMR -spektri yhdisteestä 4 2 1H-NMR -spektri yhdisteestä 5 4 1H-NMR -spektri yhdisteestä 7 5 13C-NMR -spektri yhdisteestä 7 6 19F-NMR -spektri yhdisteestä 7 8 1H-NMR -spektri yhdisteestä 8 8 13C-NMR -spektri yhdisteestä 8 10 19F-NMR -spektri yhdisteestä 8 12 (1H,1H)-COSY -spektri yhdisteestä 8 13 (1H,13C)-HSQC -spektri yhdisteestä 8 13 (1H,13C) -HMBC -spektri yhdisteestä 8 14 1H-NMR -spektri yhdisteestä 9 14 13C-NMR -spektri yhdisteestä 9 16 (1H,1H)-COSY -spektri yhdisteestä 9 18 (1H,13C)-HSQC -spektri yhdisteestä 9 18 1H-NMR -spektri yhdisteestä 10 19 13C-NMR -spektri yhdisteestä 10 20 19F-NMR -spektri yhdisteestä 10 22 (1H,1H)-COSY -spektri yhdisteestä 10 23 (1H,13C)-HSQC -spektri yhdisteestä 10 23 1H-NMR -spektri yhdisteestä 11 24 13C-NMR -spektri yhdisteestä 11 25 19F-NMR -spektri yhdisteestä 11 28 (1H,1H)-COSY -spektri yhdisteestä 11 28 (1H,13C)-HSQC -spektri yhdisteestä 11 29 (1H,13C) -HMBC -spektri yhdisteestä 11 29 1H-NMR -spektri yhdisteestä 12 30 13C-NMR -spektri yhdisteestä 12 32 19F-NMR -spektri yhdisteestä 12 36 31P-NMR -spektri yhdisteestä 12 36 (1H,1H)-COSY -spektri yhdisteestä 12 37 (1H,13C)-HSQC -spektri yhdisteestä 12 38 (1H,13C) -HMBC -spektri yhdisteestä 11 38 19F-NMR -spektri oligonukleotidille ON1 39 19F-NMR -spektri oligonukleotidille ON2 38 19F-NMR -spektri oligonukleotidille ON3 40 Kuva 1. ESI-TOF massa spektri yhdisteelle 7 41 Kuva 2. ESI-TOF massa spektri yhdisteelle 8 42 Kuva 3. ESI-TOF massa spektri yhdisteelle 9 43 Kuva 4. ESI-TOF massa spektri yhdisteelle 10 44 Kuva 5. ESI-TOF massa spektri yhdisteelle 11 45 Kuva 6. ESI-TOF massa spektri yhdisteelle 12 46 Kuva 7. RP-HPLC kromatogrammi oligonukleotidista ON1 47 Kuva 8. ESI massa spektri oligonukleotidille ON1 48 Kuva 9. RP-HPLC kromatogrammi oligonukleotidista ON2 49 Kuva 10. ESI massa spektri oligonukleotidille ON2 50 Kuva 11. RP-HPLC kromatogrammi oligonukleotidista ON3 51 Kuva 12. ESI massa spektri oligonukleotidille ON3 52 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 Kuva 1. ESI-TOF massa spektri yhdisteelle 7. 103 Kuva 2. ESI-TOF massa spektri yhdisteelle 8. 104 Kuva 3. ESI-TOF massa spektri yhdisteelle 9. 105 Kuva 4. ESI-TOF massa spektri yhdisteelle 10. 106 Kuva 5. ESI-TOF massa spektri yhdisteelle 11. 107 Kuva 6. ESI-TOF massa spektri yhdisteelle 12. 108 Kuva 7. RP HPLC signaali oligonukleotidista ON1 A) raakatuote ja B) puhdistettu; Clarity Oligo-RP C18 kolonnilla (250 x 10 mm, 10 µm); virtausnopeus = 3,0 ml min-1; lineaarinen gradientti (5-35 % 30 min aikana) asetonitriilillä 0,1 molaarisessa trietyyliammoniumasetaatti vesiliuoksessa. 109 Kuva 8. ESI massa spektri oligonukleotidille ON1. 110 Kuva 9. RP HPLC signaali oligonukleotidista ON2 A) raakatuote ja B) puhdistettu; Clarity Oligo-RP C18 kolonnilla (250 x 10 mm, 10 µm); virtausnopeus = 3,0 ml min-1; lineaarinen gradientti (5-35 % 30 min aikana) asetonitriilillä 0,1 molaarisessa trietyyliammoniumasetaatti vesiliuoksessa. 111 Kuva 10. ESI massa spektri oligonukleotidille ON2. 112 Kuva 11. RP HPLC signaali oligonukleotidista ON3 A) raakatuote ja B) puhdistettu; Clarity Oligo-RP C18 kolonnilla (250 x 10 mm, 10 µm); virtausnopeus = 3,0 ml min-1; lineaarinen gradientti (5-35 % 30 min aikana) asetonitriilillä 0,1 molaarisessa trietyyliammoniumasetaatti vesiliuoksessa. 113 Kuva 12. ESI massa spektri oligonukleotidille ON3. 114