1 Sydänglykosidien MS/MS-fragmentaatio ja sen hyödyntäminen niiden analytiikassa Eetu Hokkanen Luonnonyhdisteiden kemia Kemian laitos Turun yliopisto Laajuus: 6 op 2.6. 2025 Turku Turun yliopiston laatujärjestelmän mukaisesti tämän julkaisun alkuperäisyys on tarkastettu Turnitin OriginalityCheck -järjestelmällä 2 LuK-tutkielma Pääaine: Kemia Tekijä: Eetu Hokkanen Otsikko: Sydänglykosidien MS/MS-fragmentaatio ja sen hyödyntäminen niiden analytiikassa Ohjaajat: Maarit Karonen ja Juha-Pekka Salminen Sivumäärä: 16 sivua Päivämäärä: Kesäkuu 2025 Sydänglykosidit ovat tiettyjen kasvien ja elämien tuottamia erikoistuneita metaboliitteja, joilla eliöt puolustautuvat niitä syöjiltä kasvin- tai lihansyöjiltä. Sydänglykosideja on tiettävästi käytetty erilaisiin lääkinnällisiin tarkoituksiin jo yli 2000 vuotta, mutta William Witheringin (1741–1791) tutkimusten myötä vakiintui sydänglykosidien käyttö sydämen vajaatoiminnan hoidossa Lääkkeinä digoksiini ja digitoksiini ovat käytetyimpiä sydänglykosideja. Näiden käyttöä on kuitenkin alettu vähentämään 1990-luvulta lähtien johtuen sydänglykosidien kapeista terapeuttisista ikkunoista. Viime aikoina sydänglykosideilla on havaittu myös antineoplastisia vaikutuksia, jotka riippuvat käytetystä sydänglykosidista. Sydänglykosidit rakentuvat steroidiosasta, steroidiosaan kiinnittyneestä laktoniosasta C17-hiilessä, sekä sokeriosasta, joka on kiinnittyneenä glykosidisidoksella C3-hiileen. Korkean tai erittäin korkean erotuskyvyn nestekromatografian (HPLC ja UHPLC) käyttö sähkösumutusionisaation (ESI) ja tandemmassaspektrometrian (MS/MS) kanssa on muodostunut yleiseksi menetelmäksi sydänglykosidien erotteluun ja analysointiin Sydänglykosidien fragmentaatiokaaviot ovat varsin monimutkaisia. Mikäli sydänglykosidilla on useita sokeriyksiköitä, voivat sokeriosat pilkkoutua joko yksitellen tai useamman sokeriyksikön mittaisissa osissa. Steroidirungon hydroksyyliryhmät voivat myös pilkkoutua yksitellen tai useampi kerrallaan ja ne havaitaan H2O-molekyylin lohkeamisina. Lisäksi laktonisubstituenttiosan pilkkoutuminen riippuu laktonisubstituentista. Esimerkiksi 2-furanoni voi pilkkoutua, mutta vain osittain, kun taas 2-pyroni puolestaan voi pilkkoutua osittain tai kokonaan. Sydänglykosidien kvalitatiiviseen määrittäminen MS/MS:llä käytetään olemassa olevaa kirjallisuutta apuna sekä spektrikirjastoja. Ongelmaksi sydänglykosidien spektrien tulkitsemisessa on tietyillä yhdisteillä tietokantojen puutteellisuus. Eräs keino edesauttaa sydänglykosidien MS/MS-spektrien määrittämistä on hyödyntää kilpailevaa fragmentaatiomallinnusta (CFM) normaalin analyysin tukena. Avainsanat: erikoistuneet metaboliitit, nestekromatografia, sydänglykosidi, tandemmassaspektrometria 3 Sisällysluettelo Lyhenteet .............................................................................................................................................. 4 1. Johdanto ..................................................................................................................................... 5 2. Sydänglykosidien rakenne ......................................................................................................... 6 3. Massaspektrometria ................................................................................................................... 7 3.1 Näytteensyöttö................................................................................................................................ 9 3.2 Ionisaatiomenetelmät ................................................................................................................... 10 3.3 Massa-analysaattorit ..................................................................................................................... 10 4. MS/MS-fragmentaatio ............................................................................................................. 12 5. Datan hyödyntäminen .............................................................................................................. 17 6. Yhteenveto ja johtopäätökset ................................................................................................... 18 Viitteet ................................................................................................................................................ 19 4 Lyhenteet CFM Kilpaileva fragmentaatiomallinnus (engl. Competetive fragmentation modeling) Da Molekyylimassa (g/mol) (engl. Dalton) EI Elektroni-ionisaatio (engl. Electron ionisation) ESI Sähkösumutusionisaatio (engl. Electrospray ionisation) FAB Nopeilla atomeilla pommitus (engl. Fast atom bombardment) HPLC Korkean erotuskyvyn nestekromatografia MALDI Matriisiavusteinen laserdesorptioionisaatio (engl. Matrix-assisted laser desorption ionisation) MS/MS Tandemmassaspektrometria m/z Massavaraussuhde Q Kvadrupoli (engl. Quadrupole) TOF Lentoaika (engl. Time of flight) UHPLC Erittäin korkean erotuskyvyn nestekromatografia 5 1. Johdanto Sydänglykosidit ovat tiettyjen kasvien ja eläimien valmistamia erikoistuneita metaboliitteja, joiden tarkoituksena on suojella eliötä niitä syöviltä kasvis- tai lihansyöjiltä. Joitakin tunnetuimpia sydänglykosideja ja sydänglykosidijohdannaisia ovat digoksiini, digitoksiini, ouabaiini, oleandriini, calotropiini, thevetiini, convallatoksiini, bufaliini, marinobufageniini ja telocinobufageniini (Kumavath et al. 2021). Sydänglykosideja sisältäviä kasvirohdoksia on tiedettävästi käytetty erilaisten vaivojen hoitoon yli 2000 vuoden ajan. Vasta William Withering (1741–1799) havaitsi kliinisten tutkimusten jälkeen sydänglykosidien vaikutuksen erityisesti sydämen toimintaan, johon nykyaikainen käyttö myös perustuu (Grovesa ja Bissetb 1991). Sydänglykosidien vaikutusmekanismia saatiin tarkennettua vasta 1950-luvulla, kun Schatzmann kollegoineen havaitsivat näiden yhdisteiden inhiboivan vaikutuksen sydämen Na+/K+-pumppujen toimintaan (Prassas ja Diamandis 2008). Tämä häirintä johtaa Ca2+-ionien kertymiseen solukalvon sisällä, mikä taas puolestaan vahventaa sydänlihaksen supistusvoimaa samalla harventaen sydämen lyöntitiheyttä (Kumavath et al., 2021). Yleisimmäksi sydänglykosideiksi sydämen vajaatoiminnan hoidossa ovat muodostuneet digoksiini, jota saadaan eristettyä Digitalis lanata-kasvilajista, ja digitoksiini, jota saadaan eristettyä Digitalis purpurea-kasvilajista (Whayne, 2018). Näiden sydänglykosidien käyttö perustuu niiden vaikuttavuuden etuihin. Digoksiinin lääkevaikutus alkaa nopeammin ja se viipyy kehossa vähemmän aikaa. Toisaalta digitoksiini pilkkoutuu maksassa, jolloin mahdollinen munuaisten vajaatoiminta ei vaikuta aineen poistumiseen elimistöstä (Whayne, 2018; Dashti et al., 2023). Digoksiinin käyttöä sydänlääkkeenä on vähennetty 1990-luvulta lähtien (Ren et al., 2024). Käytön vähentämisen taustalla ovat myrkytystilat, jotka voivat syntyä joko akuutisti tai pitkäaikaiskäytön seurauksena. Sydänglykosidien aiheuttama myrkytystila ilmenee muun muassa anoreksiana, pahoinvointisuutena, oksenteluna, neurologisina oireina sekä kuolettavina rytmihäiriöinä (Ren et al., 2024). Eräs seikka, joka tekee digoksiinin ja muidenkin sydänglykosidien käytöstä hankalaa, on niiden kapea terapeuttinen ikkuna (Ziff ja Kotecha 2016). Nimestään huolimatta sydäglykosideilla on myös havaittu olevan antineoplastisia (syövän kasvua heikentäviä) vaikutuksia (Kumavath et al., 2021). Nämä vaikutukset ja se, mihin vaikutukset kohdentuvat riippuvat sydänglykosidien koostumuksista. Esimerkiksi bufaliinin on havaittu vaikuttavan sytotoksisesti keuhkosyöpäsoluihin, kun taas ouabiinin on havaittu vaikuttavan sytotoksisesti rinta- ja eturauhassyöpäsoluihin. Sydänglykosidien antineoplastinen vaikutusmekanismi on monimutkainen (Kumavath et al., 2021). Jo vuosikymmenten ajan hyväksi 6 havaittu menetelmä suurikokoisten molekyylien, mukaan lukien sydänglykosidien analysointiin on tandemmassaspektrometrian eli MS/MS:n hyödyntäminen. Tässä tutkielmassa käsitellään pintapuolisesti, mitä MS/MS on ja millä eri laitteilla MS/MS:ään perustuvaa tutkimusta voidaan tehdä. Tutkielmassa käsitellään myös mitä sydänglykosidien massaspektreistä voidaan havaita, sekä miten näitä spektrejä voidaan hyödyntää sydänglykosidien analytiikassa. Tässä tutkielmassa keskitytään digoksiinin, digoksiinin, adynerigeniinin, oleandrigeniinin bufaliinin ja bufotaliinin pilkkoutumisiin MS/MS:ssä. On hyvä huomata, että sydänglykosideista on rajallisesti tietoa niiden pilkkoutumisreiteistä. Muiden sydänglykosidien tutkiminen voisikin olla potentiaalisesti tärkeä tutkimuskohde. Lisäksi tässä tutkielmassa käsitellään muita mahdollisia menetelmiä sydänglykosidien rakenteen määrittämiseen, jotka eivät perustu suoranaisiin mittauksiin. 2. Sydänglykosidien rakenne Sydänglykosidit rakentuvat steroidiosasta, siihen kiinnittyneestä tyydyttymättömästä laktonirenkaasta steroidirungon C17-asemassa sekä sokeriosasta (Botelho, Pierezan, Soto-Blanco, ja Melo, 2019). Erot sydänglykosidien rakenteissa perustuvat laktonirenkaiden ja sokeriosien eroavaisuuksiin. Sydänglykosidit voidaan jakaa kardenoliineihin ja bufadionilideihin niiden laktoniosien rakenteiden perusteella. Tyypillisimmät sokeriosat sydänglykosideilla ovat puolestaan glukoosi, galaktoosi, mannoosi, ramnoosi ja digitaloosi (Botelho et al., 2019). Sydänglykosidien yleinen rakenne on esitetty kuvassa 1 ja mahdolliset laktonisubstituentit on esitetty taulukossa 1. Kuva 1. Luonnossa esiintyvien sydänglykosidien yleinen rakenne. Sydänglykosidit muodostuvat steroidikeskuksesta (punainen), sokeriosasta (sininen) sekä C17-hiilessä olevassa laktonisubstituenttiosasta (vihreä). 7 Taulukko 1. Sydänglykosidien steroidirungon C17-hiilen mahdolliset laktonisubstituentit. Kardenoliineissa substituenttina on 2-furanoni, bufadionilideissa substituenttiosana on 2-pyroni Sydänglykosidien rakenne vaikuttaa yhdisteiden aktiivisuuteen sydänlihaksessa. Sydänglykosidien sokeriosa vaikuttaa yhdisteen voimakkuuteen, kun taas laktoniosa vaikuttaa yhdisteen kohdentumiseen sydänlihaksessa (Kumavath et al., 2021). 3. Massaspektrometria Massaspektrometria on analyysitekniikka, jonka avulla voidaan tutkia yhdisteen rakennetta. Massaspektrometria on tekniikkana ollut tunnettu jo 1900-luvun alusta lähtien alkaen J.J Thompsonin tutkimuksista, joiden myötä löydettiin elektroni ja sen massavaraussuhde (de Hoffmann ja Stroobant 2007). Muita merkittäviä uraauurtavia tutkijoita olivat muun muassa E. Goldstein, joka havaitsi anodisäteitä kaasufaasissa ja W. Wien, joka tutki anodisäteitä ja havaitsi näiden olevan positiivisesti varautuneita (de Hoffmann ja Stroobant 2007). Massaspektrometria pysyi pääosin fysiikan ja fysikaalisen kemian tutkimusalueina aina 1960- luvulle, jonka aikana tekniikat ja menetelmät edistyivät huomattavasti (Greaves ja Roboz 2013). 1960-luvulla kaasukromatografian kaupallistuminen laajensi massaspektrometrian käyttöaluetta, koska tämä mahdollisti monimutkaisten yhdisteseoksien analysoinnin. Kaasukromatografian käyttö kuitenkin tuotti hankaluuksia polaaristen yhdisteiden analysoinnissa, mikä johtui kaasukromatografien taipumuksesta hajottaa polaarisia yhdisteitä, kun niitä haihdutettiin kaasufaasiin. Tämä hankaloitti bioaktiivisten yhdisteiden analysointia, koska suurin osa bioaktiivisista yhdisteitä on polaarisia. Lisäksi elektroni-ionisaation (EI) käyttö ionisaattorina toi omat haasteensa bioaktiivisten yhdisteiden analysointiin, koska EI:llä on taipumuksena pilkkoa 8 (fragmentoida) yhdisteet jo ionisaatiovaiheessa, mikä hankaloittaa yhdisteiden analysointia ja prekursori-ionin molekyylipainon määritystä. Bioaktiivisten yhdisteiden analysoinnin parantamiseksi kehitettiin 1970-luvun loppupuolella nopeilla atomeilla pommitukseen (FAB) perustuva ionisaatiotekniikka (Greaves ja Roboz 2013). FAB oli herkkä menetelmä polaaristen yhdisteiden ionisointiin, mutta johtuen matriisien käytöstä spektrien tulkinta hankaloitui (de Hoffmann ja Stroobant 2007). FAB:n käyttöä ionilähteenä vähennettiin 1990- luvulta sähkösumutusionisaation (ESI) ja matriisiavusteisen laserdesorptioionisaation (MALDI) kehittämisen myötä. ESI mahdollisti nestekromatografisten menetelmien käytön massaspektrometriassa, mikä helpotti huomattavasti polaaristen bioaktiivisten yhdisteiden analysointia. Lisäksi ESI ja MALDI pehmeinä ionisaatiomenetelminä sallivat ehjien yhdisteiden tutkimisen (van der Gugten, 2020). Massaspektrometriassa analysoidaan nimestään huolimatta oikeastaan ionisoitujen yhdisteiden massavaraussuhteita (m/z), jossa verrataan ionien runsautta havaittuun varaukseen, jotka muunnetaan molekyylimassaksi (Da), kun huomioidaan useasti varautuneiden ionien vaikutus eli varausasteet sekä mahdolliset adduktit (Allewell, Narhi ja Rayment, 2013). Koska yksittäisten ionien analyyseissä mitataan massavaraussuhteita, on hyvä myös ottaa alkuaineiden isotooppijakaumat huomioon, jotka massaspektrometrin analysaattori havaitsee (Glish ja Vachet 2003). Nämä isotooppijakaumat aiheuttavat spektrikaavioihin lisäpiikkejä. Massaspektrometrinen menetelmä koostuu näytteensyötöstä, ionilähteestä, analysaattorista ja detektorista (kaavio 1). Kaavio 1. Massaspektrometrisen menetelmän yleinen kaaviokuva. Tandemmassaspektrometriassa eli MS/MS-spektrometrian analyysivaiheessa on kaksi peräkkäistä vaihetta käyttäen kahta massa-analysaattoria (Glish ja Vachet 2003). Ensimmäisessä vaiheessa massa- analysaattorissa eristetään ionit, joilla on haluttu m/z-suhde. Tämän jälkeen nämä eristetyt ionit pilkotaan, jonka jälkeen ne analysoidaan MS/MS:n toisella massa-analysaattorilla. Yhdisteen rakenne voidaan päätellä fragmenttien ja fragmentaatiokaavioiden perusteella. Käytetyin pilkkomismenetelmä on törmäyksen aiheuttama dissosiaatio (collision induced dissosiation, CID) (Glish ja Vachet 2003). 9 Kaavio 2. MS/MS-menetelmän yleinen kaaviokuva. Ennen kuin sydänglykosideja voidaan analysoida massaspektrometrisin menetelmin, täytyy näitä yhdisteitä sisältäviä näytteitä käsitellä tietyillä tavoilla. Tapoja, joilla sydänglykosideja voidaan eristää, on monta, mutta eristäminen voidaan tehdä esimerkiksi seuraavalla tavalla. Ensiksi näytteet on kuivattava. Kuivaus voidaan suorittaa käyttämällä kylmäkuivausta (Ravi, Guardian, Dickman, ja Wang, 2020) tai uunia (Singh, Nimoriya, Rawat, ja Mishra D. K. ja Kanojiya, 2021). Tämän jälkeen näytteet tulee maseroida. Maserointiin voidaan käyttää erilaisia liuottimia, esimerkiksi metanolia, jonka jälkeen näyteseokset jätetään huoneenlämpöön. Liuokset voidaan jättää useiksi päiviksi maseroitumaan (Ravi et al., 2020; Singh et al., 2021). Maseroinnin jälkeen näytteet sentrifugoidaan ja suodatetaan, jonka jälkeen ne voidaan analysoida MS/MS:llä (Singh et al., 2021). 3.1 Näytteensyöttö Näytteensyöttönä käytetään usein jotakin kromatografista menetelmää, jolla voidaan erotella yhdisteitä toisistaan samalla kun niitä syötetään massaspektrometrille. Näistä nestekromatografiset menetelmät ovat muodostuneet yleisimmiksi erotusmenetelmäksi MS/MS-analyysien yhteydessä (van der Gugten, 2020). Nestekromatogrammissa (LC) käytetään pumppua sekä kahta faasia yhdisteiden erotteluun. Faaseina LC:ssä ovat ajoliuotin eli liikkuva faasi sekä kolonni eli kiinteä faasi. Näyte injektoidaan liikkuvaan faasiin, joka koostuu vedestä ja jostakin orgaanisesta liuottimesta. Kolonnin materiaalina käytetään usein piidioksidipohjaisia yhdisteitä, joissa on kiinni eripituisia ja erilaisia hiiliketjuja. Tyypillisimpinä hiilirunkoina ovat C8- ja C18-rakenteet (Cielecka-Piontek, Zalewski, Jelińska, ja Garbacki, 2013). Analysoitavat yhdisteet vuorovaikuttavat kolonnimateriaalin kanssa riippuen kyseisen yhdisteen rakenteesta, sekä käytetystä ajoliuottimesta, jolloin yhdisteet erottuvat toisistaan. LC:tä voidaan käyttää normaali-ilmanpaineessa tai tätä suuremmissa paineissa, jolloin kromatografin erotuskyky paranee. Tällöin puhutaan korkean erotuskyvyn nestekromatografiasta (HPLC) tai erittäin korkean erotuskyvyn nestekromatografiasta (UHPLC). Erotukset nimissä riippuvat käytetyistä paineista ja kolonnimateriaalin partikkelikoosta. HPLC kykenee käyttämään 400 baarin painetta, kun taas UHPLC kykenee käyttämään jopa 1500 baarin painetta (Anette M., Thomas R. ja Yvonne P., 2016). 10 3.2 Ionisaatiomenetelmät Ionisaatiomenetelmiä on kehitetty useita, mutta biomolekyylien tutkimisessa näistä yleisimmäksi ovat muodostuneet sähkösumutusionisaatio (ESI) ja matriisiavusteinen laserdesorptioionisaatio (MALDI) (Glish ja Vachet 2003). Näistä erityisesti ESI on muodostunut hyvin yleiseksi ionisaatiomenetelmäksi 1980-luvulta lähtien (van der Gugten, 2020). ESI käyttää sähkövirtaa ionien muodostamiseen. Ionien muodostus tapahtuu kolmessa vaiheessa. Ensimmäiseksi näyteliuos sumutetaan sähköisesti varautuneiksi pisaroiksi. ESI:ssä käytetään sumutuskaasuna usein typpeä nopeuttamaan näytteen virtausnopeutta. Toiseksi ionit erotellaan pisaroista. Erotteleminen tapahtuu ensin haihduttamalla pisaroita, mikä kasvattaa pintavaraustiheyttä. Kun sähköinen varaus saavuttaa kriittisen pisteen, pisaroissa olevat ionit siirtyvät kaasufaasiin. Kolmanneksi kaasufaasissa olevat ionit siirretään näytteenottokartiolle, josta ne kiihdytetään massa-analysaattoriin (Bruins, 1998). ESI:n eräänä tunnusomaisena piirteenä on sen kyky tehdä useasti varautuneita ioneja, mikä puolestaan antaa massa-analysaattoreille kyvyn analysoida suurempia ioneja kuin mitä ne normaalisti kykenisivät havaitsemaan (Glish ja Vachet 2003). ESI:n etuna on myös sen liittäminen eri nestekromatografisiin menetelmiin, jolloin HPLC- ja UHPLC-tekniikoita voidaan hyödyntää massaspektrometrisen analyysin tukena. Haittapuolena ESI:ssä on sen herkkyys suoloja vastaan. Tämän takia syötettävästä näytteestä on poistettava suoloja. Lisäksi johtuen ESI:n virtaavasta luonteesta osa näytteestä menee hukkaan, mikä haittaa kvantitatiivista määritystä (Glish ja Vachet 2003). MALDIssa ionien muodostaminen saadaan aikaiseksi ajoitetuilla lasersäteilytyksillä (Siuzdak, 1994). Näyte kiinnitetään kiinteäfaasimatriisiksi käyttämällä esimerkiksi 2,5- dihydroksibentsoehappoa, joka kykenee absorboimaan laserin emittoimaa tiettyä valon aallonpituutta pienentäen samalla lasersäteilyn näytteeseen aiheuttamaa vahinkoa. Säteilytyksen seurauksena syntyy yleensä yksinkertaisesti varautuneita ioneja, jotka ovat kaasufaasissa. Tämän jälkeen kaasufaasissa olevat ionit ohjataan sähköstaattisesti massa-analysaattorille (Siuzdak, 1994). MALDI:n hyvinä puolina on sen menetelmä ionisoida näytteitä ajoittain, mikä pienentää näytehävikkiä (Glish ja Vachet 2003). MALDI:n eräänä haittapuolena on sen yhteiskäytön hankaluus tiettyjen massa-analysaattoreiden kanssa. MALDI:a käytetäänkin usein lentoaika-analysaattoreiden (TOF) kanssa (Glish ja Vachet 2003). 3.3 Massa-analysaattorit Massa-analysaattorit erottelevat ioneja toisistaan m/z-suhteen perusteella. Yleisesti ottaen ionisoitujen molekyylien erottelu perustuu niiden ioniseen liikerataan sähkö- ja magneettikentässä. 11 Tämä seikka on johtanut siihen, että massa-analysaattoreita on kehitetty useita erilaisia (Allewell et al., 2013). Tässä tutkielmassa keskitytään seuraaviin massa-analysaattoreihin ja näiden yhdistelmiin sydänglykosidien analysoinnissa: lentoaika (TOF), kolmoiskvadrupoli (QQQ), orbitrap sekä kvadrupoli ioniloukku. TOF on periaatteellisesti yksinkertaisin massa-analysaattori (Glish ja Vachet 2003). TOFissa ionit kiihdytetään vakiojännitteellä (1–20 kV) kammioon. Kammio, jossa lennot tapahtuvat, on tietyn mittainen, yleensä noin 0,5–2 m riippuen valmistajasta. Ionit liikkuvat eri nopeudella riippuen niiden massasta. Kuluneesta ajasta ja matkasta vakiojännitelähteeltä detektorille saadaan m/z-suhde selvitettyä. (Glish ja Vachet 2003). TOF-analysaattorin resoluutio on jopa 60 000 (Greaves ja Roboz 2013). TOF:n etuina on sen laaja massa-alue, hyvä herkkyys ja toistonopeus sekä korkea resoluutio (Glish ja Vachet 2003). TOF:n haittoja ovat verrattain suuri analysaattorin koko.Kvadrupoli on laite, joka koostuu jännitteellä varatuista kohdistuvista linsseistä sekä neljästä keskenään kohtisuorasta tangosta, joiden väliseen tilaan muodostetaan sähkökenttä xy-tasossa. Sähkökenttään saapuessaan ionisoidut molekyylit lentävät kiertoradalla. Linssien jännitettä ja kvadrupolien sähkökentän voimakkuutta säätämällä saadaan kvadrupolista suodatettuja ioneja, joilla on haluttu m/z-suhde (de Hoffmann ja Stroobant, 2007). Kvadrupoleja voidaan laittaa useampi peräkkäin. Yleensä käytetään kolmea kvadrupolia, jolloin voidaan suorittaa tandemassaspektrometrisiä mittauksia. QQQ-massaspektrometriassa ensimmäinen kvadrupoli asetetaan lähettämään ioneja, toinen kvadrupoli asetetaan törmäyskammioksi ja kolmas asetetaan lähettämään pilkkoutuneet ionit detektorille (Allewell et al., 2013). Kvadrupolien haittapuolina on rajallinen massa-alue, noin 4000 Da, mikä haittaa suurempien yhdisteiden analysointia (Allewell et al., 2013). Lisäksi kvadrupolien resoluutiokyky on suhteellisen matala, noin 2000 (de Hoffmann ja Stroobant, 2007), mikä haittaa kvantitatiivista määritystä. Kvadrupolien etuina ovat matala hinta sekä automaation helppous, mistä johtuen QQQ on yleisesti käytetty MS/MS-menetelmä (Glish ja Vachet 2003). Lisäksi kvadrupolien etuina ovat hyvä herkkyys (Allewell et al., 2013), jonka takia kvadrupoleja käytetäänkin usein muiden massa-analysaattoreiden kanssa MS/MS-järjestelmässä. Ioniloukku on massa-analysaattori, joka muuttuvia sähkökenttiä käyttämällä pyrkii varastoimaan ioneja. Ioniloukku toimii samanlaisin periaattein kuin kvadrupolitkin (Glish ja Vachet 2003). Erotuksena kvadrupoleihin on kuitenkin se, että ioniloukussa sähkökenttä muodostetaan kolmiulotteiseksi myös z-akselille, jolloin analysaattorille tuotuja ioneja voidaan pitää loukussa. Eräs ioniloukun ominaisia piirteitä on sen kyky pilkota loukossa olevia ioneja ja selektiivisesti valikoida 12 fragmentit, jotka halutaan pilkkoa. Tällöin ioniloukulla voidaan muodostaa MSn-spektrejä ionisoiduille yhdisteille (de Hoffmann ja Stroobant 2007). Ioniloukun hyviin puoliin kuuluvat hyvä massaherkkyys sekä käytön suhteellinen helppous (Glish ja Vachet 2003). Vastaavasti huonoja puolia ioniloukulla ovat matala resoluutio, noin 4000, sekä rajallinen massa-alue, noin 6000 Da (Glish ja Vachet 2003; de Hoffmann ja Stroobant 2007). Orbitrap on massa-analysaattori, jonka avulla kyetään suorittamaan korkean resoluution massa-analyysiä. Orbitrap muodostuu kahdesta elektrodista, ulko- ja sisäelektrodista. Ionit syötetään kohtisuorasti elektrodien välistä usean kilovoltin kineettisellä energialla, jolloin ionit alkavat värähdellä monimutkaisina spiraaleina sisäelektrodin ympärillä. Nämä värähtelyt saadaan puolestaan muunnettua m/z-arvoksi Fourier-muunnoksen avulla (de Hoffmann ja Stroobant 2007). Orbitrapin etuina on sen suuri resoluutiokyky, jopa 560 000, mikä mahdollistaa yhdisteiden tarkan m/z-arvon määrittämisen (de Hoffmann ja Stroobant 2007). Orbitrapilla on myös laaja massa- alue, jopa 50 000 Da. Orbitrapin käytön haasteena on analysaattorin korkea hinta, mikä hankaloittaa analysaattorin hankkimista. 4. MS/MS-fragmentaatio Sydänglykosidien MS/MS-pilkkoutumisreitit riippuvat tutkitusta yhdisteestä ja ionimoodista. Sydänglykosidien massaspekristä voidaan havaita [M+H]+ ja [M+Na]+-addukteja positiivisella ionimoodilla (Ravi et al., 2020). Näiden lisäksi voidaan havaita myös [M+NH4]+-addukteja, mikäli nestekromatografin liikkuvana faasina on käytetty ammoniumia sisältäviä yhdisteitä (Kanojiya ja Madhusudanan 2012). Vastaavasti negatiivisella ionimoodilla voidaan havaita [M-H]--, [M+HCOO]- - ja [M+CH3COO]--addukteja, mikäli nestekromatografin liikkuvana faasina on käytetty muurahaishappoa tai etikkahappojohdannaisia sisältäviä yhdisteitä. Lisäksi [M+Cl]--addukteja voidaan havaita myös havaita. Positiivinen ionimoodi on yleisin käytetty moodi sydänglykosidien MS/MS-mittauksessa. Sydänglykosidien pilkkoutumisreiteillä on tiettyjä samankaltaisuuksia, jotka voidaan havaita. Sydänglykosideille sokerienyksiköiden pilkkoutuminen on tunnusomaista. Sokeriyksiköiden pilkkoutumiset havaitaan O-glykosidisidosten katkeamisena, jotka voivat tapahtua joko yksitellen tai useamman sokeriyksikön ryhmissä. Otetaan alustaviksi esimerkeiksi digoksiini ja digitoksiini, joiden rakenteet on esitetty kuvassa 2. 13 Kuva 2. Digoksiinin, digitoksiinin ja digitoksoosin rakennekaavat sekä näiden vastaavat molekyylipainot. Digoksiinin tapauksessa voidaan havaita positiivisella ionimoodilla yhden, kahden ja kolmen digitoksoosiyksikön (lyhennys Dx) pilkkoutumiset [M-Dx+H]+, [M-2Dx+H]+, [M-3Dx+H]+ (Ravi et al., 2020). MS/MS-spektristä nämä pilkkoutumiset havaitaan m/z-arvoilla 651, 521 ja 391 Da. Näiden lisäksi voidaan myös havaita kolmen OH-ryhmän pilkkoutumiset H2O-molekyylin lohkeamisina [M- 3Dx-H2O+H]+, [M-3Dx-2H2O+H]+, [M-3Dx-3H2O+H]+ steroidirungosta, jotka havaitaan m/z- arvoilla 373, 355 ja 333 Da. Vastaavasti digitoksiinin tapauksessa massaspektristä havaitaan digitoksoosiyksiköiden pilkkoutumiset [M-Dx+H]+, [M-2Dx+H]+, [M-3Dx+H]+ m/z-arvoilla 635, 505 ja 375. OH-ryhmien pilkkoutumisia steroidirungosta havaitaan vain kaksi, [M-3Dx-H2O+H]+, [M-3Dx-2H2O+H]+, m/z- arvoilla 357 ja 339 Da (Ravi et al., 2020). Molempien yhdisteiden spektrikaavioista voidaan havaita myös [Dx-H2O+H]+, eli protonoitunut digitoksoosiyksikkö, josta on lohjennut H2O-molekyyli, m/z- arvolla 131 (Ravi et al., 2020). Kuvassa 3 on esitetty digoksiinin erilaisia pilkkoutumisreittejä. 14 Kuva 3. Digoksiinista havaitut fragmentit MS-spektrien perusteella (Ravi et al., 2020). Mielenkiintoinen havainto on se, että näiden spektripiikkien suhteelliset intensiteetit vaihtelevat. Digoksiinilla [M-Dx+H]+ piikki havaitaan vahvimpana, kun taas digitoksiinilla [M- 3Dx+H]+ havaitaan vahvimpana (Ravi et al., 2020). Sydänglykosideista irronneet sokeriosat voivat edelleen pilkkoutua. Sokeriosista voidaan havaita OH-ryhmän pilkkoutuminen, joka havaitaan H2O-molekyylin lohkeamisena. (Ravi et al., 2020). Singh et al. (2021) puolestaan ovat havainnoineet sokeriosien pilkkoutumista tarkemmin. Kaksiketjuisesta heksoosisokerista, β-D-glukopyranosyyli-β-D-diginopyranosidi, voidaan havaita OH-ryhmän pilkkoutuminen, joka havaitaan H2O-ryhmän lohkeamisena. Tämä havaitaan kuitenkin varsin heikosti MS/MS-spektrissä (Singh et al., 2021). Heksoosisokerien O-glykosidisidoksen pilkkoutuminen havaitaan puolestaan hyvin voimakkaina, mitkä havaitaan MS/MS-spektrissä m/z- arvoilla 145 ja 163 Da. Pilkkoutuneista sokeriyksiköistä puolestaan havaitaan OH-ryhmien ja eetterihappien pilkkoutumisia H2O-molekyyleinä. Steroidirunkoon liittyneet erilaiset substituentit pilkkoutuvat erilaisilla herkkyyksillä. Esimerkiksi oleandrigeniinista havaitaan OH-ryhmien lisäksi myös AcO-ryhmän pilkkoutuminen 15 C16-hiilestä (Singh et al., 2021). AcO-ryhmän pilkkoutuminen tapahtuu helpommin kuin OH- ryhmien pilkkoutuminen, mikä havaitaan massaspektrissä CH3COOH:n pilkkoutumisena. Vastaavasti adynerigeniinin ββ-8,14 epoksidiryhmä pilkkoutuu OH-ryhmiä hankalammin. Tämä havaitaan H2O-molekyylin lohkeamisena (Singh et al., 2021). Metyyliryhmien lohkeamista ei ole havaittu. Oleandrigeniinin ja adynerigeniinin rakennekaavat on esitetty kuvassa 4. Kuva 4. Adynerigeniinin ja oleandrigeniinin molekyylikaavat. Sydänglykosidien laktoniosat voivat myös pilkkoutua. Kardenoliineissa C17-hiilessä on kiinni 2- furanoni (Taulukko 1.), jonka pilkkoutuminen voidaan havaita eri tavoilla. Esimerkiksi 2-furanonin ketohapen pilkkoutuminen C2-asemasta voidaan havaita MS/MS-spektrissä H2O-molekyylin lohkeamisena (Singh et al., 2021). Tämä säilyttää rengasrakenteen. Lisäksi 2-furanonin pilkkoutumisessa voidaan myös havaita eetterihapen H2O-lohkeaminen ja CO-molekyylien lohkeaminen saman aikaisesti 2-furanonin C5-asemasta. Tällöin rengasrakenne puolestaan purkautuu tyydyttymättömäksi kolmen hiilen ketjuksi, jonka päässä on ketoniryhmä (Singh et al., 2021). Lisäksi 2-furanonista voi pilkkoutua myös eetterihappi ja ketonihappi C2-asemasta, mikä havaitaan MS/MS- spektrissä CO2-molekyylin lohkeamisena (Li et al., 2010). Tällöin rakenne purkautuu tyydyttymättömäksi kolmen hiilen rengasrakenteeksi. Huomioitavaa on, että 2-furanonin ei havaita pilkkoutuvan kokonaan. 2-furanonin pilkkoutumista on kuvattu kuvassa 5. Kuva 5. 2-futanonin havaitut pilkkoutumiset MS/MS-spektrissä, jossa R on jonkin sydänglykosidin steroidirunkojohdannainen. 16 Bufadienolideissa on C17-hiilessä kiinni 2-pyroni (Taulukko 1.) Bufadienolideissa havaitaan samoja lainalaisuuksia kuin kardenoliineissakin. Otetaan esimerkeiksi bufaliini ja bufotaliini (kuva 6). Kuva 6. Bufaliinin ja Bufotaliinin molekyylikaavat sekä molekyylipainot. Bufaliinin MS/MS-spektristä havaitaan kahden OH-ryhmän pilkkoutumiset, jotka havaitaan H2O- molekyylien lohkeamisina ([M-H2O+H]+, [M-2H2O+H]+) (Wong, Tsui, ja Kwan 2002). 2-pyronin havaitaan pilkkoutuvan kokoaan. Vastaavasti bufotaliinin MS/MS-spekrissä havaitaan AcO- pilkkoutuminen C16-hiilestä sekä kahden OH-ryhmän lohkeamiset H2O-molekyyleinä (Liu et al., 2024). Tämän lisäksi voidaan havaita joko H2O:n lohkeaminen 2-pyronin eetterihapesta tai CO:n lohkeaminen. Tällöin muodostuu joko tyydyttymätön syklopentadienoni tai furaani. Tästä edelleen voidaan havaita H2O:n tai CO:n lohkeamiset riippuen edellisistä lohkeamista, jolloin muodostuu tyydyttynyt nelirengas 1,3-syklobutadieeni. 2-pyronin voidaan myös havaita lohkeavan kokonaan (Liu et al., 2024). Kuva 7. 2-pyronin havaitut pilkkoutumiset MS/MS-spektrissä, jossa R on jonkin sydänglykosidin steroidirunkojohdannainen. 17 5. Datan hyödyntäminen Kuten tässäkin tutkielmassa on esitetty eivät sydänglykosidien pilkkoutumiskaaviot ole yksiselitteisiä. Bioyhdisteiden todentaminen ESI-MS/MS:llä on hankalaa, mikä johtuu tarkkojen mitattujen spektrien tulkinnan hankaluudesta (Allen, Greiner ja Wishart, 2013). Perinteisesti käytetyt menetelmät yhdisteiden tunnistamiseen perustuvat MS/MS-spektrien vertailuun. Ongelmaksi tässä muodostuu tietokantojen niukkuus, joihin spektrejä voisi verrata. Tietokantojen lisäys voisi olla eräs keino mittaustiedon hyödyntämiseksi vastaisuudessa, mutta tämä puolestaan vie aikaa. Tätä ongelmaa helpottamaan on kehitetty useita laskennallisia menetelmiä (Bremer, Vaniya, Kind, Wang, ja Fiehn, 2022). Nämä menetelmät pohjautuvat säännönmukaisiin pilkkoutumisen mallintamisen työkaluihin, jotka pohjautuvat orgaanisen kemian ja kvanttikemian sääntöihin. Muita vaihtoehtoja ovat esimerkiksi koneoppimisisen hyödyntäminen MS/MS-spektrien ennustamisessa, jossa tilastollisille malleille annetaan parametrit, joiden avulla muodostetaan spektrejä yhdisteiden spektrisuhteiden perusteella (Bremer et al., 2022). Eräs tällainen koneoppimista käyttävä menetelmä on kilpaileva fragmentaatiomallinnus (CFM) (Allen, Greiner ja Wishart, 2014; Bremer et al., 2022). ESI/MS/MS-fragmentaatiokaaviot mallinnetaan stokastisena ja homogeenisena markovin prosessina, johon sisällytetään varautuneiden fragmenttien tilanmuutokset. Nämä mallinnukset tehdään CID:ä käyttämällä, jolloin mallinnukset ja laskut pitävät sisällään myös hajoamistaipuvuuden eli kuinka helposti jokin osa saattaisi irrota CID:ssä yhdellä tietyllä törmäysenergialla. Tällöin puhutaan yhden energian kilpailevasta fragmentaatiomallinnuksesta eli SE-CFM:stä Edellinen prosessi toistetaan useammalla törmäysenergialla, jolloin puolestaan puhutaan useamman energian kilpailevasta fragmentaatiomallinnuksesta eli CE-CFM:stä (Allen, Greiner ja Wishart, 2013). CFM:n avulla voidaan tehdä kolme eri toimintoa, joiden avulla voidaan ennustaa yhdisteiden MS/MS-spektrejä (Allen, Pon, Wilson, Greiner, ja Wishart, 2014). Ensimmäiseksi CFM ennustaa spektrin tietylle yhdisteelle useammalla törmäysenergialla. Ohjelma asettaa prekursori-ionien muutokset riippuen käytetystä ionimoodista joko [M-H]-- tai [M+H]+-ionille. Yleiset adduktit otetaan tässä myös huomioon. Tämän jälkeen algoritmi luettelee mahdolliset fragmentit todennäköisyyksien perusteella käyttäen määritettyä SE-CFM mallia. On kuitenkin hyvä huomata, että CFM ei kykene ennustamaan MS/MS-spektrin piikkien intensiteettiä, jolloin intensiteetit määräytyvät [M-H]-- tai [M+H]+-ioneille asetettujen intensiteettien mukaan (Allen et al., 2014). Toiseksi CFM asetetaan määrittämään piikkejä (Allen et al., 2014). Tämä saadaan aikaiseksi siten, että CFM luettelee kaikki mahdolliset fragmentit alkuperäisestä molekyylistä ja määrittelee massatoleranssirajat kullekin piikille. Piikeille voidaan asettaa useita eri vaihtoehtoisia rakenteita, 18 jolloin ne järjestellään todennäköisyyksien mukaan. Tämän jälkeen kustakin spektristä muodostetaan graafinen esitys (Allen et al., 2014). Kolmanneksi CFM asetetaan tunnistamaan yhdisteitä, jolloin yhdistetään ensimmäisen ja toisen vaiheen tulokset (Allen et al., 2014). Näitä tuloksia voi verrata käyttäjän asettamiin ehdokasrakenteisiin tai olemassa oleviin tietokantoihin. Tietokantoja verratessa käyttäjän tulee määrittää prekursori-ionin massa, mahdolliset adduktit sekä massatoleranssit, josta edelleen massatoleranssit voidaan asentaa sen mukaisiksi, millaista MS/MS-laitteistoa käytetään (Allen et al., 2014). CFM:n on kykenevä ennustamaan hyvin pienikokoisia tyydyttymättömiä hiilirengasrakenteita (Bremer et al., 2022). CFM ei kuitenkaan ole toistaiseksi kykenevä ennustamaan tätä monimutkaisempia rakenteita ja esimerkiksi heterosyklisten hiilirengasrakenteiden ennustaminen ei onnistu suurella tarkkuudella. CFM voi kuitenkin toimia yhdisteiden tunnistuksen tukena, koska CFM kykenee antamaan vaihtoehtoisia ehdokasrakenteita havaituille spektrien piikeille (Bremer et al., 2022). 6. Yhteenveto ja johtopäätökset Sydänglykosideja käytetään edelleen sydämen vajaatoiminnan hoidossa, vaikka niiden käyttöä onkin vähennetty. Sydänglykosideilla on myös potentiaalia syöpälääkkeinä. MS/MS:n käyttö on muodostunut tehokkaaksi menetelmäksi sydänglykosidien kvalitatiivisessa analysoinnissa. Erityisesti ESI-MS/MS:n käyttö on muodostunut yleiseksi menetelmäksi. Tämä johtuu ESI:n kyvystä tuottaa runsaasti [M+H]+ tai [M-H]- ioneja riippuen ionimoodista rikkomatta analysoitavia yhdisteitä ionisoimisvaiheessa. ESI voidaan myös kytkeä nestekromatografisiin laitteisiin, jolloin kyetään erottelemaan polaarisia bioaktiivisia yhdisteitä. Sydänglykosidien MS/MS-fragmentaatiokaaviosta havaitaan tiettyjä samankaltaisuuksia riippumatta käytetystä MS/MS-laitteistosta eli käytetyillä analysaattoreilla ja törmäyskammioilla ei ole merkittävää vaikutusta fragmentaatioon. Sydänglykosideilla sokerien pilkkoutumiset ovat hyvin tavanomaisia. Sokeriosien havaitaan pilkkoutuvan joko yksittäin tai useamman sokerin ryhmissä riippuen yhdisteessä olevista sokeriosien määristä. Sydänglykosidien steroidirungossa kiinni olevat muut substituentit voivat myös pilkkoutua. Sydänglykosidien määrityksessä voidaan spektrikirjastojen lisäksi hyödyntää koneoppimista saman aikaisesti CFM:ää, vaikka CFM itsessään ei välttämättä kykene riittävän tarkkaan analyysiin. Kuitenkin CFM voisi olla potentiaalisesti hyvä apu sydänglykosidien sokeriosien ja steroidirungossa olevien substituenttien pilkkoutumisten määrityksessä. 19 Viitteet Allen, F., Pon, A., Wilson, M., Greiner, R., & Wishart, D. (2014). CFM-ID: A web server for annotation, spectrum prediction and metabolite identification from tandem mass spectra. Nucleic Acids Research, 42(W1). https://doi.org/10.1093/nar/gku436 Allewell, N. M., Narhi, L. O., & Rayment, I. (2013). Biophysics for the Life Sciences Molecular Biophysics for the Life Sciences. Retrieved from http://www.springer.com/series/10230 Anette M., Thomas R., & Yvonne P. (2016). Analytical Techniques in the Pharmaceutical Sciences (A. Müllertz, Y. Perrie, & T. Rades, Eds.). New York, NY: Springer New York. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-4029-5 Botelho, A. F. M., Pierezan, F., Soto-Blanco, B., & Melo, M. M. (2019, February 1). A review of cardiac glycosides: Structure, toxicokinetics, clinical signs, diagnosis and antineoplastic potential. Toxicon, Vol. 158, pp. 63–68. Elsevier Ltd. https://doi.org/10.1016/j.toxicon.2018.11.429 Bremer, P. L., Vaniya, A., Kind, T., Wang, S., & Fiehn, O. (2022). How well can we predict mass spectra from structures? benchmarking Competitive Fragmentation Modeling for metabolite identification on untrained tandem mass spectra. Journal of Chemical Information and Modeling, 62(17), 4049–4056. https://doi.org/10.1021/acs.jcim.2c00936 Bruins, A. P. (1998). Mechanistic aspects of electrospray ionization. Journal of Chromatography A, 794, 345–357. Cielecka-Piontek, J., Zalewski, P., Jelińska, A., & Garbacki, P. (2013). UHPLC: The greening face of liquid chromatography. Chromatographia, 76(21–22), 1429–1437. https://doi.org/10.1007/s10337-013-2434-6 Dashti, F., Jamshed, F., Ouyang, X., Mehal, W. Z., & Banini, B. A. (2023). Digoxin as an emerging therapy in noncardiac diseases. CellPress, 44(4), 199–203. de Hoffmann, E., & Stroobant, V. (2007). Mass spectrometry principles and applications (3rd ed.). John Wiley & Sons, Inc,. Felicity, A., Greiner, R., & Wishart, D. (2014). Competitive Fragmentation Modeling of ESI-MS/MS spectra for putative metabolite identification. https://doi.org/10.1007/s11306-014-0676-4 Glish, G. L., & Vachet, R. W. (2003). The basics of mass spectrometry in the twenty-first century. Nature Reviews Drug Discovery, 2(2), 140–150. https://doi.org/10.1038/nrd1011 Greaves, J., & Roboz, J. (2013). Mass Spectrometry for the Novice. Grovesa, M. J., & Bissetb, N. G. (1991). A note on the use of topical Digitalis prior to William Withering. Journal of Ethnopharmacology, 35, 99–102. 20 Kanojiya, S., & Madhusudanan, K. P. (2012). Rapid identification of calotropagenin glycosides using high-performance liquid chromatography electrospray ionisation tandem mass spectrometry. Phytochemical Analysis, 23(2), 117–125. https://doi.org/10.1002/pca.1332 Kumavath, R., Paul, S., Pavithran, H., Paul, M. K., Ghosh, P., Barh, D., & Azevedo, V. (2021). Emergence of cardiac glycosides as potential drugs: Current and future scope for cancer therapeutics. Biomolecules, 11(9). https://doi.org/10.3390/biom11091275 Li, Y., Wu, X., Li, J., Wang, Y., Yu, S., Lv, H., … Du, D. (2010). Identification of cardiac glycosides in fractions from Periploca forrestii by high-performance liquid chromatography/diode-array detection/electrospray ionization multi-stage tandem mass spectrometry and liquid chromatography/nuclear magnetic resonance. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences, 878(3–4), 381–390. https://doi.org/10.1016/j.jchromb.2009.12.008 Liu, R., Zhang, Y., Zhang, R., Zeng, H., Shen, Y., Li, X., … Ye, J. (2024). Identification of anti-tumor constituents from toad skin and toad venom by UPLC-QTOF/MS in-depth chemical profiling combined with bioactivity-based molecular networking. Arabian Journal of Chemistry, 17(1). https://doi.org/10.1016/j.arabjc.2023.105427 Prassas, I., & Diamandis, E. P. (2008). Novel therapeutic applications of cardiac glycosides. Nature Reviews Drug Discovery, 7(11), 926–935. https://doi.org/10.1038/nrd2682 Ravi, B. G., Guardian, M. G. E., Dickman, R., & Wang, Z. Q. (2020). Profiling and structural analysis of cardenolides in two species of Digitalis using liquid chromatography coupled with high- resolution mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 1618, 1–10. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2020.460903 Ren, Y., Anderson, A. T., Meyer, G., Lauber, K. M., Gallucci, J. C., & Douglas Kinghorn, A. (2024). Digoxin and its Na+/K+-ATPase-targeted actions on cardiovascular diseases and cancer. Bioorganic and Medicinal Chemistry, 114, 1–14. https://doi.org/10.1016/j.bmc.2024.117939 Singh, Y., Nimoriya, R., Rawat, P., Mishra D. K. & Kanojiya, S. (2021). Structural analysis of diastereomeric cardiac glycosides and their genins using ultraperformance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 32(5), 1205–1214. https://doi.org/10.1021/jasms.1c00017 Siuzdak, G. (1994). Review the emergence of mass spectrometry in biochemical research. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 91, 11290– 11297. Retrieved from https://www.pnas.org 21 van der Gugten, J. G. (2020, January 1). Tandem mass spectrometry in the clinical laboratory: A tutorial overview. Clinical Mass Spectrometry, Vol. 15, pp. 36–43. Elsevier B.V. https://doi.org/10.1016/j.clinms.2019.09.002 Whayne Jr, T. F. (2018). Clinical use of Digitalis: A State of the Art Review. American Journal of Cardiovascular Drugs, 18(6), 427–440. https://doi.org/10.1007/s40256-018-0292-1 Wong, S.-K., Tsui, S.-K., & Kwan, S.-Y. (2002). Analysis of proprietary Chinese medicines for the presence of toxic ingredients by LC/MS/MS. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 30, 161–170. Retrieved from www.elsevier.com/locate/jpba Ziff, O. J., & Kotecha, D. (2016). Digoxin: The good and the bad. Trends in Cardiovascular Medicine, 26(7), 585–595. https://doi.org/10.1016/j.tcm.2016.03.011