2´-Metoksiamino–ryhmä molekyylinsisäisenä nukleofiilisenä katalyyttinä fosfodiesterisidoksen muodostumisessa Pro gradu -tutkielma Kemian laitos Bio-orgaaninen kemia Jenna Lappi Lokakuu 2023 Turku Turun yliopiston laatujärjestelmän mukaisesti tämän julkaisun alkuperäisyys on tarkastettu Turnitin OriginalityCheck -järjestelmällä. TURUN YLIOPISTO Kemian laitos LAPPI JENNA: 2´-Metoksiamino-ryhmä molekyylinsisäisenä nukleofiilisenä katalyyttinä fosfodiesterisidoksen muodostumisessa Pro Gradu -tutkielma, 36 s., liitteet 7 s. Lokakuu 2023 Templaattinauhan ohjaama DNA:n kopiointi on perusta geneettisen informaation siirrolle ja transkriptiolle. Soluissa kopiointi tapahtuu entsyymien avulla. Lääketieteen ja teollisuuden sovelluksissa replikointireaktio halutaan toteuttaa ilman entsyymejä, koska entsyymit ovat kalliita ja herkkiä reaktio-olosuhteille. Ei-entsymaattisen replikoinnin tutkimuksen tavoitteena on kehittää menetelmiä, joilla voidaan korvata entsyymipohjaisten menetelmien käyttö sovelluksissa. Lisäksi tutkimuksen tavoitteena on saada enemmän tietoa siitä, miten geenejä mahdollisesti on kopioitu ennen entsyymien kehittymistä. Projektissa selvitettiin 2´-metoksiaminoryhmän roolia molekyylinsisäisenä nukleoliilisenä katalyyttinä fosfodiesterisidoksen muodostamisessa. Tulosten perusteella 2´-deoksi-2´-(metoksiamino)uridiini ei muodostanut vesiliuoksessa pH-alueella 5-9 aktivoidun nukleosidifosfaatin, tymidiini-5′-O-(2-metyyli-imidatsoli)monofosfaatin, kanssa fosforamidaattisidosta. Todennäköisesti aminometoksiryhmä muodostaa liian labiileja tuotteita, jotka hajoavat nopeasti tai ryhmä ei ole niin nukleofiilinen kuin oletettiin. 2´-Deoksi-2´-(metoksiamino)uridylyyli-3´,5´-tymidiinin hydrolyyttisiä reaktioita seurattiin 90 °C:ssa. Hydrolyysireaktioiden tutkimuksessa saatiin selvitettyä useimmat hajoamistuotteet, reaktioreitit ja reaktionopeudet pH-alueella 1–11,2. Avainsanat: templaatin ohjaama synteesi, katalyysi, kinetiikka Sisällys Lyhenteet ja symbolit 1 Johdanto ......................................................................................................................... 1 1.1 Mekanismit ja reaktio-olosuhteet ............................................................................ 3 1.2 Templaatti ............................................................................................................... 6 1.3 Aluke ....................................................................................................................... 8 1.4 Aktivoidut nukleotidit ............................................................................................. 9 1.4.1 Fosfaattiosan modifikaatiot ................................................................................ 10 1.4.2 Emäsmodifikaatiot ............................................................................................. 11 1.5 2´-Metoksiaminoryhmä ......................................................................................... 12 1.6 Yhteenveto ............................................................................................................ 13 2 Tulokset ja niiden tarkastelu ........................................................................................ 13 2.1 2´-Deoksi-2´-(metoksiamino)uridylyyli-3´,5´-tymidiinin hydrolyyttiset reaktiot 13 2.1.1 Tuotejakauma ..................................................................................................... 14 2.1.2 pH-nopeusprofiili ............................................................................................... 19 2.1.3 Reaktiomekanismit ............................................................................................. 21 2.2. 2´-Deoksi-2´-(metoksiamino)uridylyyli-2´,5´-tymidiini-(2´-N-fosforamidaatin) synteesit ....................................................................................................................... 23 2.2.1 Fosforimidatsolistrategia .................................................................................... 24 2.2.2 TBDMS-suojaryhmästrategia ............................................................................ 26 2.2.3 Markiewicz-suojaryhmästrategia ....................................................................... 27 3 Johtopäätökset ja yhteenveto........................................................................................ 27 4 Kokeelliset menetelmät ................................................................................................ 28 4.1 Yleiset menetelmät ................................................................................................ 28 4.2 2´-Deoksi-2´-(metoksiamino)uridylyyli-3´,5´-tymidiinin kineettiset mittaukset.. 28 4.3 Tymidiini-5′-O-(2-metyyli-imidatsoli)monofosfaatti ........................................... 30 4.4 2´-Deoksi-2´-(metoksiamino)uridylyyli-2´,5´-tymidiini-(2´-N-fosforamidaatin) synteesi fosforimidatsoli-strategialla vesiliuoksessa................................................... 31 4.5 5´-(4,4´-dimetoksitrityyli)-3´-tert-butyylidimetyylisilyyli-2´-deoksi-2´- (metoksiamino)uridiini ................................................................................................ 31 4.6 2´-Deoksi-2´-(metoksiamino)uridylyyli-2´,5´-tymidiini-(2´-N-fosforamidaatin) synteesi käyttäen TBDMS-suojaryhmästrategiaa ....................................................... 33 4.7 2´-Deoksi-2´-(metoksiamino)-3´,5´-O-(1,1,3,3-tetraisopropyylidisiloksaani-1,3- diyyli)-uridiini ............................................................................................................. 34 4.8 2´-Deoksi-2´-(metoksiamino)uridylyyli-2´,5´-tymidiini-(2´-N-fosforamidaatin) synteesi käyttäen Markiewicz-suojaryhmästrategiaa .................................................. 35 5 Viitteet .......................................................................................................................... 36 6 Liitteet .......................................................................................................................... 43 Lyhenteet ja symbolit 2-AmIm 2-aminoimidatsoli 2-MeIm 2-metyyli-imidatsoli 2´-N-UpT 2´-deoksi-2´-(metoksiamino)uridylyyli-3´,5´-tymidiini 2´-NHOMeUrd 2´-deoksi-2´-(metoksiamino)uridiini 2´-NHOMeUrd-3´-P 2´-deoksi-2´-(metoksiamino)-uridiini-3´-monofosfaatti 5´-TMP tymidiini-5´-monofosfaatti DCM dikloorimetaani DMSO dimetyylisulfoksidi DMTr 4,4´-dimetoksitrityyli EtOAc etyyliasetaatti LC/MS nestekromatografia/massaspektorometri MeOH metanoli NMR ydinmagneettinen resonanssi TBDMS tert-butyylidimetyylisilyyli TBDMSCl tert-butyylidimetyylisilyylikloridi THF tetrahydrofuraani TLC ohutlevykromatografia 1 1 Johdanto Templaatin ohjaama DNA-alukkeen jatkaminen luo molekulaarisen perustan DNA:n replikaatiolle ja transkriptiolle.1 Solussa DNA:n replikaatiossa DNA-helikaasi avaa DNA:n kaksoiskierteen,2 minkä jälkeen DNA-primaasi syntetisoi alukkeen ribonukleosifitrifosfaateista,3 ja hybridisoi alukkeen templaattinauhaan. DNA- polymeraasi jatkaa aluketta liittämällä templaattinauhan emäsjärjestyksen perusteella oikean deoksinukleotidin fosfodiesterisidoksella alukkeen vapaaseen 3´- hydroksyyliryhmään (3´-OH). Entsyymit korjaavat mahdolliset virheet sekvenssissä. Transkriptiossa RNA-polymeraasi avaa DNA:n kaksoiskierteen ja alkaa ilman aluketta liittämään yhteen ribonukleotideja samanlaisilla fosfodiesterisidoksilla kuin DNA:n replikaatiossa templaattinauhan emäsjärjestyksen mukaisesti. Tämä lähetti-RNA:n esiaste käsitellään entsymaattisesti ja muodostunut lähetti-RNA siirretään ribosomiin. Ribosomissa aminohappoja liitetään toisiinsa peptidisidoksilla lähetti-RNA:n emäsjärjestyksen mukaan aminohappoketjuksi, josta rakentuu proteiini.2 Ei-entsymaattisessa replikoinnissa oligonukleotidialukkeen jatkuminen perustuu siihen, kuinka hyvin nukleotidit reagoivat keskenään ja tunnistavat toisensa. Mekanistisesti ei- entsymaattisessa replikaatiossa nukleofiili eli aluke reagoi elektrofiilin eli aktivoidun nukleotidin kanssa muodostaakseen sidoksen.4 Alukkeen terminaalinen hydroksyyliryhmä tai aminoryhmä (Kaavio 1) hyökkää nukleofiilinä aktivoidun nukleotidin fosfaattiryhmään, jolloin todennäköisesti muodostuu pentavalenttinen intermediaatti. Ellei fosfaatin lähtevä ryhmä jo ole Westheimerin sääntöjen5 mukaisesti apikaalisessa asemassa, tapahtuu pseudorotaatio. Mahdollisen pseudorotaation jälkeen lähtevä ryhmä irtoaa.6 Kaavio 1. Ei-entsymaattinen replikointi käyttäen templaattia, aluketta ja aktivoitua nukleotidia. 2 Ei-entsymaattinen replikointi perustuu emäspariutumiseen ja nukleotidien kemialliseen reaktiivisuuteen, joten se saattaa mallintaa geneettisen informaation kopiointia ennen entsyymien ja ribotsyymien kehittymistä.6 Voisi olla mahdollista kehittää tekosolu, joka replikoi DNA:ta itsenäisesti.7 Ei-entsymaattinen replikointi on halvempaa kuin entsymaattinen, koska siinä ei tarvitse käyttää entsyymejä tai trifosfaattinukleosideja reagensseina. Tämä olisi erittäin suotavaa varsinkin sekvensoinnin sovelluksissa.8 Ei- entsymaattista replikaatiota voitaisiin käyttää sellaisten sairauksien diagnosoinnissa, jotka johtuvat yhdestä väärästä nukleotidista geenissä sekä sen avulla voitaisiin mahdollisesti räätälöidä sairauden hoitoa yksilöllisesti. Reaktiota voitaisiin hyödyntää myös antiviraalisten antisense-RNA-lääkkeiden valmistuksessa. Ei-entsymaattisen replikoinnin tutkimuksessa voidaan mahdollisesti löytää uusia tapoja syntetisoida ei- kanonisia oligomeerejä.9 Ei-kanonisia rakenteita tutkitaan mahdollisina lääkkeinä10 ja ei- entsymaattisesti kopioitavia, muokattuja nukleoemäksia sisältäviä oligonukleotideja voidaan mahdollisesti käyttää hybridimateriaalien valmistukseen.9 Jotta kopioitava sekvenssi ja rakenne säilyy, täytyy sekvenssin pituuden ja emäsjärjestyksen säilyä alkuperäisenä.9 Nykyisin tunnetut nukleotidiketjujen jatkamiseen tarkoitetut kemialliset metodit eivät ole niin tarkkoja ja nopeita kuin entsyymit.8 Polymeraasit käyttävät replikaatioreaktiossa trifosfaattinukleosideja, mutta laboratorio- olosuhteissa trifosfaattinukleosidit eivät ole tarpeeksi reaktiivisia reagoimaan keskenään.9 Tällä hetkellä ei esimerkiksi ole mahdollista ei-entsymaattisesti replikoida RNA-ketjua, joka on tarpeeksi pitkä koodaamaan oligo- tai polypeptidiä. Lisäksi reaktio ei replikoi templaatin sekvessiä tarpeeksi tarkasti ja luotettavasti. Reaktiot eivät ole kvantitatiivisia ja reaktiossa syntyy seos erimittaisia oligonukleotideja.6 Luonnolliset DNA-alukkeet eivät ole tarpeeksi reaktiivisia ei-entsymaattiseen replikointiin.4 DNA- sekvenssin ei-entsymaattisessa replikoinnissa yksi suurimmista ongelmista on kopioinnin tarkkuus,1 koska jopa yli 25 %:a emäksistä saattaa olla virheellisiä.11 Replikointireaktio, jossa käytetään kaikkia neljää kanonista nukleoemästä, ei ole vielä onnistunut.1 Nukleoemäksistä erityisesti tymiiniä on vaikea lisätä ketjuun, koska tymiini ei sitoudu niin tiukasti templatoivaan emäkseen kuin sytosiini, adeniini tai guaniini.12 Myös templaatin viimeinen nukleotidi on huomattavasti hitaampi liittää ketjuun verrattuna muihin templaatin nukleotideihin.13 Replikointireaktio perustuu vuorovaikutuksiltaan heikkoon Watson-Crick emäspariutumiseen templaatin ja nukleotidin välillä, minkä takia reaktiota ei voi tehostaa käyttämällä rajuja olosuhteita tai korkeita lämpötiloja.6 Yleensä reaktiot tehdään vedessä, 3 koska vedessä emäspariutuminen toimii niin kuin solussa.4 Vesi ja nukleotidien hydroksyyliryhmät ovat kilpailevia nukleofiileja, joiden reaktiivisuus on samaa luokkaa. Vettä on reaktioseoksessa huomattavasti enemmän kuin nukleotideja, joten vesi reagoi usein aktivoitujen nukleotidien kanssa.4 Vedessä aktivoitujen nukleotidien hydrolyysiä ei voida välttää, ja se kiihtyy, jos reaktioseoksessa on divalenttisia metalli-ioneja.14 Hydrolyysin takia ei-entsymaattisissa reaktioissa käytetään ylimäärin aktivoituja monomeereja. Kun aktivoitu monomeeri hydrolysoituu, aktiivisten monomeerien konsentraatio liuoksessa vähenee, mikä hidastaa alukkeen jatkoa.6 Hydrolysoitunut monomeeri voi myös sitoutua templaattiin aktivoidun monomeerin sijaan, mikä osaltaan inhiboi reaktiota.15 1.1 Mekanismit ja reaktio-olosuhteet Ei-entsymaattinen replikointi on mekanistisesti kondensaatioreaktio, jossa muodostuu polymeeri.9 Reaktiossa on luultavasti kaksi vaihetta. Ensin templaatti ja aluke dimerisoituvat, minkä jälkeen alukkeeseen lisätään nukleotideja.16 Reaktiomekanismi on todennäköisesti nukleofiilinen bimolekulaarinen substituutioreaktio eli SN2-reaktio.17 Oletetaan, että templaatit ja alukkeet löytävät toisensa reaktioseoksessa diffuusion ja sattuman kautta. Yhdisteet asettuvat antiparalleeliseen asentoon, minkä jälkeen ne muodostavat kaksoiskierteitä.18 Samanaikaisesti vapaat nukleotidit vuorovaikuttavat templaatin kanssa.16 Divalenttiset metalli-ionit voivat kelatoitua 5´-fosfaatin hapen ja hyökkäävän 2´- tai 3´- OH:n välille,19 jolloin ne lähestyvät toisiaan. Reaktiossa voi muodostua kolme erilaista sidosta, 2´,5´- tai 3´,5´-fosfodiesterisidos tai 5´,5´-pyrofosfaattisidos (Kuva 1), riippuen reaktion regioselektiivisyydestä.9 Ribonukleotidien tapauksessa 2´-OH ja 3´-OH ovat keskenään kilpailevia nukleofiileja, joista 2´-OH on nukleofiilisempi. 2´- deoksiribonukleotidien reaktiomekanismi on erilainen kuin ribonukleotidien reaktiomekanismi, koska divalenttisen metalli-ionin kelatoitumisen vaikutus on heikompi 2´-OH:n puuttumisen takia. Lisäksi samasta syystä riboosin konformaatio on DNA:ssa erilainen kuin RNA:ssa. DNA hydrolysoituu hitaammin neutraaleissa ja hieman emäksisissä olosuhteissa kuin RNA.9 4 Kuva 1. Mahdolliset fosfodiesterisidokset. A) 2´,5´-fosfodiesterisidos B) 3´,5´- fosfodiesterisidos C) 5´,5´-pyrofosfaattisidos. Reaktioon vaikuttavat lisäksi vapaiden nukleotidien ja oligonukleotidiketjun väliset vuorovaikutukset sekä nukleotidien ja oligonukleotidien vuorovaikutukset reaktioseoksen muiden komponenttien kanssa. Vesi peittää oligonukleotidiketjun varauksia, joten se vaikuttaa merkittävästi siihen, miten oligonukleotidiketju on orientoitunut avaruudellisesti.9 Myös metalli-ionien koordinoituminen oligonukleotidiketjuun vaikuttaa konformaatioon.20 Metalli-ionit, esimerkiksi Mg2+ ja Pb2+, stabiloivat oligonukleotidin rakennetta ja katalysoivat kondensaatioreaktiota. Metalli-ionit kelatoituvat suoraan tai veden välityksellä fosfaattirungon negatiivisiin varauksiin, jolloin oligonukleotidin kokonaisvaraus laskee. Templaatti/aluke/monomeeri–systeemissä muodostuva dupleksi on stabiilimpi, kun metalli-ionit peittävät fosfaattirungon negatiivisia varauksia, minkä takia reaktioseoksessa yleensä on korkea ionivahvuus. Lisäksi metalli-ionit vaikuttavat nukleoemästen protonoitumiseen. Metalli-ionien läsnäolo reaktioseoksessa vaikuttaa hyökkäävän hydroksyyliryhmän nukleofiilisuuteen ja tuo reaktioseoksen reaktiivisia osia lähemmäs toisiaan, minkä takia reaktion aktivaatioenergia laskee.9 Nukleoemästen pinoutuminen ja vetysidokset emästen välillä vaikuttavat vapaiden nukleotidien ja oligonukleotidiketjun välisiin vuorovaikutuksiin. Pyrimidiini- ja puriinirenkaiden delokalisoituneet elektronit vuorovaikuttavat lähellä olevan nukleoemäksen kanssa π-π–vuorovaikutuksin. Nämä vuorovaikutukset pakottavat oligonukleotidin planaariseen muotoon ja pinoavat emäkset toistensa päälle. Pyrimidiini- ja puriinirenkaat ovat hydrofobisia, joten niiden pinoutuminen on vesiliuoksessa suotuisaa.9 Emästen pinoutuminen vaikuttaa eniten nukleotidien kaksoiskierteiden stabiiliuteen vesiliuoksessa.21 Emäspariutuminen perustuu nukleoemästen typpi- ja happiatomien vapaiden elektroniparien sekä toisen nukleoemäksen hydroksyyli- tai aminoryhmien vetyjen välille muodostuviin vetysidoksiin. Vesiliuoksessa vesimolekyylit 5 usein sitoutuvat nukleoemäksiin vetysidoksin ja syrjäyttävät näin emäsparit. Jos veden vetysitoutumista nukleoemäksiin estetään, emäspariutuminen on tarkempaa. Vettä voidaan esimerkiksi sitoa ioneihin tai viilentää reaktioliuosta lähelle 0 ℃:tta tai sen alle.9 Emäspariutuminen ei rajoitu Watson-Crick–emäspareihin (Kuva 2 A). Esimerkiksi wobble- ja Hoogsteen–emäsparit (Kuva 2 B ja 2 C) ovat tunnettuja biologisissa organismeissa.22,23 Watson-Crick kanonista poikkeavien emäsparien muodostuminen häiritsee ei-entsymaattista replikointia.24 Kuva 2. A) Watson-Crick-emäsparit, B) Hoogsteen-emäspareja22 ja C) wobble-emäspari G-U.23 Myös riboosirenkaan konformaatio vaikuttaa oligonukleotidin asentoon ja siihen, miten emäkset pääsevät vuorovaikuttamaan.9 Kaksoiskierteen geometria vaikuttaa nukleofiilin ja elektrofiilin asentoihin. A-muotoisessa kaksoiskierteessä oligonukleotidiketjun sokeriosat ovat muodossa C3´-endo ja N-glykosidisidos anti-muodossa. B-muotoisessa oligonukleotidiketjussa nukleotidin sokeriosa on muodossa C2´-endo ja N-glykosidisidos anti-muodossa (Kuva 3 A ja 3 B).25 A-muotoisessa kaksoiskierteessä 3´-OH osoittaa poispäin kaksoiskierteen rungosta ja voi helpommin hyökätä aktivoituun monomeeriin. B-muotoisessa kaksoiskierteessä 3´-OH osoittaa kohti kaksoiskierteen keskustaa.26 RNA suosii A-muotoa7 ja DNA suosii solussa B-muotoa.27 6 Kuva 3. A) Furanoosirenkaan mahdolliset konformaatiot. i) C3´-endo ja ii) C2´-endo. B) N-glykosidisidoksen mahdolliset konformaatiot. i) syn ja ii) anti. Piirretty mukaillen Bansal et al.25 Liuoksen pH vaikuttaa nukleoemästen protonaatioon, ja se muuttaa niiden sähköisiä vuorovaikutuksia, mikä vaikuttaa merkittävästi niiden emäspariutumiseen. Lisäksi liuoksen pH vaikuttaa oligonukleotidin fosfaattirungon varauksiin.9 Templaatti/aluke-kompleksiin on alhaisessa lämpötilassa sitoutunut enemmän vapaita nukleotideja kuin korkeammassa lämpötilassa.4 Korkeampi lämpötila nopeuttaa kondensaatioreaktiota mutta samalla sivureaktioiden osuus kasvaa. Aktivoitujen nukleotidien puoliintumisaika on pienempi korkeammissa lämpötiloissa. Alemmat lämpötilat stabiloivat heikkoja intermolekulaarisia vuorovaikutuksia, kuten emäsparitumista ja emästen pinoutumista. Näiden tekijöiden takia alemmissa lämpötiloissa saadaan todennäköisesti termodynaamisesti suotuisampaa 3´-sidoksellista tuotetta.9 Jos systeemissä on paljon G-C–emäspareja, vastinnauhojen erottamiseen tarvitaan korkeampi lämpötila. Jos reaktiossa käytetään liian korkeaa lämpötilaa, saattaa reaktiossa muodostua templaatista riippumattomia oligonukleotideja.28 Jotta templaatin ja vapaiden nukleotidien emäspariutuminen olisi mahdollisimman spesifistä, templaatin ohjaamissa replikointireaktioissa lämpötila pidetään yleensä 0 ℃ ja 4 ℃ välillä.9 1.2 Templaatti Templaattivaikutukseen eli siihen, kuinka voimakkaasti vapaat nukleotidit sitoutuvat templatoivaan nukleoemäkseen, vaikuttaa pinoutuminen, vetysidoksien määrä emäksien välillä12 ja sekundääriset sähköiset vuorovaikutukset.29 Templaattivaikutus on myös riippuvainen alukkeen 3´-ryhmän nukleofiilisuudesta ja monomeerin fosfaattiosan aktiivisuudesta.6 Pinoutuminen vaikuttaa eniten emäksen templaattiin sitoutumisen vapaan energian määrään.12 Yksikin heikosti templaattiin sitoutuva emäs voi pysäyttää reaktion.13 Templaattivaikutus ei kuitenkaan pääasiallisesti määrää, liittyykö nukleotidi alukkeen jatkoksi.12 7 Vesiliuoksessa suurin osa aktivoiduista nukleotideista ei ole sitoutuneena aluke/templaatti–rakenteeseen. Yksi tapa tehostaa ei-entsymaattista replikointia on vahvistaa templaattivaikutusta, jolloin alukkeen päässä oleva nukleofiilinen ryhmä on jäsentynyt niin, että se voi hyökätä aktivoituun nukleotidiin.4 Oligonukleotidiketjun konformaatio, jonka määrittää sekundääristen ja tertiääristen rakenteiden vuorovaikutus, vaikuttaa sen funktionaalisuuteen. Rakenteiden muodostumiseen vaikuttaa oligonukleotidin sekvenssi ja oligonukleotidin vuorovaikutus liuoksen komponenttien kanssa.9 RNA voi laskostua erilaisiin rakenteisiin.30 Nämä rakenteet saattavat estää alukkeen jatkumisen, koska vuorovaikutus alukkeen ja templaattinauhan välillä on voimakkaampaa kuin templaatin ja monomeerien välinen vuorovaikutus. RNA:ta voidaan estää tekemästä tällaisia rakenteita kelatoimalla RNA:han metalli-ioneja tai käyttämällä reaktiossa molekyylejä tai pintoja, jotka avaavat nukleiinihappoketjuja vuorovaikuttamalla ketjun riboosi-fosfaattirungon kanssa.9 Templaattivaikutus on voimakkaampi, kun kaksoiskierre on A-muodossa4 ja ei- entsymaattinen replikointi on nopeampaa A-muotoisilla kaksoiskierteillä, kuten RNA tai LNA, kuin B-muotoisella DNA:lla.7,31 Templaatin hybridisaatiolla, kolmiulotteisella rakenteella ja sekvensillä11 on merkitystä hyvän saannon saavuttamiseen. Mitä enemmän templaatissa on sytosiinia guaniinin verrattuna, sitä tehokkaammin uusi nukleotidi liittyi ketjuun.32 Guaniininukleotidi on helpointa liittää alukkeen jatkoksi, koska guaniini-sytosiini emäsparissa on kolme vetysidosta ja guaniini puriiniemäksenä pinoutuu vahvemmin kuin pyrimidiiniemäkset.4 Poly(C, G)-templaatit kuitenkin muodostavat intra- ja intermolekulaarisia rakenteita, jotka inhiboivat ei-entsymaattista oligomerisaatiota.32 Sekvenssin vaikutuksella alukkeen jatkumiseen voidaan ajatella olevan kolme yleissääntöä: 1) guaniini ja sytosiini jatkavat aluketta nopeammin kuin adeniini tai tymiini, 2) puriinit liittyvät alukkeen jatkoksi nopeammin kuin pyrimidiinit ja 3) alukkeeseen liittyneen emäksen viereiset emäkset eivät vaikuta reaktion nopeuteen niin paljon kuin templatoiva emäs.11 Sekä DNA:lla että RNA:lla alukkeen jatkaminen nopeutuu, jos templaatissa on edempänä alukkeesta (downstream-asemassa) avustava oligonukleotidiketju.33,34 Todennäköisesti kompleksin rakenne on tällöin jäykempi ja avustava ketju vahvistaa pinoutumista, minkä takia vapaa nukleotidi kiinnittyy voimakkaammin templaattiin.13 Templaatin immobilisaatiolla voidaan parantaa replikointireaktion nopeutta ja tarkkuutta. Magneettisiin rautaoksidihelmiin kiinnitetty RNA-templaatti pystyy matalassa 8 lämpötilassa (0 ℃ tai alle) kopioimaan sen kaikkia nukleoemäksiä neljä kertaa peräkkäin lähes kvantitatiivisesti.15 Reaktiossa aluke jatkui oikealla emäksellä pääsääntöisesti yli 90 %:n varmuudella. Templaatin kiinnittämisen avulla reaktioseoksesta voidaan poistaa hydrolysoituneita monomeereja ja korvata niitä aktivoiduilla monomeereillä. Immobilisointi saattaa myös auttaa oligonukleotidiketjuja irtoamaan toisistaan. Reaktio on kuitenkin hidas, sillä kvantatiivisen reaktion saamiseksi reaktioajat saattoivat olla jopa 10 päivää. Monomeerejä myös lisättiin useasti.15 Koolihapolla 1 (Kuva 4 A) substituoidut DNA-templaatit tehostavat deoksiadenosiinin, deoksiguanosiinin, ja tymidiinin liittymistä ketjuun sekä parantavat reaktion tarkkuutta huomattavasti. Esimerkiksi alukkeen jatkuminen deoksiadenosiinilla nopeutui 6,5- kertaiseksi. Koolihapolla substituoiden templaatin virhetaso oli 27 %.35 Stilbeenianalogilla 2 (Kuva 4 B) substituoiduilla templaateilla voidaan reaktiota nopeuttaa jopa 19,6-kertaiseksi, ja se nopeuttaa kaikkien neljän kanonisen nukleoemäksen liittymistä ketjuun.36 Substituentit ovat lipofiilisia, joten ne todennäköisesti saavat vapaan nukleotidin pysymään kauemmin templaatin ja alukkeen lähellä. Tällöin alukkeella on aikaa tehdä nukleofiilinen hyökkäys nukleotidin fosfaattiosaan.13 Kuva 4. A) Koolihappo ja B) stilbeenianalogi. 1.3 Aluke Alukkeen käyttö nopeuttaa reaktiota, koska templaatin mukaisen dimeerin muodostuminen on reaktion nopeutta rajoittava vaihe.17 Alukkeen kiinnittyminen templaattiin mahdollistaa alukkeen ja vapaiden nukleotidien emäspinoutumisen, mikä nopeuttaa vapaiden nukleotidien kiinnittymistä templaattiin.9 Alukkeen käytön ongelmana on, että templaatti/aluke–dupleksi ei ole kovin stabiili, koska käytetyt ketjut ovat lyhyitä. Ratkaisuna on käytetty alempaa lämpötilaa sekä templaatin 9 ylimäärää alukkeisiin verrattuna. Näin varmistetaan, että alukkeen jatkuminen tapahtuu templaatin ohjauksessa ja templaatille epäspesifisiä tuotteita ei muodostu reaktiossa.9 Ribonukleotidialukkeet ovat reaktiivisempia kuin 2´-deoksiribonukleotidialukkeet.35 Yleensä DNA:n ei-entsymaattisen kopioinnin tutkimuksessa käytetään 3´-amino-2´,3´- dideoksinukleosideja.6 Aminoryhmä on nukleofiilisempi kuin hydroksyyliryhmä. Templaatin ohjaamissa reaktioissa on havaittu aminoryhmien olevan 50–100 kertaa reaktiivisempia kuin hydroksyyliryhmien.37 Lisäksi amiinit reagoivat herkästi imidatsolien kanssa.38 Esimerkiksi Schrumin et al. tutkimuksessa substitioidun templaatin35,36 ja oikean lähtevän ryhmän35 kanssa aminotermiset alukkeet nopeuttavat ei-entsymaattista replikointia. Reaktion nopeus on >1 min-1 nukleotidia kohden.7 Aminoterminaalisten alukkeiden replikointireaktion saantoa parantava vaikutus perustuu todennäköisesti nopeaan kovalenttisen sidoksen muodostumiseen ja hydrolyysin hitauteen.39 Mekanistisesti reaktiossa todennäköisesti muodostuu ensin aminoryhmän hyökättyä fosforiin pentavalenttinen intermediaatti. Intermediaatin muodostumisen jälkeen tapahtuu tarvittaessa pseudorotaatio, jonka jälkeen lähtevä ryhmä irtoaa. Kumpikin reaktiovaihe voi olla replikaation nopeutta rajoittava vaihe.4,11 Reaktiossa muodostuva N3´-P5´-DNA kaksoiskierre on kuitenkin niin stabiili, että ketjujen erottuminen saattaa olla vaikeaa.40 1.4 Aktivoidut nukleotidit Ensimmäisessä raportoidussa templaatin ohjaamassa oligonukleotidisynteesissä käytettiin templaattina polyadenylyylihappoketjua, heksatymidiininukleotideja ja aktivaattorina karbodi-imidiä 3 tai 4 (Kuva 5).41 Reaktiossa saatiin tymidiinin dodekanukleotideja 5 %:n saannolla. Todennäköisesti karbodi-imidi aktivoi tymidiinin heksanukleotidin terminaalisen fosfaattiryhmän muodostaen syklisen 2´,3´-fosfaatin, johon 3´-OH pystyy hyökkäämään.41 Myöhemmin karbodi-imidien on todettu aktivoivan adenosiinin kondensaatioreaktiota poly(U) ollessa templaattina. Päätuotteena on 2´,5´- sidos,42 koska todennäköisesti 3´-OH ei ole niin nukleofiilinen kuin 2´-OH steeristen syiden takia.43 Ongelmaa ei ratkaise 2´-deoksinukleotidien käyttö, koska reaktiossa tuotteena on 5´,5´-dinukleosidifosfaatti.44 Kuva 5. Karbodi-imidit 3 ja 4. 10 1.4.1 Fosfaattiosan modifikaatiot 2-Metyyli-imidatsoli (2-MeIm) 5 (Kuva 6 A) tehostaa alukkeen jatkumista. 2-MeIm:lla aktivoidun guanosiini-5´-monofosfaatin ja templatoivan poly(C):n reaktiossa muodostuu pitkiä ja pääasiassa 3´,5´-linkittyneitä oligonukleotideja alhaisessa lämpötilassa ja neutraalissa pH:ssa.45 Na+- ja Mg2+-ionien konsentraatio vaikuttaa merkittävästi reaktion tehokkuuteen ja regioselektiivisyyteen.45 2-MeIm:n katalyyttinen vaikutus perustuu todennäköisesti siihen, että se muodostaa neutraalissa pH:ssa imidatsolisiltaisen dinukleotidi-intermediaatin (Kuva 6 B).46–48 2-MeIm:lla tehdyt reaktiot ovat kuitenkin hitaita ja ne toimivat parhaiten templaateilla, joissa on paljon sytosiinia.7 Muita nukleoemäksiä sisältävillä templaateilla saanto on heikko ja joitain sekvenssejä ei voida kopioida lainkaan.49 Kuva 6. A) 2-Metyyli-imidatsoli ja B) imidatsolisiltainen dinukleotidi-intermediaatti. Intermediaatti piirretty mukaillen Walton et al.46 Liian suuri substituentti imidatsolijohdannaisten 2-asemassa hidastaa alukkeen jatkumista.50 Reaktion nopeus laskee myös silloin, kun lähtevän ryhmä pKa-arvo pienenee. 2-metyylipyrrolilla 6 aktivoidut guanosiinimonofosfaatit eivät pysty katalysoimaan ei-entsymaattista replikointia. Tämä viittaa siihen, että vierekkäisten lähtevien ryhmien pinoutuminen tai vetysitoutumiseen kykenevä aminoryhmä eivät yksistään riitä ei-entsymaattisen reaktion katalysointiin. 2-metyyliaminoimidatsoli 7 ei katalysoi reaktiota todennäköisesti liian suuren steerisen esteen vuoksi. 2- Aminoimidatsolilla (2-AmIm) 8 aktivoidut guanosiinimonofosfaatit saivat 2-metyyli- imidatsolilla aktivoitujen sytosiinimonomeerien liittymään ribonukleotidiketjuun seitsemän kertaa nopeammin verrattuna 2-MeIm:lla aktivoituihin sytosiinimonomeereihin. Todennäköisesti 2-AmIm nopeuttaa 2-aminoimidatsolisiltaisen dinukleotidi-intermediaatin muodostumista, koska 2-AmIm:n N3 on nukleofiilisempi kuin 2-MeIm:n N3.50 RNA:n replikoimisessa AU ja UA sekvenssit ovat vaikeita kopioida49 mutta käyttämällä 2-AmIm:lla aktivoituja kanonisia nukleotideja näitä 11 sekvenssejä sisältävät templaatit voitiin kopioida yli 85 %:n saannolla vuorokaudessa.50 Rakenteet on esitetty kuvassa 7. Kuva 7. 2-Metyylipyrroli 6, 2-metyyliaminoimidatsoli 7 ja 2-aminoimidatsoli 8. Hydroksibentsotriatsolilla 9 (Kuva 8) aktivoidut ribonukleotidit jatkavat muokkaamatonta RNA-aluketta nopeammin kuin 2-metyyli-imidatsolilla aktivoidut ribonukleotidit.34 Optimaalinen pH reaktiolle on 8,9, mikä todennäköisesti johtuu asemassa 7 olevan atsatypen emäksisisyydestä.34 Pyridiini katalysoi reaktiota korkeissa millimolaarisissa konsentraatioissa.8 Oksiatsabentsotriatsolit voivat parantaa nukleotidin sitoutumista templaatti/aluke–dupleksiin.39 Kuva 8. Hydroksibentsotriatsoli 9. 1.4.2 Emäsmodifikaatiot Luonnollisista deoksinukleotideista tymidiinin monofosfaatti kopioituu usein virheellisesti ei-entsymaattisessa replikaatiossa, koska se emäspariutuu heikosti ja muodostaa wobble-emäsparin guaniinin kanssa.1 Aktivoitu tymidiinin etynyylipyridonianalogi 10 (Kuva 9) jatkaa aluketta aktivoituun tymidiiniin verrattuna 5,3 kertaa nopeammin. Analogi ei inhiboi muiden nukleoemäksien liittymistä alukkeeseen eikä analogin liittyminen alukkeeseen huononna seuraavaan nukleoemäksen liittymisen tarkkuutta.1 Diaminopuriini 11 voi muodostaa kolme vetysidosta urasiilin kanssa. Sen käyttö adeniinin sijaan nukleoemäksenä nopeuttaa 2-metyyli-imidatsolilla aktivoidun urasiilin liittymistä ketjuun.51 Diaminopuriinin templatoima reaktio on noin kolme kertaa tehokkaampi kuin vastaava adeniinin templatoima reaktio.51 2-metyyli-imidatsolilla aktivoitu diaminopuriinimonomeeri myös jatkaa aluketta tehokkaammin kuin 12 adeniinimonomeeri, kun tymiini on templatoiva emäs.52 Diaminopuriini toimii erityisen hyvin yhdistettynä 5-propynyyliurasiiliin 12.53 Kuva 9. Etynyylipyridoni 10, diaminopuriini 11 ja 5-propynyyliurasiili 12. 1.5 2´-Metoksiaminoryhmä 2´-Metoksiaminoryhmän toimintaa on tutkimusryhmässämme tutkittu 2´-N- (metoksi)aminoryhmällä modifioitujen oligonukleotidien ja peptidialdehydien välisessä reaktiossa.54,55 Reaktiossa muodostuu N-metoksioksatsolidiini oligonukleotidin ja peptidin välille. Kun pH on hieman hapan, reaktio on reversiibeli ja dynaaminen. pH:ssa 7 tuotteet ovat pysyviä. Tämän työn tarkoituksena oli selvittää 2´-metoksiaminoryhmän vaikutusta molekyylinsisäisenä nukleofiilisena katalyyttinä fosfodiesterisidoksen muodostumisessa. Kokeellisessa osiossa tutkittiin 2´-deoksi-2´-(metoksiamino)uridylyyli-3´,5´-tymidiinin (2´-N-UpT) (13) (Kuva 10) hydrolyysireaktioita. Lisäksi tutkittiin fosforami- daattisidoksen muodostumista vesiliuoksessa käyttäen imidatsolilla aktivoitua tymidiinin monofosfaattia (14) Työssä yritettiin myös kehittää synteesimenetelmä 2´-deoksi-2´- (metoksiamino)uridylyyli-2´,5´-tymidiini-(2´-N-fosforamidaatin) 15 syntetisoimiseksi käyttämällä silyyli- ja dimetoksitrityylisuojauksia 5´- ja/tai 3´-asemissa. Kuva 10. 2´-Deoksi-2´-(metoksiamino)uridylyyli-3´,5´-tymidiini 13, tymidiini-5′-O-(2- metyyli-imidatsoli)monofosfaatti 14 ja 2´-deoksi-2´-(metoksiamino)uridylyyli-2´,5´- tymidiini-(2-N-fosforamidaatti) 15. 13 1.6 Yhteenveto Ei-entsymaattisessa templatoidussa replikaatiossa alukkeen nukleofiilinen ryhmä reagoi aktivoidun nukleotidin elektrofiilisen ryhmän kanssa. Reaktiossa syntyy pentavalentti intermediaatti, joka hajoaa Westheimerin sääntöjen mukaisesti. On havaittu, että imidatsolilla aktivoidut nukleotidit reagoivat imidatsolisiltaisen intermediaatin kautta. Templaattivaikutusta tehostaa emäspinoutuminen, oligonukleotidin A-muotoinen konformaatio, suurempi määrä vetysidoksia templatoivan emäksen ja aktivoidun nukleotidin emäksen välillä, avustavan oligonukleotidin käyttö, templaatin immobilisaatio ja templaatin substituointi lipofiilisillä ryhmillä. Vapaat nukleotidit kiinnittyvät templaattiin paremmin alukkeita käytettäessä, koska vapaiden nukleotidien ja alukkeen emäkset voivat emäspinoutua. Aluke/templaatti- dupleksi ei ole kovin stabiili, koska reaktioissa käytetyt ketjut ovat lyhyitä. Dupleksin labiiliuden takia reaktioissa käytetään matalia lämpötiloja ja templaattien ylimäärää alukkeisiin verrattuna. Lisäksi hydroksyyliryhmien korvaaminen aminoryhmillä nopeuttaa reaktiota. 2-Metyyli-imidatsolilla aktivoidut nukleotidit tehostavat alukkeen jatkamista. 2- Aminoimidatsolilla aktivoidut ribonukleotidit ja hydroksibentsotriatsolilla aktivoidut ribonukleotidit ovat 2-metyyli-imidatsoleja tehokkaampia jatkamaan aluketta. Liian suuri substituentti imidatsolijohdannaisen 2-asemassa ja liian pieni lähtevän ryhmän pKa-arvo hidastavat ei-entsymaattista replikaatiota. Ei-entsymaattisen replikaation tehokkuutta voidaan parantaa myös käyttämällä muokattuja nukleoemäksiä. Diaminopuriini adeniinin sijasta nopeuttaa alukkeen jatkoa, kun käytetään 2-metyyli-imidatsolilla aktivoitua urasiilia. Diaminopuriini yhdistettynä 5- propynyyliurasiiliin tehostaa ei-entsymaattista replikaatiota erityisen paljon. 2 Tulokset ja niiden tarkastelu 2.1 2´-Deoksi-2´-(metoksiamino)uridylyyli-3´,5´-tymidiinin hydrolyyttiset reaktiot 2´-Deoksi-2´-(metoksiamino)uridylyyli-3´,5´-tymidiinin (13) hydrolyyttisiä reaktioita seurattiin vesiliuoksissa 90 ℃:n lämpötilassa pH-alueella 1–11,2. Reaktioiden etenemistä 14 seurattiin nestekromatografisesti käyttäen eluentteina trietyyliammoniumasetaattia ja asetonitriiliä. Muodostuneet hajoamistuotteet tunnistettiin nestekromatografisesti vertailemalla kaupallisten referenssiyhdisteiden retentioaikoja havaittujen tuotteiden retentioaikoihin ja/tai massaspektrometrisesti. 2.1.1 Tuotejakauma Happamissa olosuhteissa (pH 1–2) 2´-deoksi-2´-(metoksiamino)uridylyyli-3´,5´- tymidiini (13) pilkkoutuu (Kaavio 2, Reitti A) mitä todennäköisimmin syklisen 2´-deoksi- 2´-(metoksiamino)uridiini-2´,3´-monofosfaatin 14 kautta tymidiiniksi (16) ja 2´-deoksi- 2´-(metoksiamino)uridiini-3´-monofosfaatiksi (17; 2´-NHOMeUrd-3´-P), joka defosforyloituu edelleen 2´-deoksi-2´-(metoksiamino)uridiiniksi (18). Reaktiossa voi muodostua myös 2´-N-fosforamidaatti 19. Huomionarvoista kuitenkin on, että happamissa olosuhteissa P-N-sidoksen tiedetään olevan labiili,56 joten reaktiossa mahdollisesti muodostuvaa 2´-N-fosforamidaattia 19 eikä syklistä fosforamidaattia 14 havaittu akkumuloituvan. Depyridiminaatio urasiiliksi (20; Reitti C) ja tymiiniksi (21; Reitti B) kilpailee pilkkoutumisen kanssa. Esimerkiksi pH:ssa 1 muodostuu urasiilia 3 % ja tymiiniä 28 % (Kuva 11). Kaavio 2. Dimeerin 13 hydrolyyttiset reaktiot happamissa olosuhteissa. 15 Kuva 11. Tuotejakauma pH:ssa 1. Tummansininen kolmio = dimeeri 13, vihreä neliö = tymidiini, pinkki kolmio = fosfaatti 17 tai 19, punainen ympyrä = tymiini, sininen kolmio = 2´-NHOMeUrd 18, musta neliö = urasiili. Lievästi happamissa olosuhteissa (pH 3–5) tuotejakauma on monimutkainen. Depyrimidinaatio urasiiliksi (20) ja tymiiniksi (21) kilpailee selkeästi pilkkoutumisen kanssa. Esimerkiksi pH:ssa 5 havaitaan kahden puoliintumisajan jälkeen urasiilia 22 % ja tymiiniä 7 %. Lisäksi havaitaan lähtöaineen alkoksiamiiniryhmän hapettuminen oksiimieetteriksi, jolloin muodostuu dinukleosidifosfaatti 22 (Kuva 12). Huomionarvoista on, että hapettuminen tapahtui myös ditiotreitolin läsnäollessa. Siirryttäessä pH:sta 3 vähemmän happamampiin reaktioliuoksiin yhdisteen 22 osuus kasvaa, ollen selkeä päätuote pH:ssa 6 (Kuva 13). Vain pieniä määriä (< 10 %) havaitaan urasiiliä (20), tymiiniä (21) ja tymidiiniä (16). pH:ssa 3 havaitaan myös yhdiste, joka massa-analyysin mukaan sopisi dinukleosidifosfaatiksi (23; UpT). Lähtöaineen 13 isomeraatiota dinukleosidi-2´,5´-(2´-N-fosforamidaatiksi) 15 ei havaita happamissa olosuhteissa. 16 Kuva 12. Molekyylirakenteet lähtöaineen 13 hapettuneelle oksiimieetterille 22 ja dinukleosidifosfaattille UpT 23. Kuva 13. Tuotejakauma pH:ssa 6. Pinkki kolmio = yhdiste 13, vihreä neliö = yhdiste 22, musta neliö = urasiili, sininen kolmio = tymidiini, punainen ympyrä = tymiini. Emäksisissä olosuhteissa (pH 10,2–11,2) depyridimidaatio on vallitseva reaktio. Päätuotteina havaitaan urasiili (20) ja tymidiini-5´-monofosfaatti (24; TMP, Kaavio 3, Reitti C). Urasiilin irtoaminen tuottaa syklisen oksokarbeniumionin, johon vesi hyökkää. Muodostuneen välituotteen 25 eliminaatioreaktio tuottaa 4,5-dihydroksi-2- (metoksiamino)pent-2-enaalin (26, Kuva 14) ja 5´-TMP:n (24) (katso mekanismikappale 2.1.3). Urasiilia sekä myös tymiiniä voi mahdollisesti muodostua myös Reitin A kautta. 17 Fosforidiesterisidoksen intermolekulaarinen hydrolyysi 5´-TMP:ksi on epätodennäköistä, koska tuotteita 17 tai 18 ei havaita (Reitti B). Näin ollen tymidiini muodostuu mitä todennäköisemmin 5´-TMP:n defosforylaation kautta. Tuotejakauma pH:ssa 11,2 on esitetty kuvassa 15. Massa-analyyseissä havaitut massat on esitetty taulukossa 1. Kuva 14. Emäksisissä olosuhteissa muodostuva hajoamistuote 26. Taulukko 1. Dimeerin 13 hydrolyysin tutkimuksen massa-analyyseissa havaitut massat. Yhdiste m/z [M+H]+ m/z [M+Na]+ m/z [M-H]- 16 265,1 241,1 17 354,0 352,1 18 274,0 20 113,1 22 574,1 23 547,0 26 184,1 18 Kaavio 3. Dimeerin 13 hydrolyyttiset reaktiot emäksisissä olosuhteissa. Kuva 15. Tuotejakauma pH:ssa 11,2. Vihreä neliö = yhdiste 13, sininen kolmio = TMP, musta neliö = urasiili, pinkki kolmio = tymidiini, punainen ympyrä = tymiini. 19 2.1.2 pH-nopeusprofiili Dimeerin 13 hydrolyysin pH-nopeusprofiili pH-alueella 1–11,2 on esitetty kuvassa 16 ja osareaktioille kuvassa 17. Dimeerin 13 kokonaishäviämisen ja osareaktioiden nopeusvakiot sekä puoliintumisajat on esitetty taulukossa 2. Lähtöaineen pilkkoutuminen noudattaa happamissa olosuhteissa (pH 1–2) ensimmäisen kertaluvun kinetiikkaa hydroniumionin konsentraation suhteen. Pilkkoutuminen on pH:sta riippumatonta, kun pH on > 2. Havaitut depyridiminaatioiden nopeudet ovat lähes pH:stä riippumattomia. Depyrimidinaatio urasiiliksi on nopeampi reaktio kuin tymiinin irtoaminen, mikä on sopusoinnussa aikaisempien tutkimuksien kanssa.57 Esimerkiksi, lievästi happamissa olosuhteissa urasiili irtoaa noin kaksi kertaa nopeammin kuin tymiini, kun emäksisissä olosuhteissa urasiilin irtoaminen on noin seitsemän kertaa nopeampaa kuin tymiinin irtoaminen. Dimeerin 13 hapettumisen nopeusvakio pH:ssa 6 on 6,55 x 10-7 s-1. Kuva 16. pH-nopeusprofiili lähtöaineen 13 kokonaishäviämiselle. 20 Kuva 17. pH-nopeusprofiili lähtöaineen 13 osareaktioille. Musta neliö = pilkkoutuminen, punainen ympyrä = urasiilin irtoaminen, sininen kolmio = tymiinin irtoaminen, pinkki kolmio = lähtöaineen hapettuminen Taulukko 2. Havaitut lähtöaineen 13 kokonaishäviämisen ja osareaktioiden nopeusvakiot sekä puoliintumisajat lämpötilassa 90 ℃. pH khav / 10-6 s-1 t1/2, hav / h kpilkk / 10-6 s-1 kura / 10-6 s-1 kthy / 10-6 s-1 khap / 10-6 s-1 1 25,9 7,45 22,2 2 4,24 45,2 3,30 0,618 0,327 3 2,93 65,6 2,20 2,64 0,253 3,5 0,900 214 5 1,25 154 0,575 0,380 0,119 0,176 6 0,694 301 0,655 9 0,615 313 10,2 0,760 253 0,665 0,095 11,2 0,846 228 0,709 0,137 21 2.1.3 Reaktiomekanismit Happokatalyyttinen pilkkoutuminen. 2´-Deoksi-2´-(metoksiamino)uridylyyli-3´,5´- tymidiinin (13) 2´-metoksiaminoryhmän pKa-arvo on noin 4,8.58 Näin ollen vallitseva ionimuoto happamissa olosuhteissa (pH < 5) on neutraali kahtaisioni. Reaktion ollessa 1. kertalukua hydroniumionin konsentraation suhteen, reaktiivinen ionimuoto on monokationi. Mekanistisesti, P-N-sidoksen pilkkoutumisessa protoni siirtyy nopeassa esitasapainossa 2´-metoksiaminon typeltä fosfodiesterisidoksen hapelle (Kaavio 4). 2´- Aminometoksiryhmän typen hyökätessä fosforiin muodostuu syklinen pentakoordinatiivinen fosforaanivälituote. Nopeutta rajoittavassa vaiheessa 5´-O protonoituu ja muodostunut syklinen välituote I hajoaa Westheimerin sääntöjen4 mukaisesti P-O-sidoksen katketessa apikaalisesta asemasta sykliseksi fosforamidaatiksi 14, joka hydrolysoituu edelleen mitä todennäköisimmin 2´-deoksi-2´- (metoksiamino)uridiini-3´-monofosfaatin kautta (17) 2´-deoksi-2´- (metoksiamino)uridiiniksi) (18). Kaavio 4. Happokatalyyttinen pilkkoutuminen. Piirretty mukaillen Ora et al.56 pH:sta riippumaton pilkkoutuminen. pH-nopeusprofiilin perusteella pilkkoutuminen on pH:sta riippumattonta lievästi happamissa olosuhteissa (pH > 2). Näissä olosuhteissa reaktio tapahtuu näin ollen neutraalin ionimuodon kautta. Eräs mekanismivaihtoehto on protonin siirto veden välityksellä typeltä hapelle (Kaavio 5). Tämän jälkeen 2´-N hyökkää 22 apikaalisesta asemasta fosforiin muodostaen pentakoordinatiivisen fosforaanivälituotteen. P-O5´-sidoksen katketessa 5´-hapen protonoituessa, tymidiini irtoaa ja muodostuu syklinen intermediaatti 14, joka hydrolysoituu edelleen aminouridiiniksi. Kaavio 5. pH:sta riippumaton pilkkoutuminen. Piirretty mukaillen Ora et al.56 pH:sta riippumaton depyrimidinaatio. N-Glykosidisen sidoksen hydrolyysin todettiin olevan pH:sta riippumaton pH-alueella 2–5. Todennäköisesti nukleosidin emäksen irtoaminen unimolekulaarisesti tuottaa syklisen oksokarbeniumionin, johon vesi hyökkää (Kaavio 6). Mekanismi eroaa happokatalysoidulle N-glykosidisen sidoksen katkeamiselle ehdotetusta mekanismista, joka tapahtuu todennäköisemmin renkaan aukeamisella O4´- hapen protonaation jälkeen (Kaavio 7).59 Kaavio 6. pH:sta riippumaton depyrimidinaatio. Piirretty mukaillen Ora et al.60 23 Kaavio 7. Depyrimidinaatio hapossa. Piirretty mukaillen Oivanen et al.59 Emäksisissä olosuhteissa (pH 10-11) havaittiin, että N-glykosidisen sidoksen katkettua ja oksokarbeniumionin hydrolysoiduttua sokerirengas aukeaa eliminaatiomekanismilla 4,5- dihydroksi-2-(metoksiamino)pent-2-enaaliksi (26) ja 5´-TMP:ksi (24) (Kaavio 8). Kaavio 8. Urasiilin irtoaminen ja sitä seuraava eliminaatioreaktio emäksessä. Piirretty mukaillen Gatesin artikkelista.61 2.2. 2´-Deoksi-2´-(metoksiamino)uridylyyli-2´,5´-tymidiini-(2´-N-fosforamidaatin) synteesit 2´-Deoksi-2´-(metoksiamino)uridylyyli-2´,5´-tymidiini-(2´-N-fosforamidaatin) 15 syntetisoimiseksi käytettiin P(III)- ja P(V)-kemiaa. Fosforamidiittimenetelmää käytettäessä lähtöaineena kytkennässä oli 5´-(4,4´-dimetoksitrityyli)-3´-tert- butyylidimetyylisilyyli-2´-deoksi-2´-(metoksiamino)uridiini (29; Kaavio 9 A) tai 2´- 24 deoksi-2´-(metoksiamino)-3´,5´-O-(1,1,3,3-tetraisopropyylidisiloksaani-1,3- diyyli)uridiini (30; Kaavio 9 B) sekä kaupallinen 5´-(4,4´-dimetoksitrityyli)-tymidiini-5´- fosforamidiitti (31). P(V)-kemiaa sovellettaessa tymidiini-5´-monofosfaatti aktivoitiin metyyli-imidatsolilla fosforimidatsolidiksi 14 ja kytkentä suoritettiin vesiliuoksessa (Kaavio 9 C). Kaavio 9. Dinukleosidifosforamidaatin 15 yleinen synteesikaavio. 2.2.1 Fosforimidatsolistrategia Tymidiinimonofosfaatin dinatriumsuola 24 muutettiin pyridinium-muotoisella Dowex- ioninvaihtohartsilla tymidiinimonofosfaatin dipyridiniumsuolaksi 32 (Kaavio 10). Yhdiste 32 aktivoitiin liittämällä sen fosfaattiosaan 2-metyyli-imidatsoli DMSO:ssa. Seuraavassa vaiheessa oli tarkoitus korvata vesiliuoksessa tymidiini-5′-O-(2-metyyli- imidatsoli)monofosfaatin 14 imidatsoliryhmä 2´-deoksi-2´-(metoksiamino)uridiinilla 18 dinukleosidi-2´,5´-(2´-N-fosforamidaatin) 15 muodostamiseksi. Kytkentää seurattiin vesiliuoksissa 25 oC:ssa pH:ssa 5, 7 ja 9. Yhdisteen 14 havaittiin hydrolysoituvan pääasiassa tymidiini-5′-monofosfaatiksi (24) (Kaavio 11) kaikissa tutkituissa reaktioliuoksissa. Lisäksi havaittiin pieni määrä dimeeriä 33 (3-5 %) pH:ssa 5 ja 7 (Kaavio 12). Yhdisteen 14 hydrolyysi on pH:ssa 7 (t1/2 = 60,4 h) 1,3–kertaisesti hitaampi 25 kuin pH:ssa 5 (t1/2 = 46,5 h). Reaktio hidastuu edelleen emäksisissä olosuhteissa, ja pH:ssa 9 (t1/2 = 101 h) hydrolyysi on 1,67–kertaisesti hitaampi kuin pH:ssa 7. Yhdisteen 14 hajoamisen nopeusvakiot ja puoliintumisajat ovat koottuina taulukossa 3. Nukleosidin typpiatomin nukleofiilistä hyökkäystä fosforiatomiin ei havaittu. Taulukko 3. Ensimmäisen kertaluvun nopeusvakiot ja puoliintumisajat yhdisteen 14 hydrolyysille lämpötilassa 25 ℃. pH k / 10-6 s-1 t1/2 / h 5 4,14 46,5 7 3,19 60,4 9 1,89 102 Kaavio 10. Dinukleosidi-2´,5´-(2´-N-fosforamidaatin) 15 synteesi käyttäen fosforimidatsolistrategiaa. i) pyridiniummuotoinen Dowex-ioninvaihtohartsi ii) 2- metyyli-imidatsoli, trifenyylifosfiini, 2,2´-dipyridylsulfidi, TEA, DMSO iii) H2O Kaavio 11. Yhdisteen 14 hydrolyysi. 26 Kaavio 12. Tymidiini-5′-O-(2-metyyli-imidatsoli)monofosfaatin 14 dimeroituminen. 2.2.2 TBDMS-suojaryhmästrategia 4,4´-Dimetoksitrityyli-2´-deoksi-2´-(metoksiamido)uridiinin 34 3´-hydroksyyliryhmä suojattiin tert-butyylidimetoksisilyylillä käsittelemällä yhdistettä 34 tert- butyylidimetoksisilyylikloridilla pyridiinissä (Kaavio 13). 3´-O-TBDMS- suojaryhmästrategiassa 5´-(4,4´-dimetoksitrityyli-3´-tert-butyylidimesilyyli-2´-deoksi- 2´-(metoksiamino)uridiini (29) kytkettiin dimetoksitrityyli-suojatun tymidiini-5´- fosforamidiitin 31 kanssa asetonitriilissä käyttäen aktivaattorina 5-(bentsyylitio)–1H– tetratsolia. Fosfiitin hapettamiseksi fosfaatiksi 35 käytettiin jodin vesiliuosta. Haluttua tuotetta ei kuitenkaan muodostunut. Kaavio 13. Dinukleosidi-2´,5´-(2´-N-fosforamidaatin) 15 synteesi käyttäen TBDMS- suojaryhmästrategiaa. i) TBDMSCl, pyridiini ii) 5-(bentsyylitio)–1H–tetratsoli, MeCN iii)Oxidizer tai I2, THF, H2O, 2,6-lutidiini 27 2.2.3 Markiewicz-suojaryhmästrategia 2´-Deoksi-2´-(metoksiamino)uridylyyli-2´,5´-tymidiini-(2´-N-fosforamidaatin) syntetisoimiseksi 2′-deoksi-2′-(metoksiamino)uridiini 18 silyloitiin 1,3-dikloro-1,1,3,3- tetraisopropyylidisiloksaanilla pyridiinissä (Kaavio 14). 2´-Deoksi-2´-(metoksiamino)- 3´,5´-O-(1,1,3,3-tetraisopropyylidisiloksaani-1,3-diyyli)uridiini (30) kytkettiin dimetoksitrityyli-suojatun tymidiini-5´-fosforamidiitin 31 kanssa asetonitriilissä käyttäen aktivaattorina 5-(bentsyylitio)–1H–tetratsolia ja fosfiitti hapetettiin jodin vesiliuoksella vastaavaksi fosfaatiksi 36. Tuotetta ei kuitenkaan havaittu muodostuvan. Kaavio 14. Dinukleosidi-2´,5´-(2´-N-fosforamidaatin) 15 synteesi käyttäen Markiewicz- suojaryhmästrategiaa. i) pyridiini ii) 5-(bentsyylitio)–1H–tetratsoli, MeCN iii) I2, THF, H2O, 2,6-lutidiini 3 Johtopäätökset ja yhteenveto 2´-Deoksi-2´-(metoksiamino)uridylyyli-3´,5´-tymidiinin (13) hydrolyyttisiä reaktioita seurattiin vesiliuoksissa 90 ℃:n lämpötilassa pH-alueella 1–11,2. Happamissa olosuhteissa dimeerin pilkkoutuminen ja depyrimidinaatio kilpailevat. Lievästi happamissa olosuhteissa depyrimidinaatio kilpailee selkeästi pilkkoutumisen kanssa. 28 Lievästi happamissa olosuhteissa dimeeri myös hapettuu ja hapettuminen on pääreaktio pH:ssa 6. Emäksisissä olosuhteissa depyrimidinaatio on vallitseva reaktio. Dinukleosidi-2´,5´-(2´-N-fosforamidaatin) 15 synteesiyritykset eivät onnistuneet. 2- NHOMeUrd:n 18 metoksiaminoryhmän nukleofiilista hyökkäystä tymidiini-5′-O-(2- metyyli-imidatsoli)monofosfaatin 14 fosforiin ei havaittu. Vesiliuoksessa tymidiini-5′-O- (2-metyyli-imidatsoli)monofosfaatin 14 havaittiin hydrolysoituvan 5´-TMP:ksi. Käytettäessä TBDMS- ja Markiewicz-suojaryhmästrategioita dinukleosidi-2´,5´-(2´-N- fosforamidaatin) 15 muodostumista tuotteena ei havaittu. Syynä saattaa olla yhdisteiden 35 ja 36 nopea hydrolyyttinen hajoaminen hapetettaessa. Tutkimustulosten mukaan metoksiaminoryhmä ei katalysoinut fosfodiesterisidoksen muodostumista. Voidaankin olettaa, että metoksiaminoryhmä on vähemmän nukleofiilinen kuin mitä arvioitiin tai metoksiaminoryhmä saattaa myös olla niin hyvä lähtevä ryhmä, ettei pysyviä tuotteita muodostu. 4 Kokeelliset menetelmät 4.1 Yleiset menetelmät Asetonitriili ja 5-(bentsyylitio)tetratsoli kuivattiin 3 Å molekyyliseuloilla. Pyridiini kuivattiin 4 Å molekyyliseuloilla. Kiinteät reagenssit kuivattiin vakuumieksikkaattorissa fosforipentoksidin kanssa. NMR-spektrit mitattiin Bruker 500 MHz AVANCE-III – NMR-spektrometrillä. Massaspektrit mitattiin Agilent 6120 kvadrupoli LC-ESI-MS:llä. Kinetiikkatutkimuksissa reaktioiden etenemistä seurattiin PerkinElmer Flexar HPLC:llä käyttäen Hypersil C18 kolonnia (4,6 x 250 mm x 5 μm). 4.2 2´-Deoksi-2´-(metoksiamino)uridylyyli-3´,5´-tymidiinin kineettiset mittaukset 2´-Deoksi-2´-(metoksiamino)uridylyyli-3´-5´-tymidiinin 13 hydrolyysiä seurattiin vesiliuoksissa 90 ℃:n lämpötilassa pH-alueella 1–11.2. Reaktioliuosten hydroniumionin konsentraatio laskettiin kirjallisuudesta löytyvien pKa-arvojen perusteella ja säädettiin vetykloridilla, formaatti-, asetaatti- HEPES-, MES-, glysiini ja fosfaatti-puskureilla ((pH = 1; 0,1 M HCl), (pH = 2; 0,01 M HCl), (pH = 3; 0,05 M/0,01 M HCOOH/HCOONa), (pH = 4; 0,02 M/0,04 M HCOOH/HCOONa), (pH = 5; 0,02 M/0,04 M CH3COOH/CH3COONa), (pH = 6; 0,048 M/0,012 M HEPES/HEPESNa), (pH = 7; 0,02 M/0,04 M HEPES/HEPESNa), (pH = 8; 0,04 M/0,02 M Gly/GlyNa), (pH = 9; 29 0,01 M/0,05 M Gly/GlyNa), (pH = 10,2; 0,044 M/0,016 M K2HPO4/ K2PO4Na) ja (pH = 11,2; 0,013 M/0,047 M K2HPO4/ K2PO4Na). Reaktioliuosten ionivahvuudet säädettiin 0,1 M:iin NaCl:n avulla. Temperoituun reaktioliuokseen (1980 µl) lisättiin 20 µl yhdisteen 13 kantaliuosta. Reaktionäytteet (130 µl) otettiin sopivin väliajoin ja pysäytettiin jäähdyttämällä jäävesihauteessa sekä neutraloimalla joko natriumasetaatilla tai etikkahapolla (pH 1 26 µl 2 M AcONa; pH 2 20 µl 0,2 M AcONa; pH 3 10 µl 2 M AcONa; pH 3,5 9 µl 2 M AcONa; pH 4 8 µl 2 M AcONa; pH 5 5 µl 2 M AcONa; pH 9 5 µl 2 M CH3COOH; pH 10,2 3 µl 2 M CH3COOH ja pH 11,2 8 µl 2 M CH3COOH). Reaktion etenemistä seurattiin RP-HPLC:llä käyttäen eluentteina trietyyliammoniumasetaattia (50 mM) ja asetonitriiliä. Asetonitriilin pitoisuutta kasvatettiin ensimmäisen kolmen minuutin aikana kahteen prosenttiin, minkä jälkeen asetonitriilin pitoisuutta nostettiin seuraavan 30 min aikana 50 %:iin. Injektiotilavuus oli 45 µl:aa. Detektioaallonpituus oli 266 nm. Hydrolyysissä muodostuneet hajoamistuotteet identifioitiin vertailemalla retentioaikoja kaupallisiin referensseihin tai massaspektrometrisesti. Massa-analyysissä asetonitriilin pitoisuus nostettiin ensimmäisen 10 min aikana 2 %:iin ja sitten seuraavien 30 min aikana 60 %:iin. Eluentteina käytettiin muuraishapon vesiliuos (0,1 %) ja asetonitriiliä. Pseudo-ensimmäisen kertaluvun nopeusvakiot lähtöaineen 13 häviämiselle laskettiin käyttäen integroitua 1. kertaluvun nopeusyhtälöä (kaava 1). ln[𝟏𝟑]𝑡 = −𝑘1𝑡 + ln[𝟏𝟑]0 (1) Reaktioiden puoliintumisajat laskettiin kaavalla 2. 𝑡1/2 = ln 2 𝑘 (2) Osareaktioiden nopeusvakiot laskettiin kaavalla 3, jossa [13]0 ja [13]t ovat lähtöaineen konsentraatiot reaktion alussa ja hetkellä t. Kaavassa 3 x tarkoittaa yhdisteen 18, 21 tai 24 konsentraatiota ajanhetkellä t korjauskerroin huomioituna (x = 2 x 18, 2 x 21 tai 2 x 24). 𝑘𝑥 = [𝑥] [𝟏𝟑]0−[𝟏𝟑]𝑡 (3) 30 4.3 Tymidiini-5′-O-(2-metyyli-imidatsoli)monofosfaatti Kaavio 15. Reagenssit: 2-metyyli-1H-imidatsoli, TEA, trifenyylifosfiini, 2,2´- dipyridylsulfidi Synteesissä noudatettiin aiemmin julkaistua menetelmää (Kaavio 15).35 Tymidiini-5´- monofosfaatin dinatriumsuola 24 (0,825 mmol, 302 mg) muutettiin pyridiniummuotoon 32 käyttäen pyridiniummuotoon muutettua Dowex 50W X8 ioninvaihtohartsia. Yhdiste 24 liuotettiin veteen (3 ml), siirrettiin ioninvaihtopylvääseen ja eluoitiin vedellä. UV- aktiiviset fraktiot yhdistettiin ja haihdutettiin kuiviin alipaineessa. Haihdutusjäännös haihdutettiin alipaineessa kuivasta pyridiinistä (2 x 10 ml). Haihdutusjäännös kuivattiin vakuumieksikkaattorissa. Saanto oli 306 mg (76,2 %). Tymidiini-5´-monofosfaatin dipyridiniumsuola 32 (399 mg, 0,828 mmol) liuotettiin DMSO:hon (9,4 ml) ja reaktioliuokseen lisättiin 2-metyyli-1H-imidatsoli (1,093 g, 13,31 mmol), TEA (270 μl, 1,94 mmol), trifenyylifosfiini (763 mg, 2,91 mmol) ja 2,2´-dipyridylsulfidi (611 mg, 2,77 mmol) typpisuojakaasussa. Seoksen annettiin reagoida 2 h ajan. Reaktioseos lisättiin typpisuojakaasussa pisaroittain jääkylmän NaClO4 ∙ H2O (185 mg, 1,32 mmol), kuivan asetonin (82 ml) ja kuivan eetterin (52 ml) liuokseen ja liuosta sekoitettiin 20 min jäähauteessa. Muodostunut sakka suodatettiin, ja sitä pestiin asetoni:eetteri- liuoksella (4 x 50 ml, 1:1, v/v) kunnes sakan keltainen väri katosi. Sakka kuivattiin vakuumieksikkaattorissa. Tuotteen 14 saanto oli 177 mg (55,4 %). 1H NMR (DMSO-d6, 500MHz): δ =11.24 (1H, s, NH) 7.76 (1H, s, H6), 7.10 (1H, s, imidatsoli), 6.72 (1H, s, imidatsoli), 6.19 (1H, t, J = 5 Hz, H4´), 5.29 (1H, s, 3´-OH), 4.17 (1H, s, H3´), 3.79 (1H, s, H1´), 3.69 (2H, t J = 10 Hz, H5´, H5´´), 2.42 (3H, s, CH3 imidatsoli), 2.09 (2H, m, J = 5 Hz, H2´, H2´´), 2.03 (1H, m, J = 5 Hz, P-OH), 1.82 (3H, s, CH3 tymiini). 13C NMR (DMSO-d6, 500 MHz): δ = 164.24, 150.97, 146.80, 143.88, 136.59, 124.51, 122.45, 110.25, 86.10, 84.21, 71.35, 65.38, 31.16, 14.94, 12.10. 31 4.4 2´-Deoksi-2´-(metoksiamino)uridylyyli-2´,5´-tymidiini-(2´-N-fosforamidaatin) synteesi fosforimidatsoli-strategialla vesiliuoksessa Kaavio 16. Reagenssit: i) H2O 2´-Deoksi-2´-(metoksiamino)uridiinin 18 kytkentäreaktioita (Kaavio 16) seurattiin 25 ℃:ssa puskuriliuoksissa pH:ssa 5,5 (0,16 M/0,04 M MES/MesNa), 7 (0,15 M/0,05 M HEPES/HEPESNa) ja 7,9 (0,06 M/0,14 M HEPES/HEPESNa). Puskuriliuosten ionivahvuus säädettiin magnesiumkloridilla (0,08 M) ja natriumkloridilla (0,4 M). Yhdisteen 14 kantaliuosta (0,26 M; 3,4 µl) ja yhdisteen 18 kantaliuosta (0,30 M; 3,0 µL) lisättiin 43,6 ml:aan puskuriliuosta. Reaktioliuoksesta otettiin 5 µl:n näytteitä, jotka pysäytettiin 0,1 molaarisella trietyyliammoniumasetaatilla (198 µl) pH:ssa 5,5 ja 7. pH:ssa 7,9 käytettiin 28,1 µL trietyyliammoniumliuosta (0,1 M). Reaktioiden etenemistä seurattiin RP-HPLC:llä. Eluentteina käytettiin trietyyliammoniumasetaattia (50 mM) ja asetonitriiliä, jonka pitoisuus kasvatettiin 20 min:ssa 60 %:iin. Injektiotilavuus oli 14 µl. Yhdisteen 14 havaittiin hydrolysoituvan pääasiassa tymidiini-5´-monofosfaatiksi (24). Sivutuotteena muodostuu myös dinukleosidia pTpT (33) (3–5 %). Dinukleosidi-2´,5´-(2´- N-fosforamidaatin) 15 ei havaittu muodostuvan. 4.5 5´-(4,4´-dimetoksitrityyli)-3´-tert-butyylidimetyylisilyyli-2´-deoksi-2´- (metoksiamino)uridiini Kaavio 17. 2´-Deoksi-2´-(metoksiamino)-3´-O-TBDMS-5´-O-DMTr-uridiinin synteesi. 32 Synteesissä sovellettiin aiemmin julkaistua menetelmää (Kaavio 17).62 2´-Deoksi-2´- (metoksiamino)-5´-O-DMTr-uridiini 34 (187 mg, 0,325 mmol) ja imidatsoli (95 mg, 1,4 mmol) kuivattiin haihduttamalla kolme kertaa kuivasta pyridiinistä alipaineessa. Yhdiste 34 liuotettiin kuivaan pyridiiniin (2,0 ml) ja reaktioseokseen lisättiin TBDMSCl (63 mg, 0,42 mmol). Seosta sekoitettiin lämpötilassa 43 ℃ ja reaktion etenemistä seurattiin TLC:llä. Ajoliuoksena käytettiin metanolin ja etyyliasetaatin seosta (5:95, v:v) tai etyyliasetaattia. Reaktiota sekoitettiin yön yli lämpötilassa 32 ℃, minkä jälkeen reaktioliuokseen lisättiin TBDMSCl (26 mg, 0,17 mmol) kuivassa pyridiinissä (0,3 ml), koska reaktion todettiin olevan kesken. Reaktiota sekoitettiin yön yli lämpötilassa 32 ℃. Reaktio oli vieläkin kesken, joten reaktioon lisättiin TBDMSCl (27 mg, 0,18 mmol). Reaktiota sekoitettiin yön yli lämpötilassa 32 ℃. Reaktioliuos haihdutettiin alipaineessa ja haihdutusjäännös siirrettiin erotussuppiloon DCM:llä (80 ml). Orgaanista faasia pestiin kylläisellä NaHCO3:lla (2 x 30 ml). Orgaaninen faasi kuivattiin Na2SO4:lla, suodatettiin ja haihdutettiin kuiviin. Raakatuote puhdistettiin silikageelikromatografisesti. Ajoliuoksena käytettiin etyyliasetaattia, jossa oli 1 % pyridiiniä. Tuotteen 29 saanto oli 98 mg (44 %). 1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz): δ = 11.37 (1H, s, NH) 7.74 (1H, d, J = 10 Hz, H6) 7.37 (2H, d, J = 5 Hz, Ar) 7.32 (2H, t, J = 10 Hz, Ar) 7.25 (5H, d, J = 5 Hz, Ar) 6.90 (4H, d, J = 10 Hz, Ar) 6.38 (1H, d, J = 10 Hz, Ar) 5.86 (1H, d, J = 5 Hz, Ar) 5.50 (1H, d, J = 10 Hz, H5) 4.34 (1H, t, J = 5 Hz, H3´) 3.91 (1H, m, J = 5 Hz, H1´, H4´) 3.74 (7H, m, J = 10 Hz, CH3 DMTr) 3.42 (3H, s, H2´, H5´, H5´´) 0.84 (3H, s, NHOMe) 0.79 (9H, s, silyylin tert-butyyli) 0,04 (3H, s, CH3 silyyli) 13C NMR (DMSO- d6, 500 MHz): δ = 163.45, 158.66, 150.86, 145.00, 141.80, 136.63, 135.73, 130.19, 128.35, 127.29, 124.37, 113.70, 102.36, 86.50, 84.12, 26.27, 18.20, -4.49. 33 4.6 2´-Deoksi-2´-(metoksiamino)uridylyyli-2´,5´-tymidiini-(2´-N-fosforamidaatin) synteesi käyttäen TBDMS-suojaryhmästrategiaa Kaavio 18. Reagenssit: i) MeCN, 5-(bentsyylitio)–1H–tetratsoli ii) Oxidizer 2´-Deoksi-2´-(metoksiamino)-3´-O-TBDMS-5´-O-DMTr-uridiini 29 (44 mg, 0,077 mmol) kuivattiin haihduttamalla alipaineessa kuivasta asetonitriilistä (Kaavio 18). Yhdiste 29 ja tymidiini-5´-fosforamidiitti 31 kuivattiin vakuumieksikkaattorissa fosforipentoksidin päällä. Yhdiste 29 (44 mg, 0,077 mmol) liuotettiin typpisuojakaasussa kuivaan asetonitriiliin (1 ml). Reaktioseokseen lisättiin tymidiini-5´-fosforamidiitti 31 (64 mg, 0,086 mmol) ja 5-(bentsyylitio)–1H–tetratsoli (0,092 mmol, 0,37 ml, 025 M asetonitriilissä). Reaktiota seurattiin 31P-NMR:llä. NMR:n perusteella reaktiota ei ollut tapahtunut 1 h 45 min kuluttua, joten reaktioseokseen lisättiin 5-(bentsyylitio)–1H– tetratsolia (0,31 ml). Uusi NMR-näyte otettiin 3 h reaktion aloittamisesta, jonka perusteella reaktioseokseen päätettiin lisätä hapetin (Oxidizer, 0,02 M, Sigma Aldrich) aluksi 5,2 ml ja 30 min jälkeen hapetinta lisättiin vielä 1 ml. Reaktiota sekoitettiin yön yli. Reaktioseos siirrettiin DCM:n (40 ml) avulla erotussuppiloon. Orgaanista faasia pestiin 10 %:lla Na2S2O3: vesiliuoksella (2 x 25 ml) ja kylläisellä NaCl:lla (2 x 20 ml). Orgaaninen faasi haihdutettiin kuiviin, ja se kuivattiin vakuumieksikkaattorissa fosforipentoksidin päällä. LC/MS-analyysissä ei löytynyt dinukleosidi-2´,5´-(2´-N- fosforamidaattia) 15. 34 Synteesi toistettiin mutta fosfiitti hapetettiin 0,1 M:lla jodiliuoksella THF:n, veden ja 2,6- lutidiinin seoksessa (2,9 ml/1,4 ml/0,7 ml). Reaktiota sekoitettiin yön yli. Reaktioliuos siirrettiin erotussuppiloon 40 ml:lla DCM:ää. Orgaanista faasia pestiin Na2S2O3:lla (3 x 25 ml) ja NaCl:n kylläisellä vesiliuoksella (2 x 25 ml). Toisen NaCl pesun aikana koko seos muuttui sameaksi. Erotussuppiloon lisättiin 25 ml DCM, ja faasit saatiin eroteltua. Orgaaninen faasi haihdutettiin kuiviin, ja se analysoitiin LC/MS:llä. Analyysissä ei löytynyt dinukleosidi-2´,5´-(2´-N-fosforamidaattia) 15. 4.7 2´-Deoksi-2´-(metoksiamino)-3´,5´-O-(1,1,3,3-tetraisopropyylidisiloksaani-1,3- diyyli)-uridiini Kaavio 19. 2´-deoksi-2´-(metoksiamino)-3´,5´-O-(1,1,3,3-tetraisopropyylidisiloksaani- 1,3-diyl)-uridiinin synteesi. Synteesissä noudatettiin aiemmin julkaistua menetelmää (Kaavio 19).63 2´-Deoksi-2´- (metoksiamino)uridiini 18 (148 mg, 0,61 mmol) liuotettiin kuivaan pyridiiniin (1 ml). Reaktioliuokseen lisättiin 1,3-dikloro-1,1,3,3-tetraisopropyylidisiloksaani (0,210 ml, 0,668 mmol) ja reaktioliuosta sekoitettiin yön yli. Reaktio pysäytettiin lisäämällä reaktioseokseen metanolia (0,2 ml) ja reaktioliuosta sekoitettiin 10 min. Seokseen lisättiin kloroformia (20 ml), ja orgaanista faasia pestiin kylläisellä NaHCO3:lla (2 x 15 ml). Orgaaninen faasi kuivattiin Na2SO4:lla, suodatettiin ja kuivattiin alipaineessa. Haihdutusjäännös haihdutettiin alipaineessa tolueenista (2 x 10 ml) ja kloroformista (2 x 15 ml). Haihdutusjäännös kuivattiin vakuumieksikkaattorissa. Raakatuote puhdistettiin silikapylväskromatografisesti. Aluksi ajoliuoksena käytettiin 15 % EtOAc:a DCM:ssä. EtOAc:n pitoisuutta nostettiin vaiheittain 50 %:iin. Tuotefraktiot haihdutettiin kuiviin alipaineessa. Tuotteen 30 saanto oli 0,104 g (33,1) %. 1H NMR (CDCl3, 500 MHz): = 7.64 (1H, d, J = 5 Hz, H6) 5.76 (1H, d, J = 5 Hz, H1´) 5.71 (1H, d, J = 5 Hz, 35 H5) 4.64 (1H, s, H4´) 4.06 (1H, d, J = 5 Hz, H5´) 4.04 (1H, s, H3´, H2´) 3.83 (3H, s, NHOMe) 1.28 (2H, s, silyyli CH2) 0.90 (1H, m, J = 2 Hz, H2´) 0.09 (1H, s, CH3 silyyli) 4.8 2´-Deoksi-2´-(metoksiamino)uridylyyli-2´,5´-tymidiini-(2´-N-fosforamidaatin) synteesi käyttäen Markiewicz-suojaryhmästrategiaa Kaavio 20. Reagenssit: i) MeCN, 5-(bentsyylitio)–1H–tetratsoli ii) I2, THF, H2O, 2,6- lutidiini 2´-Deoksi-2´-(metoksiamino)-3´,5´-O-(1,1,3,3-tetraisopropyylidisiloksaani-1,3-diyl)- uridiini 30 (52 mg, 0,10 mmol) ja tymidiini-5´-fosforamidiitti 31 (89 mg, 0,11 mmol) liuotettiin kuivaan asetonitriiliin (1 ml) typpisuojakaasussa (Kaavio 20). Reaktioseokseen lisättiin 5-(bentsyylitio)–1H–tetratsoli (0,485 ml, 0,120 mmol). Reaktioseosta sekoitettiin yön yli, minkä jälkeen fosfiitti hapetettiin fosfaatiksi 0,1 M:lla jodiliuoksella (THF 3,48 ml, H2O 1,68 ml, 2,6-lutidiini 0,84 ml). Reaktiota sekoitettiin yön yli. Reaktioliuos siirrettiin erotussuppiloon 40 ml:lla DCM:ää. Orgaanista faasia pestiin Na2S2O5:llä (2 x 20 ml) ja kylläisellä NaCl-liuoksella (2 x 20 ml). Orgaaninen faasi kuivattiin Na2SO4:lla, suodatettiin ja haihdutettiin kuiviin alipaineessa. Massa-analyysissä ei löytynyt haluttua dinukleosidi-2´,5´-(2´-N-fosforamidaattia) 15. Synteesi toistettiin. 2´-Deoksi-2´-(metoksiamino)-3´,5´-O-(1,1,3,3-tetraisopropyylidisi- loksaani-1,3-diyl)-uridiini 30 (47 mg, 0,092 mmol) ja tymidiini-5´-fosforamidiitti 31 (77 mg, 0,10 mmol) liuotettiin typpikaapissa asetonitriiliin (1 ml). Reaktioseokseen 36 lisättiin 5-(bentsyylitio)–1H–tetratsoli (1,1 ml, 0,28 mmol). Reaktioliuokseen lisättiin hapetusliuos (0,1 M I2, 2,9 ml THF, 1,4 ml H2O, 0,7 2,6-lutidiini). Reaktioliuosta sekoitettiin yön yli, minkä jälkeen reaktioseos siirrettiin DCM:n (40 ml) avulla erotussuppiloon. Orgaaninen faasi haihdutettiin kuiviin alipaineessa. Massa-analyysin perusteella tuotetta ei muodostunut. 5 Viitteet 1. Han, J., Kervio, E. & Richert, C. High Fidelity Enzyme-Free Primer Extension with an Ethynylpyridone Thymidine Analog. Chemistry - A European Journal 27, 15918–15921 (2021). 2. Alberts, B. Molecular biology of the cell. (W. W. Norton & Company, 2022). 3. Frick, D. N. & Richardson, C. C. DNA Primases. Annu Rev Biochem 70, 39–80 (2001). 4. Kaiser, A. & Richert, C. Nucleotide-based copying of nucleic acid sequences without enzymes. Journal of Organic Chemistry 78, 793–799 (2013). 5. Westheimer, F. H. Pseudo-Rotation in the Hydrolysis of Phosphate Esters. Acc Chem Res 1, 70–78 (1968). 6. Sosson, M. & Richert, C. Enzyme-free genetic copying of DNA and RNA sequences. Beilstein J. Org. Chem 14, 603–617 (2018). 7. Schrum, J. P., Ricardo, A., Krishnamurthy, M., Blain, J. C. & Szostak, J. W. Efficient and rapid template-directed nucleic acid copying using 2′-amino- 2′,3′-dideoxyribonucleoside-5′- phosphorimidazolide monomers. J Am Chem Soc 131, 14560–14570 (2009). 8. Röthlingshöfer, M. et al. Chemical primer extension in seconds. Angewandte Chemie - International Edition 47, 6065–6068 (2008). 9. Dörr, M., Löffler, P. M. G. & Monnard, P.-A. Non-enzymatic Polymerization of Nucleic Acids from Monomers: Monomer Self- 37 Condensation and Template-Directed Reactions. Curr Org Synth 9, 735– 763 (2012). 10. Kusser, W. Chemically modified nucleic acid aptamers for in vitro selections: evolving evolution. Reviews in Molecular Biotechnology 74, 27– 38 (2000). 11. Kervio, E., Hochgesand, A., Steiner, U. E. & Richert, C. Templating efficiency of naked DNA. Proc Natl Acad Sci U S A 107, 12074–12079 (2010). 12. Kervio, E., Claasen, B., Steiner, U. E. & Richert, C. The strength of the template effect attracting nucleotides to naked DNA. Nucleic Acids Res 42, 7409–7420 (2014). 13. Rojas Stütz, J. A., Kervio, E., Deck, C. & Richert, C. Chemical Primer Extension: Individual Steps of Spontaneous Replication. Chem Biodivers 4, 784–802 (2007). 14. Kanavarioti A., Bernasconi C. F., Doodokyan D. L. & Alberas D. J. Magnesium Ion Catalyzed P-N Bond Hydrolysis in Imidazolide-Activated Nucleotides. Relevance to Template-Directed Synthesis of Polynucleotides. Journal of American Chemical Society 111, 7247–7257 (1989). 15. Deck, C., Jauker, M. & Richert, C. Efficient enzyme-free copying of all four nucleobases templated by immobilized RNA. Nat Chem 3, 603–608 (2011). 16. Kanavarioti, A. Template-Directed Chemistry and the Origins of the RNA World. Origins of Life and Evolution of the Biosphere 24, 479–494 (1994). 17. Kanavarioti, A., Bernasconi, C. F., Alberas, D. J. & Baird, E. E. Kinetic Dissection of Individual Steps in the Poly(C)-Directed Oligoguanylate Synthesis from Guanosine 5’-Monophosphate 2-Methylimidazolide. J. Am. Chem. Soc 115, 8537–8546 (1993). 18. Miles, H. T. & Frazier, J. Infrared Study of G-C Complex Formation in Template-dependent Oligo(G) Synthesis. J Mol Biol 162, 219–230 (1982). 19. Gordon, P. M., Sontheimer, E. J. & Piccirilli, J. A. Kinetic characterization of the second step of group II intron splicing: Role of metal ions and the cleavage site 2’-OH in catalysis. Biochemistry 39, 12939–12952 (2000). 38 20. Sigel, R. K. O. & Sigel, H. A stability concept for metal ion coordination to single-stranded nucleic acids and affinities of individual sites. Acc Chem Res 43, 974–984 (2010). 21. Crothers, D. M. & Zimm, B. H. Theory of the melting transition of synthetic polynucleotides: Evaluation of the stacking free energy. J Mol Biol 9, 1–9 (1964). 22. Takahashi, S. & Sugimoto, N. Watson-Crick versus Hoogsteen Base Pairs: Chemical Strategy to Encode and Express Genetic Information in Life. Acc Chem Res 54, 2110–2120 (2021). 23. Varani, G. & McClain, W. H. The G·U wobble base pair: A fundamental building block of RNA structure crucial to RNA function in diverse biological systems. EMBO Rep 1, 18–23 (2000). 24. Joyce, G. F., Inoue, T. & Orgel, L. E. Non-enzymatic template-directed synthesis on RNA random copolymers. Poly(C, U) templates. J Mol Biol 176, 279–306 (1984). 25. Bansal, A., Kaushik, S. & Kukreti, S. Non-canonical DNA structures: Diversity and disease association. Front Genet 13, 1–30 (2022). 26. Kozlov, I. A. & Orgel Leslie E. Nonenzymatic Template-directed Synthesis of RNA from Monomers. Mol Biol 34, 781–789 (2000). 27. Richmond, T. J. & Davey, C. A. The structure of DNA in the nucleosome core. Nature 423, 145–150 (2003). 28. Fakhru, H., Inoue, T. & Orgel, L. E. Temperature-dependence of the Template-directed Synthesis of Oligoguanylates. Tetrahedron 40, 39–45 (1984). 29. Pranata, J., Wierschke, S. G. & Jorgensen, W. L. OPLS Potential Functions for Nucleotide Bases. Relative Association Constants of Hydrogen-Bonded Base Pairs in Chloroform. J. Am. Chem. Soc 113, 2810–2819 (1991). 30. Mortimer, S. A., Kidwell, M. A. & Doudna, J. A. Insights into RNA structure and function from genome-wide studies. Nat Rev Genet 15, 469– 479 (2014). 39 31. Zhang, S., Zhang, N., Blain, J. C. & Szostak, J. W. Synthesis of N3′-P5′- linked Phosphoramidate DNA by Nonenzymatic Template-Directed Primer Extension. J. Am. Chem. Soc 135, 924–932 (2013). 32. Joyce, G. F. & Orgel, L. E. Non-enzymic template-directed synthesis on RNA random copolymers. Poly(C, G) templates. J Mol Biol 188, 433–441 (1986). 33. Hagenbuch, P., Kervio, E., Hochgesand, A., Plutowski, U. & Richert, C. Chemical primer extension: Efficiently determining single nucleotides in DNA. Angewandte Chemie - International Edition 44, 6588–6592 (2005). 34. Vogel, S. R., Deck, C. & Richert, C. Accelerating chemical replication steps of RNA involving activated ribonucleotides and downstream-binding elements. Chemical Communications 4922–4924 (2005) doi:10.1039/b510775j. 35. Rojas Stütz, J. A. & Richert, C. A steroid cap adjusts the selectivity and accelerates the rates of nonenzymatic single nucleotide extensions of an oligonucleotide. J Am Chem Soc 123, 12718–12719 (2001). 36. Rojas Stütz, J. A. & Richert, C. Tuning the reaction site for enzyme-free primer-extension reactions through small molecule substituents. Chemistry - A European Journal 12, 2472–2481 (2006). 37. Lohrmann, R. & Orgel, L. E. Polymerization of Nucleotide Analogues I: Reaction of Nucleoside 5’-Phosphorimidazolides with 2’-Amino-2’- Deoxyuridine. J.Mol.Evol 7, 253–267 (1976). 38. Kanavarioti, A., Stronach, M. W., Ketner, R. J. & Hurley, T. B. Large Steric Effect in the Substitution Reaction of Amines with Phosphoimidazolide- Activated Nucleosides. Journal of Organic Chemistry 60, 632–637 (1995). 39. Kervio, E., Sosson, M. & Richert, C. The effect of leaving groups on binding and reactivity in enzyme-free copying of DNA and RNA. Nucleic Acids Res 44, 5504–5514 (2016). 40. Gryaznov, S. M. & Winter, H. RNA mimetics: oligoribonucleotide N3′→P5′ phosphoramidates. Nucleic Acids Res 26, 4160–4167 (1998). 40 41. Naylor, R. & Gilham, P. T. Studies on Some Interactions and Reactions of Oligonucleotides in Aqueous Solution. Biochemistry 5, 2722–2728 (1966). 42. Sulston, J., Lohrmann, R., Orgel, L. E. & Miles, H. T. Nonenzymatic Synthesis of Oligoadelylates on a Polyuridylic Acid Template*. Proc Natl Acad Sci U S A 59, 726–733 (1968). 43. Orgel, L. E. & Lohrmann, R. Prebiotic Chemistry and Nucleic Acid Replication. Acc Chem Res 7, 368–377 (1974). 44. Schneider-Bernloehr, H. et al. Non-enzymic Synthesis of Deoxyadenylate Oligonucleotides on a Polyuridylate Template. J. Mol. Biol 37, 151–155 (1968). 45. Inoue, T. & Orgel, L. E. Substituent Control of the Poly(C)-Directed Oligomerization of Guanosine 5’-Phosphoroimidazolide. J. Am. Chem. Soc 103, 7666–7667 (1981). 46. Walton, T. & Szostak, J. W. A Highly Reactive Imidazolium-Bridged Dinucleotide Intermediate in Nonenzymatic RNA Primer Extension. J Am Chem Soc 138, 11996–12002 (2016). 47. Walton, T., Zhang, W., Li, L., Tam, C. P. & Szostak, J. W. The Mechanism of Nonenzymatic Template Copying with Imidazole‐Activated Nucleotides. Angewandte Chemie 58, 10812–10819 (2019). 48. Walton, T., Pazienza, L. & Szostak, J. W. Template-Directed Catalysis of a Multistep Reaction Pathway for Nonenzymatic RNA Primer Extension. Biochemistry 58, 755–762 (2019). 49. Wu, T. & Orgel, L. E. Nonenzymatic Template-Directed Synthesis on Hairpin Oligonucleotides. 3. Incorporation of Adenosine and Uridine Residues. American Chemical Society 114, 7963–7969 (1992). 50. Li, L. et al. Enhanced nonenzymatic RNA copying with 2-aminoimidazole activated nucleotides. J Am Chem Soc 139, 1810–1813 (2017). 51. Kozlov, I. A. & Orgel, L. E. Nonenzymatic oligomerization reactions on templates containing inosinic acid or diaminopurine nucleotide residues. Helv Chim Acta 82, 1799–1805 (1999). 41 52. Hartel, C. & Göbel, M. W. Substitution of adenine by purine-2,6-diamine improves the nonenzymatic oligomerization of ribonucleotides on templates containing thymidine. Helv Chim Acta 83, 2541–2549 (2000). 53. Chaput, J. C., Sinha, S. & Switzer, C. 5-Propynyluracil·diaminopurine: an efficient base-pair for non-enzymatic transcription of DNA. Chemical Communications 2, 1568–1569 (2002). 54. Aho, A., Sulkanen, M., Korhonen, H. & Virta, P. Conjugation of oligonucleotides to peptide aldehydes via a pH-responsive N- methoxyoxazolidine linker. Org Lett 22, 6714–6718 (2020). 55. Aho, A., Äärelä, A., Korhonen, H. & Virta, P. Expanding the Scope of the Cleavable N-(Methoxy)oxazolidine Linker for the Synthesis of Oligonucleotide Conjugates. Molecules 26, 490–501 (2021). 56. Ora, M., Mattila, K., Lö, T., Oivanen, M. & Lö, H. Hydrolytic Reactions of Diribonucleoside 3′,5′-(3′-N-Phosphoramidates): Kinetics and Mechanisms for the P-O and P-N Bond Cleavage of 3′-Amino-3′-deoxyuridylyl-3′,5′- uridine. Journal of American Chemical Society 124, 14364–14372 (2002). 57. Shapiro, R. & Kang, S. Uncatalyzed Hydrolysis of Deoxyuridine, Thymidine, and 5-Bromodeoxyuridine*. Biochemistry 8, 1806–1810 (1969). 58. Hall, H. K. J. Correlation of the Base Strenghts of Amines. Journal of American Chemical Society 79, 5441–5444 (1957). 59. Oivanen, M. et al. Additional Evidence for the Exceptional Mechanism of the Acid-catalysed Hydrolysis of 4-Oxopyrimidine Nucleosides: Hydrolysis of 1-(I-Alkoxyalkyl)uracils, Seconucleosides, 3’-C-Alkyl Nucleosides and N ucleoside 3’,5’-Cycl ic M onophosphates. Journal of the Chemical Society, Perkin Transactions 2 2, 309–314 (1994). 60. Ora, M., Murtola, M., Aho, S. & Oivanen, M. Hydrolytic reactions of 3-N- phosphoramidate and 3-N-thiophosphoramidate analogs of thymidylyl-3,5- thymidine. Organic& Biomolecular Chemistry 2, 593–600 (2004). 42 61. Gates, K. S. An Overview of Chemical Processes That Damage Cellular DNA: Spontaneous Hydrolysis, Alkylation, and Reactions with Radicals. Chem Res Toxicol 22, 1747–1760 (2009). 62. Moyroud, E., Biala, E. & Strazewski, P. Synthesis and enzymatic digestion of an RNA nonamer in both enantiomeric forms. Tetrahedron 56, 1475– 1484 (2000). 63. Kvassiouk, E., Pfleiderer, W. & Chemie, F. New Building Blocks for Photolithographic Syntheses of Oligoribonucleotides. Helv Chim Acta 94, 362–370 (2011). 43 6 Liitteet Liite 1. 2´-Deoksi-2´-(metoksiamino)uridylyyli-3´-5´-tymidiinin hydrolyysin tutkimuksen HPLC-ajo pH:ssa 1. Liite 2. 1. Kertaluvun nopeusvakion määrittäminen graafisesti lineaarisella regressiolla 2´-deoksi-2´-(metoksiamino)uridylyyli-3´,5´-tymidiinin häviämiselle (pH 1). 44 Liite 3. 1. Kertaluvun nopeusvakion määrittäminen graafisesti lineaarisella regressiolla 2´-deoksi-2´-(metoksiamino)uridylyyli-3´,5´-tymidiinin häviämiselle (pH 2). Liite 4. 1. Kertaluvun nopeusvakion määrittäminen graafisesti lineaarisella regressiolla 2´-deoksi-2´-(metoksiamino)uridylyyli-3´,5´-tymidiinin häviämiselle (pH 3). 45 Liite 5. 1. Kertaluvun nopeusvakion määrittäminen graafisesti lineaarisella regressiolla 2´-deoksi-2´-(metoksiamino)uridylyyli-3´,5´-tymidiinin häviämiselle (pH 3,5). Liite 6. 1. Kertaluvun nopeusvakion määrittäminen graafisesti lineaarisella regressiolla 2´-deoksi-2´-(metoksiamino)uridylyyli-3´,5´-tymidiinin häviämiselle (pH 4). 46 Liite 7. 1. Kertaluvun nopeusvakion määrittäminen graafisesti lineaarisella regressiolla 2´-deoksi-2´-(metoksiamino)uridylyyli-3´,5´-tymidiinin häviämiselle (pH 5). Liite 8. 1. Kertaluvun nopeusvakion määrittäminen graafisesti lineaarisella regressiolla 2´-deoksi-2´-(metoksiamino)uridylyyli-3´,5´-tymidiinin häviämiselle (pH 6). 47 Liite 9. 1. Kertaluvun nopeusvakion määrittäminen graafisesti lineaarisella regressiolla 2´-deoksi-2´-(metoksiamino)uridylyyli-3´,5´-tymidiinin häviämiselle (pH 9). Liite 10. 1. Kertaluvun nopeusvakion määrittäminen graafisesti lineaarisella regressiolla 2´-deoksi-2´-(metoksiamino)uridylyyli-3´,5´-tymidiinin häviämiselle (pH 10,2). 48 Liite 11. 1. Kertaluvun nopeusvakion määrittäminen graafisesti lineaarisella regressiolla 2´-deoksi-2´-(metoksiamino)uridylyyli-3´,5´-tymidiinin häviämiselle (pH 11,2). Liite 12. Tymidiini-5′-(2-metyyli-imidatsoli)monofosfaatin (14) 1H-NMR-spektri Liite 13. Tymidiini-5′-(2-metyyli-imidatsoli)monofosfaatin (14) 13C-NMR-spektri 49 Liite 14. 2´-Deoksi-2´-(metoksiamino)-3´-O-TBDMS-5´-O-DMTr-uridiinin (29) 1H- NMR-spektri Liite 15. 2´-Deoksi-2´-(metoksiamino)-3´-O-TBDMS-5´-O-DMTr-uridiinin (29) 13C- NMR-spektri Liite 16. 2´-Deoksi-2´-(metoksiamino)-3´,5´-O-(1,1,3,3-tetraisopropyylidisiloksaani- 1,3-diyl)-uridiinin (30) 1H-NMR-spektri