Kasvupaikan sijainnin ja lämpötilan vaikutus puolukan (Vaccinium vitis-idaea) haihtuviin yhdisteisiin Pro gradu -tutkielma Turun yliopisto Bioteknologian laitos Molekyylibiotieteiden tutkinto-ohjelma Helmikuu 2023 Sanni Tuominen Turun yliopiston laatujärjestelmän mukaisesti tämän julkaisun alkuperäisyys on tarkastettu Turnitin OriginalityCheck -järjestelmällä TURUN YLIOPISTO Bioteknologian laitos SANNI TUOMINEN: Kasvupaikan sijainnin ja lämpötilan vaikutus puolukan (Vaccinium vitis-idaea) haihtuviin yhdisteisiin Pro gradu -tutkielma, 51 s., 7 liites. Matemaattis-luonnontieteellinen tiedekunta Helmikuu 2023 Turun yliopiston laatujärjestelmän mukaisesti tämän julkaisun alkuperäisyys on tarkastettu Turnitin Originality Check -järjestelmällä. _______________________________________________________________ Monikäyttöinen puolukka eli Vaccinium vitis-idaea ei ole maailmalla yhtä suosittu kuin pohjoismaissa. Suomessa puolukkaa poimitaan vuosittain jopa 100 miljoonaa kiloa, mutta myyntiin päätyy keskimäärin 4,7 miljoonaa kiloa. Puolukan kaupallinen viljely on vähäistä: maailmanlaajuisesti vain 71 hehtaarilla kasvaa puolukkaa. Puolukan happamuus tekee siitä haastavan elintarvikkeen, ja siksi puolukkaan liittyvää tutkimusta on tehty suhteellisen vähän muihin marjoihin verrattuna. Hapan puolukka kuitenkin säilyy hyvin sen sisältämän bentsoehapon ansiosta ja sisältää lisäksi C-vitamiinia sekä hivennäis- ja kivennäisaineita. Marjan aromiprofiili muodostuu haihtuvista orgaanisista yhdisteistä, kuten estereistä, aldehydeistä, alkoholeista ja terpeeneistä. Työssä uutettiin haihtuvia yhdisteitä norjalaisista ja suomalaisista puolukoista kiinteäfaasiuutto-tekniikkaa hyödyntäen. Uuton jälkeen yhdisteet analysoitiin kaasukromatografimassaspektrometrillä (GC-MS). Norjalaisia näytteitä oli kahta eri tyyppiä: kasvuhuoneessa 9 °C ja 15 °C kasvatettuja puolukoita sekä viiden eri kypsyysasteen puolukoita kahdelta eri paikkakunnalta (Ås ja Tromssa). Kasvuhuone tarkoittaa hallittua kasvuympäristöä, jossa muun muassa kasvulämpötila ylläpidetään tasaisena koko kasvun ajan. Tutkimuksen tarkoituksena oli kvalitatiivisesti ja kvantitatiivisesti kartoittaa puolukan haihtuvat yhdisteet sekä selvittää lämpötilan, kasvupaikan ja kypsyysasteen vaikutus. Haihtuvia yhdisteitä tunnistettiin kokonaisuudessaan 60. Bentsoehappo oli runsain yhdiste suurimmassa osassa näytteitä ja sen pitoisuus nousi marjan kypsymisen edetessä. Kypsemmistä näytteistä löytyi myös etanolia ja alkoholien hajoamistuotteita. Näytteistä löydettiin lisäksi muita tuoksuvia yhdisteitä, kuten linaloolia, joka tuoksuu kukkaiselta ja yrttimäisen tuoksuista eukalyptolia. Vihreän tuoksuiset heksanaali, 2-heksenaali, 3-heksenaali ja 1-heksanoli olivat bentsoehapon ohella runsaimpia haihtuvia yhdisteitä puolukassa. 9°C:ssa kasvaneista marjoista löytyi vähemmän bentsoehappoa, mutta enemmän heksanaalia, 2- ja 3-heksenalia kuin 15 °C:ssa kasvaneista. Avainsanat: puolukka, haihtuva yhdiste, lämpötila, sijainti, kypsyysaste, SPME, GC-MS, aromiprofiili Ut sementem feceris, ita metes Sisällys Lyhenteet ...................................................................................................................... 1 1 Johdanto .................................................................................................................... 2 1.1 Haihtuvat yhdisteet ......................................................................................................... 2 1.2 Haihtuvien yhdisteiden metabolia ................................................................................ 3 1.1.1Terpeenit ................................................................................................................... 4 1.1.2 Esterit ....................................................................................................................... 6 1.1.3 Aldehydit .................................................................................................................. 7 1.1.4 Lipidit haihtuvien yhdisteiden esiasteena ........................................................... 7 1.2 Puolukka, Vaccinium vitis-idaea ................................................................................... 7 1.2.1 Puolukan yhdisteiden bioaktiivisuus .................................................................... 8 1.2.2 Puolukan haihtuvat yhdisteet ............................................................................... 9 1.3 Muiden Vaccinium-marjojen ja mustaherukan haihtuvat yhdisteet ....................... 10 1.3.1 Kangasmustikka, Vaccinium myrtillus L. ja muut mustikat ............................ 10 1.3.2 Karpalo, Vaccinium macrocarpon ja oxycoccos L. ......................................... 12 1.3.3 Mustaherukka, Ribes nigrum. ............................................................................ 14 1.4 Kasvuolosuhteiden vaikutus haihtuviin yhdisteisiin ................................................. 15 1.4.1 Puolukka, Vaccinium vitis-idaea ........................................................................ 15 1.4.2 Kangasmustikka, Vaccinium myrtillus L ja muut mustikat ............................. 16 1.4.3 Mustaherukka, Ribes nigrum .............................................................................. 17 1.5 Kypsyysasteen vaikutus haihtuviin yhdisteisiin marjoissa...................................... 17 1.5.1 Mustaherukka, Ribes nigrum .............................................................................. 18 1.5.2 Mustikka, Vaccinium myrtillus ............................................................................ 18 1.5.3 Mansikat, Fragaria ............................................................................................... 19 1.6 Olosuhteiden vaikutus haihtuviin yhdisteisiin keräyksen jälkeen .......................... 20 1.6.1 Mustaherukka, Ribes nigrum .............................................................................. 20 1.6.2 Vadelma, Rubus idaeus ...................................................................................... 21 1.7 Marjojen käsittelyn vaikutus haihtuviin yhdisteisiin.................................................. 22 1.8 Tutkimuksen tarkoitus .................................................................................................. 23 2 Materiaalit ja menetelmät ......................................................................................... 25 2.1 Näytteiden hankinta ja alkuperä ................................................................................. 25 2.2 Näytteiden valmistaminen ja GC-MS −ajo ................................................................ 27 2.3 Yhdisteiden tunnistus ja varmistus............................................................................. 27 3 Tulokset ................................................................................................................... 28 3.1 Haihtuvien yhdisteiden kvantitointi ja kvalitointi SPME-GC/MS:lla ....................... 28 3.2 Fytotroninäytteet: 9 °C ja 15 °C .................................................................................. 33 3.3 Kypsyysasteen vaikutus haihtuviin yhdisteisiin ........................................................ 39 4 Tulosten pohdinta .................................................................................................... 48 5 Yhteenveto............................................................................................................... 50 6 Lähteet ..................................................................................................................... 52 1 Lyhenteet GC-MS engl. gas chromatography–mass spectrometry, kaasukromatografi-massaspektrometria OAV engl. odor activity value, “tuoksun aktiivisuusarvo” SPME engl. solid-phase microextraction, kiinteäfaasiuutto VOC engl. volatile organic compounds, haihtuvat orgaaniset yhdisteet MVA engl. mevalonic acid, mevalonihappo MEP engl. methylerythritol phosphate, metyylierytritoli DMAPP engl. prenyl diphosphates dimethylallyl diphosphate, dimetyyliallyylipyrofosfaatti GPP engl. geranyl diphosphate, geranyylipyrofosfaatti OPP engl. diphosphate, difosfaatti LOX engl. lipoxygenase, lipoksygenaasi 2 1 Johdanto 1.1 Haihtuvat yhdisteet Haihtuvat yhdisteet ovat osa kasvien tuottamia sekundaarisia metaboliittejä eli aineenvaihdunnan tuotteita, joita kasvi käyttää muun muassa puolustukseen ja pölyttäjien houkutteluun (Berenbaum, 1995). Niiden kirjoon ja määrään kasvissa vaikuttaa kasvupaikka, vuodenaika, kasvin ikä, kypsyysaste ja lajike sekä käsittely ja säilytys (Beaulieu, Stein-Chisholm ja Boykin, 2014). Haihtuvien yhdisteiden luokkia on lukuisia, mutta yleensä marjan tai hedelmän tuoksuun vaikuttaa voimakkaimmin terpeenit, esterit, aldehydit, ketonit ja alkoholit. Haihtuvat yhdisteet jaetaan hallitseviin (engl. major compound) ja vähäisiin yhdisteisiin (engl. minor compound). Hallitsevalla yhdisteellä tarkoitetaan yhdistettä, jota esiintyy runsaimmin ja vähäistä yhdistettä nimensä mukaisesti esiintyy vähän. Tulee kuitenkin huomioida, että yhdisteen konsentraatio ei kerro sen aistittavuudesta. Vähäisiä yhdisteitä saattaa esiintyä alhaisissa konsentraatioissa, mutta ne voivat silti vaikuttaa olennaisesti marjan tai hedelmän tuoksuun. (Hui ja muut 2010.) Usein marjan tai hedelmän ominaistuoksuun ja - makuun merkittävästi vaikuttavia yhdisteitä ovat pienissä määrissä esiintyvät esterit ja terpeenit. Marjojen viljelyssä keskitytään usein tuoksun sijaan maun parantamiseen, vaikka haihtuvat yhdisteet vaikuttavat ajoittain merkitsevästi makuaistimukseen (Small, 2012; Sater ja muut 2020). Marjan ja hedelmän makuun vaikuttaa sokerien, happojen ja suolojen lisäksi erilaiset haihtuvat tuoksuvat yhdisteet, joilla on niin sanottua aromiaktiivisuutta (engl. aromatic activity) (Hui ja muut 2010). Haihtuvat yhdisteet eli volatile organic compounds (VOC) muodostavat marjan tuoksuprofiilin (engl. volatome) ja vaikuttavat samalla myös makuelämykseen nenäontelon hajureseptorien kautta. Ruoan haihtuvat yhdisteet kulkeutuvat suusta nenäonteloon ja takaisin, hienosäätäen maistuvien yhdisteiden flavoria eli makua. Ruoan kautta aistittujen tuoksuvien yhdisteiden haistamista kutsutaan retronasaaliseksi hajuaistiksi. Tällöin ruoasta haihtuvat yhdisteet kulkevat pureskelun yhteydessä kitalaen taakse ja sieltä nenäonteloon. Tuoksuvien 3 yhdisteiden kiinnittyminen nenäontelon reseptoreihin puolestaan synnyttää olfaktorisen aistimuksen eli hajuaistin. (Small 2012; Gilbert ja muut 2015.) Jokaisella haihtuvalla yhdisteellä on sille ominainen raja-arvo, jonka alapuolella ihminen ei pysty enää aistimaan tuoksua. Tuoksun aktiivisuusarvo (engl. odor activity value, OAV) taas kertoo kuinka paljon kyseinen yhdiste vaikuttaa näytteen kokonaistuoksuun. Tuoksun aistimiseen vaikuttaa myös yksilön olfaktorinen fenotyyppi eli perimän määrittelemä tuoksureseptorien kokonaisuus. (Hasin- Brumshtein, Lancet ja Olender, 2009.) Tuoksun voimakkuus on siis muutakin kuin korkea konsentraatio. Haihtuvat yhdisteet voivat olla myös hajuttomia. Nämä kaikki tekijät luovat haasteita haihtuvien yhdisteiden tutkimisessa. Maun ja tuoksun profiloinnin kannalta olisi tärkeätä tutkia haihtuvia yhdisteitä ja niiden OAV:n ja aromiaktiivisuuden vahvuutta. Tuoksun aistiminen ja kokeminen on kuitenkin henkilökohtaista: hajuaisti on tulos 400:n eri hajureseptorin yhteistyöstä ja niitä koodaavista geeneistä. (Niimura, 2012.) Haihtuvien yhdisteiden tunnistamiseen vaikuttaa valittu menetelmä. Kaasukromatografia-massaspektrometri (engl. GC-MS, gas chromatography- mass spectrometry) on yleisesti suosituin menetelmä, mutta silläkin on rajoituksensa. Yhdisteet saattavat eluoitua samoihin aikoihin tai jäädä havainnointirajojen ulkopuolelle. (Elmore, 2015.) 1.2 Haihtuvien yhdisteiden metabolia Kasvit tuottavat muiden yhdisteiden ohella haihtuvia yhdisteitä osana sekundaarista metaboliaa. Sekundaarisilla yhdisteillä on laaja kirjo tehtäviä kasvin puolustuksesta lisääntymiskelpoisuuden parantamiseen. (Singh ja muut 2006.) Nimensä mukaisesti nämä yhdisteet toimivat organismin aineenvaihdunnan toissijaisissa tehtävissä ja niiden määrää säätelee ympäristö ja kasvin kehitys (Berenbaum, 1995). Haihtuvat yhdisteet voidaan myös luokitella primaarisiksi tai sekundaarisiksi niiden esiintymisen mukaan. Primaariset yhdisteet ovat läsnä ehjässä hedelmässä, kun taas sekundaarisia yhdisteitä syntyy vasta soluvaurion myötä. Yhdisteiden määrittämiseen vaikuttaa siis tutkiiko ehjää vai murskattua hedelmää tai marjaa ja tuoksuprofiili voi näin olla hyvinkin erilainen. Haihtuvat yhdisteet voidaan erotella niiden aineenvaihdunnanreittien mukaan: rasvahappojen hapettuminen, 4 aminohappojen metabolia sekä terpeenien ja fenolien synteesi toimivat kaikki esiasteina haihtuville yhdisteille (Hui ja muut 2010). 1.1.1 Terpeenit Terpeenit ovat laaja ja kirjava ryhmä yhdisteitä, jotka muodostuvat kahdesta tai useammasta isopreeniyksiköstä (C5H8). Tämän viisihiilisen isopreeniyksikön eli hemiterpeenin esiasteena on joko mevalonihappo (engl. mevalonic acid, MVA) tai metyylierytritoli fosfaatti (engl. methylerythritol phosphate, MEP). Kasveissa isopreenien synteesi tapahtuukin joko MVA- tai MEP-aineenvaihduntareitin kautta. (Dudareva ja muut 2013.) Isopreeniyksiköiden määrä kertoo mihin alaryhmään terpeeni kuuluu: monoterpeeneissä on kaksi isopreeniyksikköä (C10), seskviterpeeneissä kolme (C15) ja niin edelleen yli kahdeksan isopreeniyksikköä sisältäviin polyterpeeneihin (C40) asti. MVA-reitin kautta syntyy seksviterpeenejä ja MEP-reitin kautta puolestaan hemi-, mono- ja diterpeenejä. Kuviossa 1 on esitetty monoterpeenien synteesi MEP-reittiä pitkin yhdisteestä dimetyyliallyylipyrofosfaatti (engl. prenyl diphosphates dimethylallyl diphosphate eli DMAPP). Prenyylitransferaasi katalysoi reaktiota, jossa se yhdistää DMAPP:n yhden tai useamman isopentenyylipyrofostaatin (engl. isopentyl disphosphate, IPP) kanssa. Reaktio tuottaa geranyylipyrofosfaatin, jonka kasvi muokkaa erilaisiksi monoterpeeneiksi. (Tholl, 2006.) Kuviossa 1 esitetty 1,8-sineolin eli eukalyptolin, (-)-limoneenin ja (-)-α-pineenin rakenteet. Isopreeniyhdisteitä on tunnistettu jo yli 35 000, mutta vain pieni osa näistä on haihtuvia yhdisteitä. Haihtuvia terpeenejä ovat hemi-, homo-, mono- ja seskviterpeenit sekä poikkeavat terpeenit (engl. irregular terpene), joissa hiilien määrä ei ole viidellä jaollinen. (Loreto ja muut 2014; Dudareva ja muut 2013.) 5 KUVIO 1. Monoterpeenien synteesi dimetyyliallyylipyrofosfaatista (DMAPP). Prenyylitransferaasi katalysoi DMAPP:n ja yhden tai useamman isopentenyylipyrofosfaatin (IPP) reaktiota. Reaktio tuottaa geranyylipyrofosfaattia, joka voidaan muokata erilaisiksi monoterpeeneiksi. Muokattu Dorothea Tholl kuvasta kasviterpeenien muodostuminen (Terpene synthases and the regulation, diversity and biological roles of terpene metabolism, 2006). Kasvit syntetisoivat terpeenejä useisiin eri käyttötarkoituksiin: sekundaarisen aineenvaihdunnan tuotteina terpeenit toimivat kasvin puolustuksessa, soluviestinnässä, lisääntymisessä ja lukuisissa muissa tehtävissä abioottisessa ja bioottisessa vasteessa. Terpeeneillä on tärkeä osa myös kasvin primäärisessä aineenvaihdunnassa (Tetali, 2019). Aineenvaihdunnan tehtävien lisäksi terpeeneillä on huomattava vaikutus marjan tuoksuprofiiliin. Vuonna 1992 tehdyssä kirjallisuuskatsauksessa haihtuvista kukkaistuoksuisista yhdisteistä todettiin isopreenien olevan yksi suurimmista kukkaistuoksun omaavista yhdisteluokista. Erityisesti yhdisteitä limoneeni, myrseeni, linanooli, α- ja β- 6 pineeni, osimeenit ja eukalyptoli esiintyi runsaasti. (Knudsen, Tollsten ja Bergström, 1993.) Puolukan marjojen tiedetään sisältävän muun muassa limoneenia, eukalyptolia, linaloolia ja pinenejä (Viljanen ja muut 2014). Kaikki terpeenit eivät ole pelkässä hiilivetymuodossa, vaan suurimmassa osassa rakenteesta löytyy happiatomi. Lukuisat terpeenialkoholit, -aldehydit, -ketonit ja - esterit muodostavat laajan kirjon eri tuoksuja. (Yang ja muut 2020.) Terpeenejä käytetäänkin niin hajuvesissä ja hygieniatuotteissa kuin elintarvikkeissa. Esimerkiksi sitrushedelmän tuoksuisia monoterpeenejä kuten limoneenia ja linaloolia käytetään sitruunan ja limen makuisissa virvoitusjuomissa. (Hausch, Lorjaroenphon ja Cadwallader, 2015.) Monoterpeenit on todettu toimivaksi indikaattoriksi hedelmien ja marjojen kypsyyden, tuoreuden ja maantieteellisen alkuperän määrittelemisessä (Chmiel ja muut 2017). Haihtuvien terpeenien määrän nousu hedelmän kypsyessä on todettu muun muassa V. virgatumissa (Pohjois-Amerikkalainen mustikka) ja Mangifera indica L. eli mangossa (Chmiel ja muut 2017; Beaulieu and Lea, 2003). Terpeenit ovat bioaktiivisia yhdisteitä antioksidatiivisen luonteensa takia (Singh ja muut 2006) ja niillä tiedetään olevan anti-inflammatorisia, -bakteerisia ja - viraalisia. Näiden lisäksi terpeeneistä saattaa olla apua sydän- ja verisuonitautien sekä diabeteksen hoidossa (Yang ja muut 2020). Korkeat antioksidatiiviset aktiivisuudet todettiin yhdisteillä γ-terpineeni, terpinoleeni, α-terpineoli ja terpinen-4-oli. (R)-(-)-linaaloolin antioksidatiivinen aktiivisuus oli puolestaan vain neljäsosa γ-terpineenistä. (Beema Shafreen ja muut 2017.) S. leucophyllan tuottaman kamforin, eukalyptolin, β-pinenen, α-pinenen ja camfeenin todettiin rajoittavan muiden kasvien solujen jakaantumista juurissa (Nishida ja muut 2005). Muun muassa mustikan (V. corymbosum) antioksidanttikapasiteetti CUPRAC- testissä oli noin 165 µM TE (Dymerski ja muut 2015). 1.1.2 Esterit Etenkin suoraketjuisia estereitä syntyy rasvahappojen hajoamisen tai vapaiden rasvahappojen synteesin myötä (Hui ja muut 2010). Lipaasit pilkkovat rasvahappoja ja katalysoivat erilaisia esterifikaatioreaktioita. Puolukan sisältämistä yhdisteistä jopa neljäsosa on rasvahappoja, joista oleiini- ja linolihappo olivat runsaimmat. (Klavins ja muut 2021, Yahya, Anderson ja Moo- Young, 1998.) Aminohapot puolestaan toimivat esiasteina 2-metyyli-1-butanolille 7 ja 3-metyyli-1-butanolille, jotka voivat esteröityä miellyttävän hedelmäisen tuoksuisiksi yhdisteiksi (Hui ja muut 2010). 1.1.3 Aldehydit Haihtuvia aldehydejä muodostuu muun muassa rasvahappojen hapettumisen myötä: linolihapon hapettuminen tuottaa vihreän tuoksuisia (E)-2- tai (E)/(Z)-3- heksenaaleja, jotka puolestaan pelkistyvät alkoholeikseen. (E)-2- tai (E)/(Z)-3- heksenoleista voi taas muodostua miellyttävämmän tuoksuisia heksenyyliestereitä. (Vavoura ja muut 2015.) Tyydyttymättömien aldehydien tiedetään syntyvän tyydyttymättömien rasvahappojen hapettumisen seurauksena (Ribeaucourt ja muut 2021). 1.1.4 Lipidit haihtuvien yhdisteiden esiasteena Rasvahapot toimivat esiasteena useille haihtuville yhdisteille. Rasvahappojen hajoaminen tapahtuu pääosin α- ja β-hapetuksen, lipoksygenaasin (engl. lipoxygenase, LOX) katalysoiman aineenvaihdunnan reitin tai auto-oksidaation kautta. β-hapettumisesta poiketen α-hapettuminen ei kokonaan hajota rasvahappoja, vaan pilkkoo ne lyhyemmiksi ketjuiksi. Nämä vähintään C12- pituiset ketjut toimivat esiasteina useille haihtuville yhdisteille, kuten suoraketjuisille alkoholeille, aldehydeille, estereille, ketoneille ja karboksyylihapoille. LOXin katalysoimien reaktioiden myötä linoli- ja linoleenihappo pelkistyvät parin väliasteen kautta lopulta C6- ja C9-aldehydeiksi. C6-aldehydit tunnetaan ”vihreän lehden” yhdisteinä, sillä ne tuoksuvat murskatulta lehdeltä. Muun muassa linolihapon hapettumistuotteita ovat heksanaali ja 2,4-decadienaali, joista ensimmäisellä on rasvaisen vihreä ja ruohoinen tuoksu ja toisella kurkkumainen. Linoleenihapon auto-oksidaatio taas synnyttää runsaasti 2,4-heptadienaalia, jolla on pähkinäinen, rasvainen ja paistettu tuoksu. (Hui ja muut 2010, Luo ja muut 2021.) 1.2 Puolukka, Vaccinium vitis-idaea Puolukasta löytyy runsaasti kuitua, kivennäisiä, A-, C- ja E-vitamiinia sekä polyfenoleita. Terveyshyötyjen lisäksi puolukka on myös kauniin punainen marja, joka piristää annosta kuin annosta. Esimerkiksi pohjoismaissa, Venäjällä ja Kanadassa puolukka on osa tavallista ruokavaliota. (Mane ja muut 2011.) Puolukka sisältää myös runsaasti värillisiä antosyaniineja, joita voidaan käyttää elintarvikeväreinä. Pakkasen kestävää puolukkaa kasvaa villinä 24 maassa 8 lauhkean ilmastovyöhykkeen alueella, jonne myös sen kaupallinen viljely keskittyy. (Pengallegon, 2006.) Tänä päivänä eri puolukka lajikkeita on yli 20, mutta niiltä puuttuu kaupallisen viljelyn kannalta oleellisia ominaisuuksia. Esimerkiksi fenolisten yhdisteiden kokonaispitoisuus oli korkeampi puolukan lehdissä kuin marjoissa. (Vilkickyte ja muut, 2022.) Puolukka ei kuitenkaan happaman ja hieman kitkerän makunsa takia ole yhtä suosittu marja kuin mustikka tai mansikka. Puolukan viljely on muihin Ericacaean perheen marjoihin verrattuna vähäistä ja se täytyykin poimia metsästä, mikä tekee hankinnasta vaativampaa. Happamuuden ja hankinnan vaativuuden takia puolukka ei ole saavuttanut samanlaista suosiota kuin muut viljeltävät marjat. Puolukan sisältämän bentsoehapon lisäksi se sisältää melkein kaksin verroin sitruunahappoa mustikkaan ja mansikkaan verrattuna. Vaikka puolukka sisältää myös runsaasti sokereita, ne eivät yksinään riitä peittämään happamuutta. (Viljakainen ja muut 2010; Viljanen ja muut 2014; Kowalska, 2021.) Ei ole siis ihme, että puolukka sijoittui viimeiseksi marjojen miellyttävyyttä testanneessa aistinvaraisessa tutkimuksessa (Laaksonen ja muut 2016). Happamuuden osoitettiin vaikuttavan negatiivisesti jopa mustikan maun miellyttävyyteen (Gilbert ja muut 2015). Suomessa puolukkaa kerätään kuitenkin kaksin verroin enemmän kuin mustikkaa. Siitä huolimatta mustikka- ja puolukkasadosta jää metsiin lähes 90 %. (Turtiainen, Salo ja Saastamoinen, 2011.) 1.2.1 Puolukan yhdisteiden bioaktiivisuus Kehon kroonisen tulehdustilan tiedetään vaikuttavan monien sairauksien, kuten diabeteksen, sydän- ja verisuonisairauksien, syövän ja ateroskleroosin syntyyn (Alfaddagh ja muut 2020). Puolukasta saattaa olla apua kehon tulehdustilan hoitoon, sillä puolukka sisältää runsaasti bioaktiivisia yhdisteitä, jotka lieventävät tulehdustilaa (Popescu ja muut 2021). Puolukan lisäämisestä ruokavalioon saattaa olla hyötyä muun muassa veren seerumin kolesterolin alentamisessa, virtsatieinfektion ehkäisemisessä ja jopa tiettyjen syöpien hillitsemisessä (Zhang ja muut 2019; Davidson ja muut 2014; McDougall ja muut 2008). Tuore puolukka sisältää noin 600 mg/100 g fenolisia yhdisteitä joista 40–94 mg/100 g on antosyaniineja. Antosyaniinit antavat puolukan marjalle sen punaisen värin ja niiden määrään vaikuttaa oletettavasti kasvuolosuhteet. (Bujor ja muut 2018.) Esimerkiksi Yhdysvalloissa Oregonissa kasvatetuissa puolukoissa oli lähes kaksin verroin enemmän fenolisia yhdisteitä, kuin Kanadan puolella 9 Labradorissa kasvatetuissa. Tutkimuksissa on myös huomattu, että viljelty puolukka sisältää hieman vähemmän antosyaniineja kuin villi lajike. (Kowalska, 2021.) Biosaatavuudella tarkoitetaan tietyn bioaktiivisen yhdisteen kykyä vaikuttaa soluihin tai elimiin terveydelle edullisella tavalla. Yhdisteiden täytyy kuitenkin säilyttää bioaktiivisuutensa kulkiessa ruoansulatuskanavan läpi. Puolukan bioaktiivisten yhdisteiden, kuten flavonolien, on osoitettu säilyttävän aktiivisuutensa huolimatta niiden läpikäymistä muutoksista suolistossa. (Brown ja muut 2014.) 1.2.2 Puolukan (Vaccinium vitis-idaea) haihtuvat yhdisteet Puolukan (Vaccinium vitis-idaea) ja muiden samaan sukuun kuuluvien kanervakasvien haihtuvista yhdisteistä on tehty suhteellisen vähän tutkimusta. Puolukan haihtuvia yhdisteitä tutki ensimmäistä kertaa Anjou ja muut vuonna 1967. Tuolloin tutkimusryhmä löysi pektinaasilla käsitellystä puolukkamehusta 80 eri yhdistettä, joista 2-metyylibutaanihappo eli 2-metyylivoihappo oletettiin tärkeimmäksi puolukan haihtuvaksi yhdisteeksi korkean konsentraation ja vahvan tuoksun takia. Ryhmä arveli puolukan sisältävän löytyneiden yhdisteiden lisäksi satoja muita pienissä määrin esiintyviä haihtuvia yhdisteitä. Anjou ja muut (1967) huomasivat myös aromaattisten yhdisteiden kuten bentsoehapon vastaavan hieman yli puolesta (52,3 %) haihtuvista yhdisteistä. Vaikka makean kukkaiselta tuoksuvaa bentsyylialkoholia on 40 % kaikista puolukan aromaattisista yhdisteistä, he eivät kuitenkaan olettaneet sen vaikuttavan puolukan ominaistuoksuun merkittävästi, sillä sen OAV-arvo on suhteellisen pieni. Muut aromaattiset yhdisteet, kuten bentsaldehydi, vaikuttavat korkeamman OAV:n takia vahvemmin puolukan tuoksuun pienestä konsentraatiosta huolimatta. Tutkimuksessa löydetyillä 13 alifaattisella alkoholilla on myös vahva ominaistuoksu ja niitä esiintyy suhteellisen korkeissa konsentraatiossa. Tyydyttymättömien rasvahappojen hapettumisen tiedetään synnyttävän ei- toivottuja hapettumistuotteita, joiden hajoamistuotteina ovat muun muassa aldehydit. Osalla aldehydeistä on epämiellyttävä tuoksu ja huonontavat siten tuoksuprofiilia. (Mazurek ja muut 2022.) Pari vuotta myöhemmin Anjou ja Sydow (1969) löysivät 82 haihtuvaa yhdistettä puolukan puristusjätteestä. Nämä yhdisteet vastaavat 90 % puolukan haihtuvien yhdisteiden kokonaismäärästä. Tutkijat onnistuivat tunnistamaan 44 yhdistettä. 10 He myös osoittivat puolukkamehun sisältävän kuusinkertaisen määrän haihtuvia yhdisteitä puristusjätteeseen verrattuna ja epäilivät tämän johtuvan mehussa olevista helpommin haihtuvista yhdisteistä. Voimakkaimmin tuoksuun vaikuttavaksi yhdisteiksi he päättelivät 2-metyyli-3-buten-2-olin, linaloolin, 4- terpinenolin, α-terpineolin, useiden aromaattisten yhdisteiden ja 2- metyylibutaanihapon ohella. Edellä mainitut yhdisteet kattavat suurimman osan puolukan haihtuvista yhdisteistä, mutta 2-metyylibutaanihapon konsentraation todettiin olevan puolet haihtuvien yhdisteiden kokonaismäärästä. Viljanen ja muut (2014) tutkivat entsyymi- ja mikrobikäsittelyn vaikutusta puolukan kemiallisiin yhdisteisiin ja aistinvaraisiin ominaisuuksiin Tutkimuksessa he tunnistivat yhteensä 38 haihtuvaa yhdistettä. Lukumäärältään suurin yhdisteluokka oli aldehydit ja niiden jälkeen alkoholit, terpeenit, ketonit, esterit ja hapot. 2-metyylibutaanihappo osoittautui myös Viljasen tutkimuksessa puolukassa runsaasti esiintyväksi yhdisteeksi etanolin, metyylibentsoaatin, etyyliasetaatin, diasetyylin ja 3-metyylibutaanihapon ohella. He myös yhdistivät aistinvaraisessa arvioinnissa muutamat haihtuvat yhdisteet tiettyihin makuihin: raikas ja puolukkamainen maku yhdistettiin oktanaaliin ja nonanaaliin ja makea, eltaantunut sekä hapan 3-metyylibutaanihappoon. 1.3 Muiden Vaccinium-marjojen ja mustaherukan haihtuvat yhdisteet Vaccinium-sukuun kuuluu satoja eri lajeja, joista mustikat, karpalot ja puolukat ovat kaupallisesti tärkeitä marjoja niin Suomessa kuin maailmalla (Sater ja muut 2020; Turtiainen, Salo ja Saastamoinen, 2011). Karpalon ja mustikan haihtuvia yhdisteitä on tutkittu huomattavasti enemmän kuin puolukan. Tietyt haihtuvat yhdisteet vaikuttavat marjan makuun nenän hajureseptorien kautta, mutta näiden yhdisteiden tutkimus on vasta aluillaan. Puolukan haihtuvia yhdisteitä on kartoitettu vain muutamissa tutkimuksissa. (Sater ja muut 2020.) 1.3.1 Kangasmustikka, Vaccinium myrtillus L. ja muut mustikat Yli tusinasta eri mustikkalajeja Vaccinium myrtillus on juuri Suomen metsissä kasvava heinäkuussa marjova varpu. V. myrtillus eroaa muista yleisistä mustikkalajeista siten, että sen marjat ovat väriltään tumman sinisiä ja sisältä punertavia. Pensasmustikka eli V. corymbosum on kangasmustikkaan verrattuna vaaleamman sinisempi ja sen hedelmäliha on vihertävää. V. angustifolium eli kanadanmustikka ja V. virgatum muistuttavat molemmat edellä mainittua 11 pensasmustikkaa ja luonnonvaraisia Pohjois-Amerikassa. Ne eroavat väriltään, maultaan ja tuoksultaan toisistaan. Pensasmustikka kattaa Yhdysvaltain mustikkamarkkinoista jopa 95 %. (Du ja Rouseff, 2014.) Alkoholit ja esterit ovat hallitsevia haihtuvia yhdisteitä mustikassa. Muihin pienmarjaisiin hedelmiin verrattuna mustikka sisältää vähemmän haihtuvia yhdisteitä ja on myös siksi heikommin tuoksuva. (Hui ja muut 2010.) V. corymbosumissa merkittävimmät haihtuvat yhdisteet ovat etyyliasetaatti, (E)- 2-heksenaali, (E)-2-heksenoli, heksanaali, (Z)-3-heksenoli, linalooli ja geranioli (Hirvi ja Honkanen, 1983). Horvat ja Senter (1985) puolestaan huomasivat terpeenien, kuusihiilisten tyydyttymättömien aldehydien ja tyydyttymättömien alkoholien olevan merkittävimpiä yhdisteitä V. virgatumissa. Aistinvaraisessa arvioinnissa he päätyivät linaloolin, 2-heksenaalin, 2-hexenolin, 3-heksen-1-olin ja geraniolin muodostavan tuoreen mustikan tuoksun. Marjan kypsyminen puolestaan kasvatti linaloolin konsentraatiota ja vähensi α-terpineolin ja β- karyofylleenin konsentraatioita (Horvat ja muut 2011). V. angustifolium ja V. myrtillus L. tuottavat enemmän hedelmäisen tuoksuisia estereitä kuin V. corymbosum ja V. virgatum, joista puolestaan löytyi runsaammin vihreän tuoksuisia aldehydejä (Farneti ja muut 2017). Runsaimmiksi haihtuviksi yhdisteiksi V. corymbosumissa osoittautui linalooli, (E)- 2-heksenaali, (E)- ja (Z)-dehydrolinaloolioksidi, limoneeni, heksanaali, α- terpineoli ja geranioli. Yhteensä Dun ja muiden (2012) tutkimuksessa tunnistettiin 32 yhdistettä. Vuonna 2022 tehdyssä tutkimuksessa tunnistettiin 73 haihtuvaa yhdistettä V. corymbosumin kuudesta eri lajikkeesta. Marjat lajiteltiin koon, värin ja kuoren epäkohtien mukaan ja runsaimmin esiintyviksi yhdisteiksi todettiin heksanaali, limoneeni, (E)-2-heksenaali, linalooli, α-terpineoli ja geranioli. Runsaimmin mustikoista löytyi aldehydejä, mutta terpeenit osoittautuivat monipuolisimmaksi yhdisteluokaksi. Kokonaishaihtuvien määrässä lajikkeiden välillä oli lähes kymmenkertainen ero: Draper-lajikkeessa kokonaishaihtuvien määrä oli 48,28 µg/kg ja Last Call —lajikkeessa vain 4,50 µg/kg. (Pico, Gerbrandt ja Castellarin, 2022.) (E)-2-heksenaali osoittautui hallitsevaksi yhdisteeksi V. corymbosumissa Eichholzin ja muiden (2011) tekemässä tutkimuksessa. Lisäksi mustikoista löytyi runsaasti heksanaalia, (Z)-3-heksenaalia, eukalyptolia, metyyliisoheksenyyliketonia, (Z)-3-heksenolia, (E)-2-heksenolia, 1-heksanolia ja linaloolia. 12 Du ja Rouseff (2014) vertasivat neljän eri V. ashein (V. virgatumin lajike) lajikkeiden haihtuvia yhdisteitä. Suurin haihtuvien yhdisteiden luokka oli aldehydit ja näiden jälkeen esterit ja terpeenit. Yhdisteistä terpeenien määrä vaihteli eniten lajikkeiden välillä. Lajikkeiden välillä oli myös huomattavia eroja haihtuvien yhdisteiden intensiteetissä. Mustikan tuoksuun vaikutti merkittävimmin aldehydit ja terpeenit. Haihtuvien yhdisteiden huomattiin vaikuttavan koettuun makeuteen ja happamuuteen Gilbertin ja muiden (2015) tekemässä tutkimuksessa mustikan haihtuvista yhdisteistä ja aistinvaraisista ominaisuuksista. β-karyofylleenioksidin ja 2-heptanonin todettiin lisäävän panelistien kokemaa maun miellyttävyyttä ja makeutta. Yllättävästi linalooli ja eukalyptoli vaikuttivat negatiivisesti mustikan yleiseen miellyttävyyteen. Erityisesti eukalyptoli lisäsi koettua happamuutta ja sitä esiintyi runsaimmin alkuvuodesta kerätyissä marjoissa. Myös vihreänä aldehydinä tunnettu (E)-2-heksenaali lisäsi aistittua happamuutta ja vähensi miellyttävyyttä ja makeutta. (E)-2-heksenaali oli runsain haihtuva yhdiste kaikissa näytteissä ja erityisen korkea alkuvuoden marjoissa. 3-metyyli-1-butanoli puolestaan tehosti mustikan ominaismakua ja paransi maun voimakkuutta. Tiettyjen yhdisteiden lisääminen ja toisten vähentäminen jalostuksen kautta edistäisi mustikan miellyttävyyttä markkinoilla vastaamalla kuluttajien vaativiin makutottumuksiin. Gilbertin tutkimusryhmä tutki myös kasvupaikan ja lajikkeen genotyypin vaikutusta haihtuviin yhdisteisiin. Genotyyppi vaikutti merkitsevästi kaikkiin muihin haihtuviin yhdisteisiin paitsi heksaanihappoon. Kasvupaikka puolestaan vaikutti merkitsevästi vain linaloolin ja metyyliheksanoaatin esiintyvyyteen. 6- metyyli-5-hepten-2-olin konsentraatio vaihteli runsaimmin eri lajikkeiden välillä, mutta myös linaloolin ja eukalyptolin määrässä oli huomattavia eroja genotyyppien kesken. Etelämmässä kasvaneissa marjoissa oli pohjoisempiin verrattuna enemmän β-karyofylleenioksidia. 1.3.2 Karpalo, Vaccinium macrocarpon ja oxycoccos L. Ensimmäiset tutkimukset liittyen karpalon haihtuviin yhdisteisiin tehtiin jo 60- luvulla. Croteau ja Fagerson (1968) tunnistivat yhteensä 42 yhdistettä karpalomehusta. Edellä mainittu tutkimus oletti tunnistettujen yhdisteiden kattavan jopa 95 % kaikista karpalon haihtuvista yhdisteistä ja, että loput 5 % sisältää yli 200 muuta haihtuvaa yhdistettä. Pienistä määristään huolimatta nämä 13 yhdisteet saattavat olla tärkeitä karpalon ominaistuoksussa bentsaldehydin, bentsyyliesterin, bentsoaattien ja terpeenien ohella. Tuolloin bentsoehappo oli runsain haihtuva yhdiste ja noin vuosikymmen myöhemmin tutkijat onnistuivat tunnistamaan 70 yhdistettä, joista yli puolta ei ollut aiemmin löydetty karpalossa. Karpalon tuoksuun keskeisesti vaikuttaviksi yhdisteiksi he ilmoittivat α-terpineolin ja useat aromaattiset yhdisteet. Tutkimuksessa huomattiin myös eurooppalaisten karpaloiden (Vaccinium oxycoccos) sisältävän peräti viisinkertaisen määrän haihtuvia yhdisteitä kuin Pohjois-Amerikkalaisen (Vaccinium macrocarpon Ait.). (Hirvi, Honkanen ja Pyysalo, 1981). Rusen ja muiden (2012) mukaan karpalon sisältävän runsaimmin 4-penten-2-olia, heksanaalia, bentsaldehydiä, α-terpineolia ja bentsyylialkoholia. Kukkaiselta ja syreeniltä tuoksuvan α-terpineolin tiedetään olevan tärkeä yhdiste karpalon ominaisen tuoksun muodostuksessa (Anjou ja muut 1967). Villin karpalon kukkainen tuoksu oli kuitenkin hillitympi kuin viljeltyjen lajikkeiden Rusen ja muiden (2012) tutkimuksessa. He päättelivät tämän johtuvan eroista monoterpeenien kuten α-terpineolin muodostumissa viljellyissä ja villeissä karpaloissa. Lisäksi villissä karpalossa oli huomattavasti vähemmän heksanaalia kuin viljellyissä ilmeni heidän tutkimuksessaan. Karpalon tuoksuprofiilia tutkineet Zhu ja muut (2016) totesivat kuusihiilisten vihreältä tuoksuvien yhdisteiden, kukkaisen linaloolin ja β-iononin, 2- metyyliburyyrihapon ja bentsoehapon vaikuttavat olennaisesti karpalon tuoksuun. He löysivät neljästä eri karpalolajikkeesta 33-36 eri haihtuvaa yhdistettä, joista yli kolmasosa vaikuttaa karpalon tuoksuprofiiliin (OAV > 1). Merkittävimmin tuoksuun vaikutti heksanaali (OAV 27-60), pentanaali (OAV 31-51), (E)-2- heksenaali (OAV 18-63), (E)-2-heptenaali (OAV 17-66) ja (E)-2-nonenaali (OAV 8-77). α-terpineolia ja aromaattisia yhdisteitä esiintyi korkeissa konsentraatioissa kaikissa lajikkeissa, mutta niiden OAV:t jäivät alhaisiksi. α-terpineolin konsentraatio oli 48,26-98.39 µg/kg ja OAV 2-4 ja bentsaldehydin konsentraatio 1174,48-5633,34 µg/kg ja OAV 4-18. Näiden yhdisteiden OAV- havaitsemiskynnykset ovat 28 ja 320 µg/kg. Heksanaalin OAV-arvo oli keskimäärin korkein, vaikka sen konsentraatio oli vain noin neljäsosa bentsaldehydistä. (E)-2-nonenaalilla oli myös erityisen korkeat OAV-arvot (8, 65, 18 ja 77) huolimatta sen pienistä konsentraatioista (3,00, 25.99, 7,07 ja 30,66 µg 14 /kg). Yhdisteen aistinvaraiseen havainnointiin vaikuttaa siis moni muu asia kuin sen volyymi. 1.3.3 Mustaherukka, Ribes nigrum. Liu ja muut (2018) löysivät 166 vapaata haihtuvaa yhdistettä yhteensä kuudesta eri mustaherukkalajikkeesta, joista esterit ja terpeenit määriteltiin merkittävimmiksi haihtuviksi yhdisteiksi. Etenkin esterien määrässä oli merkitsevästi eroa lajikkeiden kesken: eri estereitä tunnistettiin yhteensä 31, mutta vain kahdeksaa esteriä löytyi jokaisesta lajikkeesta. Kymmenisen vuotta aikaisemmin tehdyssä tutkimuksessa huomattiin myös merkittäviä eroja esterien ja monoterpeenien määrässä 13 eri lajikkeen välillä. Tutkimuksessa tunnistettiin yhteensä 45 haihtuvaa yhdistettä, joista esterit ja monoterpeenit olivat suurimmat yhdisteryhmät. Estereistä etenkin metyylibutanoaatti, etyylibutanoaatti, etyyliheksanoaatti ja metyyliasetaatti antavat mustaherukalle hedelmäisen ja kukkaisen tuoksun kun taas terpeenien eukalyptolin ja β-damaskonen tiedetään vastaavan tyypillisestä mustaherukan tuoksusta. (Christensen ja Pedersen, 2006.) Christensenin ja Pedersenin tulokset myös osoittivat, että mustaherukan tuoksuprofiilin parantaminen vaatii kasvuolosuhteiden muuttamisen sijaan keskittymistä kasvin perimään ja genetiikkaan. Marsol-Vall ja muut (2018) osoittivat pohjoisemmalla leveyspiirillä kasvaneiden mustaherukoiden sisältävän runsaammin haihtuvia yhdisteitä kuin etelämmässä kasvaneet. He huomasivat myös lämpötilan ja auringon säteilyn vaikuttavan haihtuvien yhdisteiden määrään: alhainen lämpötila ja säteily kuukauden sisällä marjojen keräämisestä näytti korreloivan positiivisesti haihtuvien yhdisteiden määrän kanssa. Kahdeksan vuotta kestäneen tutkimuksen aikana kerättiin kolmen eri mustaherukkalajikkeen (Ola, Mortti ja Melalahti) marjoja Piikkiöstä ja Apukasta. Haihtuvia yhdisteitä löydettiin ja tunnistettiin 41 kappaletta, joista terpeenejä oli yhteensä 34 yhdistettä. Terpeenien lisäksi tutkijat tunnistivat neljä esteriä, kaksi aldehydiä ja yhden alkaanin. Runsaimmin esiintyvä yhdiste oli limoneeni ja δ-3-kareeni seuraaviksi runsain Olassa ja Mortissa, mutta γ- terpineeni puolestaan Melalahdessa. Pohjois- ja Etelä-Suomessa kasvaneiden marjojen haihtuvissa yhdisteissä oli kvalitatiivisten erojen sijaan merkittävä ero yhdisteiden määrässä. Kasvuolosuhteet vaikuttavat luultavasti voimakkaammin yhdisteiden määriin kuin genotyyppi. 15 Vastaavasti kahden edellä mainitun tutkimuksen mukaan, myös Jung ja muut (2017) raportoivat esterien ja terpeenien olevan suurimmat yhdisteryhmät mustaherukassa. He tunnistivat yhteensä 155 haihtuvaa yhdistettä kaupallisista ja kahdesta eri paikasta Saksassa poimituista mustaherukoista. Aikaisemmista tutkimuksista poiketen heidän tutkimistaan marjoista löytyi runsaasti kuusihiilisiä yhdisteitä, erityisesti (E)-2-heksenaalia ja (Z)-3-heksenaalia. Aikaisemmissa mustaherukkatutkimuksissa on tutkittu ainoastaan pakastettuja marjoja, joten tutkijat epäilivät pakastuksen vaikuttavan haihtuvien yhdisteiden muodostumiseen. 9 kuukauden säilytys -20 °C johti heidän tutkimuksessaan kuusihiilisten aldehydien ja alkoholien merkittävästi alhaisempaan konsentraatioon. Pakastuksen aikana myös marjojen esterien määrä väheni. (Z)- 3-heksen-1-olin konsentraatioon pakastuksella taas ei ollut vaikutusta. Samalla linoli- ja oleiinihapon hapettumisen myötä syntyvien heksanaalin, heptanaalin, (E)-2-heptenaalin, (E)-2-oktenaalin, dekanaalin ja nonanaalin määrä kasvoi pakastuksen aikana. Pakastettujen marjojen tuoksuprofiilia hallitsevat siten terpeenit. Vuonna 2016 tehty tutkimus osoitti rikkiä sisältävän 4-metoksi-2-metyyli-2- butanetiolin olevan merkittävä yhdiste mustaherukan ominaistuoksussa (Jung, Fastowski ja Engel, 2016). Korkeimman OA-arvon (475) Jungin ja muiden (2017) tutkimuksessa sai vihreän tuoksuinen (Z)-3-heksenaali ja toiseksi korkeimpana (350 OAV) oli 4-metoksi-2-metyyli-2-butanetioli. Tuore tutkimus vuodelta 2020 keräsi 25:stä mustaherukan haihtuviin yhdisteisiin liittyvästä tutkimuksesta ja niistä vain yksi ilmoitti 4-metoksi-2-metyyli-2-butanetiolin tärkeäksi tuoksuvaksi yhdisteeksi. Yhteensä 351 haihtuvaa yhdistettä on tunnistettu mustaherukasta ja niistä hieman yli 20 vaikuttaa (Pagès-Hélary, Dujourdy ja Cayot, 2022). 1.4 Kasvuolosuhteiden vaikutus haihtuviin yhdisteisiin 1.4.1 Puolukka, Vaccinium vitis-idaea Ensimmäisen kerran puolukkaa viljeltiin Ruotsissa ja Suomessa 60-luvulla (Hjalmarsson ja Ortiz, 2008). Bujour ja muut (2018) raportoivat vuodenaikojen vaikuttavan marjan fenolisten yhdisteiden määrään vain rajoitetusti, ja että eroihin vaikuttaa luultavammin kasvin kokema stressi. Ympäristön aiheuttama abioottinen stressi ja muiden eliöiden aiheuttama bioottinen stressi saattaa siis vaikuttaa marjan sisältämään fenolisten yhdisteiden määrään (Bujor ja muut 2018). 16 1.4.2 Kangasmustikka, Vaccinium myrtillus L ja muut mustikat Uleberg ja muut (2012) tutkivat lämpötilan ja valon määrän vaikutusta satoon ja kemiallisten yhdisteiden määrään mustikassa. Heidän tutkimuksessaan Pohjois- ja Etelä-Suomesta kerättyjä mustikoita kasvatettiin kontrolloidussa ympäristössä, eli fytotronissa, 12 ja 18 asteessa joko 12 tai 24 tunnin ajan luonnonvalolla tai 24 tunnin ajan luonnonvalolla ja punaisella valolla. Mustikat tuottivat marjoja yhtä paljon molemmissa lämpötiloissa ensimmäisenä vuonna, mutta seuraavana kaksin verroin enemmän 18 °C lämmössä kuin 12 °C. Ero saattaa johtua pölyttäjien määrästä. Etelän mustikat tuottivat ensimmäisenä vuonna hieman enemmän marjoja 12 °C kuin pohjoisen ja toisena vuonna pohjoisen mustikat tuottivat taas runsaimman sadon molemmissa lämpötiloissa. Tutkimusryhmä kertoo myös pohjoisen marjojen sisältävän huomattavasti enemmän fenoleita ja antosyaniineja, mikä vastaa aikaisempia tutkimustuloksia ja viittaa erilaiseen genotyyppiin eri leveysasteilla. Punaisen valon määrä vaikutti positiivisesti pohjoisen mustikan antosyaniinien määrään, kun taas etelän mustikka tuotti runsaimmin antosyaniineja 24 tunnin luonnonvalossa. Lämpötila vaikutti olennaisesti myös tuotetun omenahapon määrään: omenahappoa oli eniten 18 °C ja kiinihappoa 12 °C. Pohjoisen ja etelän mustikoiden hapoissa oli myös eroja, sillä omenahappoa oli runsaimmin pohjoisen ja kiinihappoa etelän genotyypissä. Sokerien määrän oli huomattavasti korkeampi 12 asteessa kasvaneissa mustikoissa. V. corymbosumissa todettiin lämpötilan ja keräysajankohdan vaikuttavan haihtuvien yhdisteiden määriin. Kolmen viikon sisällä tutkijat keräsivät neljänä eri ajankohtana marjoja, ja huomasivat muun muassa 2-etyyliheksanolin ja linaloolin määrien vaihtelevan merkitsevästi. Du ja muut (2012) päättelivät vaihtelun johtuvan lämpötilaeroista kolmen viikon aikana: toukokuun aikana lämpötila oli 18 ja 33 asteen välillä. Marjat oli kerätty eri ajankohtina, mutta saman kypsyisinä. (Du, Olmstead ja Rouseff, 2012.) UVB-valon huomattiin lisäävän eukalyptolin ja linaloolin määriä V. corymbosumissa. Tutkijat käyttivät kahta eri valonvoimakkuutta ja altistumisaikaa: kaksi tai 24 tuntia joko heikossa (0,075 Wh/m2) tai voimakkaassa (0,15 Wh/m2) UVB-valossa. Kahden tunnin valaisu UVB-valoa kasvatti eukalyptolin ja linaloolin määriä, kun taas 24 tunnin valaisulla ei ollut yhtä merkitseviä vaikutuksia. Erityisesti linaloolin määrä väheni huomattavasti 24 17 tuntia kestävän UVB-valaisun myötä. Kahden tunnin valaisulla oli myös lievä positiivinen vaikutus metyyli-isoheksenyyliketonin määrään. (Eichholz ja muut 2011.) Kasvien tiedetään tuottavan sekundaarisia metaboliittejä ulkoisen stressin kuten auringon säteilyn takia. Tällöin muun muassa terpeenien synteesi kiihtyy. (Pateraki ja Kanellis, 2010.) Ketonien lisääntyvään synteesiin puolestaan vaikuttaa UVB-säteilyn aiheuttama voimistävä säätely (engl. up-regulation) synteesiä katalysoimassa fosfolipaasientsyymissä (Lo ja muut 2004). Valoaltistus vaikutti myös kuusihiilisiin aldehydeihin: (E)-2-heksenaalin määrä lisääntyi muissa olosuhteissa kuin 24 tunnin valaisussa alhaisella voimakkuudella. Myös (Z)-3-heksenaalia löytyi merkitsevästi enemmän kahden tunnin ajan valaistuista marjoista. (Eichholz ja muut 2011.) Tämän kasvun selittää myös kasvin reagointi ulkoiseen stressiin, eli säteilyyn. Säteilyn tuottama stressireaktio kasvissa hapettaa solukalvon linoleeni- ja linolihappoja, joista lipoksygenaasin katalysoimana syntyy C6-aldehydejä. (Wang, Peng ja Proctor, 1990.) 1.4.3 Mustaherukka, Ribes nigrum Pagès-Hélary ja muiden (2020) tutkimuksessa huomattiin mustaherukan sisältävän aluespesifisiä haihtuvia yhdisteitä. Heidän multivariaattianalyysinsä 25 eri mustaherukkatutkimuksesta raportoi saksalaisissa marjoissa 7 ominaisyhdistettä ja 10 isobritannialaisissa. Tanskalaisissa ja suomalaisissa marjoista löydettiin kummastakin yksi ominaisyhdiste. 1.5 Kypsyysasteen vaikutus haihtuviin yhdisteisiin marjoissa Kypsyminen saa aikaan monenlaisia muutoksia hedelmissä: väri, fyysinen ja kemiallinen koostumus ja aistinvaraiset ominaisuudet muuttuvat ja hedelmästä tulee syötävä. Hedelmien ominainen maku kehittyy kypsymisen myöhemmissä vaiheissa, jolloin hiilihydraateista, rasvoista ja proteiineista muodostuu haihtuvia yhdisteitä. Hedelmän kerääminen keskeyttää kypsymisen ja lopettaa sokerien ja veden siirtämisen kasvista hedelmään. Samalla kuitenkin aineenvaihdunta ja soluhengitys jatkuu, minkä takia kypsyminen etenee keräyksestä huolimatta. (Brückner ja Wyllie, 2008; Pérez ja muut 2002.) Aldehydien määrä on tyypillisesti korkeampi raaoissa hedelmissä, mutta vähenee kypsymisen edetessä. Puolestaan esterit ja ominaistuoksuun vaikuttavat yhdisteet ovat merkittävässä osassa kypsässä hedelmässä. (Brückner ja Wyllie, 2008.) 18 1.5.1 Mustaherukka, Ribes nigrum Marjan kypsyminen vaikutti erityisesti esterien määrään mustaherukassa: Titania-lajikkeesta ei pystytty tunnistamaan yhtään aikaisemmin tunnistettua esteriä, mutta Rosenthals-lajikkeessa puolestaan etyyli-butanaatin ja metyyli- heksanaatin pitoisuudet olivat merkittävästi nousseet. Monoterpeenien terpinen- 4-olin, sabinene hydraatin, β-linaloolin ja sitronellonin konsentraatiot laskivat kypsymisen myötä. Lisäksi (Z)-3-heksenaalin ja (Z)-3-heksen-1-olin pitoisuus laski marjan kypsyessä, mikä vastaavasti johti muiden kuusihiilisten yhdisteiden alhaisempaan pitoisuuteen. (Jung ja muut 2017.) 1.5.2 Mustikka, Vaccinium myrtillus Hall ja muut (1970) tutkivat jo 70-luvulla kypsyysasteen vaikutusta Vaccinium angustifoliumissa. Tuolloin he huomasivat asetaldehydin, etyyliasetaatin ja etyylialkoholin olevan hallitsevia yhdisteitä vihreän raaoissa mustikoissa. Lisäksi tutkimuksessa todettiin haihtuvien yhdisteiden lisääntyvän ajan kuluessa: edellä mainittujen yhdisteiden konsentraatio nousi merkitsevästi kolmen ja 25 tunnin aikana keräyksestä. Beaulieu ja muut (2014) totesivat esterit ja aldehydit runsaimmiksi yhdisteryhmiksi kypsässä Vaccinium asheissa. Viittä eri V. ashein lajiketta neljällä eri kypsyysasteella tutkineet Beaulieu ja muut (2014) huomasivat kypsien ja ylikypsien marjojen sisältävän runsaasti estereitä, kun taas raaoissa marjoissa ei ollut lainkaan estereitä. Kypsyysaste vaikutti voimakkaimmin terpeenien, estereiden, alkoholien ja aromaattisten yhdisteiden määriin. Näiden yhdisteiden konsentraatio kasvoi vihreästä marjasta kypsään marjaan asti, mutta aleni marjan ylikypsyessä. Marjan kypsyys kasvatti edellä mainittujen yhdisteluokkien määriä ja erityisesti β-myrseeniä ja linalooliyhdisteitä löytyi runsaasti kypsemmistä marjoista. Myös muiden mustikan tuoksuun olennaisesti vaikuttavien yhdisteiden, kuten metyyli-3-metyylibutyraatin, eukalyptolin, (Z)-3- heksenalin ja heksyyliasetaatin määrät kasvoivat merkitsevästi marjan kypsyessä. (Beaulieu, Stein-Chisholm ja Boykin, 2014.) Farnetti ja muut (2017) puolestaan tutkivat mustikan neljän eri kypsyysasteen vaikutusta haihtuviin yhdisteisiin. He huomasivat, että ylikypsät marjat sisältävät vähemmän sitruksen tuoksuisia monoterpeenejä kuin kypsät ja raaoissa marjoissa oli runsaammin vihreältä tuoksuvia aldehydejä ja estereitä. He tunnistivat yhteensä 106 haihtuvaa yhdistettä ja päätyivät haihtuvien yhdisteiden jakautuvan kolmeen luokkaan: (1) yhdisteet, joita esiintyy kaikissa lajikkeissa ja 19 kypsyysasteissa, mutta pienin määrin, (2) yhdisteet, joita syntyy raaoissa marjoissa ja joiden määrä vähenee marjan kypsyessä sekä (3) yhdisteet, joita esiintyy vain kypsissä ja ylikypsissä marjoissa. Kolmannen vaiheen yhdisteiden, monoterpeenien, (Z)-2-heksen-1-olin ja heksanaalin, oletetaan luovan tyypillisen mustikkamaisen tuoksun. Tietyt haihtuvat yhdisteet, kuten heksanaali, metyyli-3-metyylibutanaatti, (E)-2- heksenaali, (Z)-dehydrolinaloolioksidi, linalooli ja geranioli erottavat kypsän mustikan raa’asta todetaan Dun ja muiden (2012) tekemässä tutkimuksessa. Näiden yhdisteiden konsentraatio oli merkitsevästi suurempi kypsässä kuin kahdessa muussa raaemman asteen marjassa. Tuloksista huomattiin myös mustikkalajikkeiden Primadonna ja Jewel välinen ero: Primadonna tuotti kypsyessään enemmän haihtuvia yhdisteitä kuin Jewel. (Du, Olmstead ja Rouseff 2012.) Terpeenien määrässä oli suurimpia eroja juuri lajikkeiden välillä. Kypsyysaste vaikutti terpeenien ohella esterien, aromaattisten yhdisteiden ja alkoholien määrään. (Beaulieu, Stein-Chisholm ja Boykin 2014.) 1.5.3 Mansikat, Fragaria Kolmen mansikkalajikkeen haihtuvia yhdisteitä tutkivat Azodanlou ja muut (2004) huomasivat kypsymisen vaikuttavan haihtuvien yhdisteiden laatuun ja määrään. He mittasivat haihtuvia yhdisteitä raaoista marjoista, jotka olivat vihreitä, valkoisia tai puoliksi punaisia. Kypsät marjat olivat luokiteltu ¾ punaisiksi, punaisiksi ja tumman punaisiksi. Azodanlou ja muut ehdottavat, että mansikan kypsyysaste voidaan päätellä selvittämällä tiettyjen haihtuvien yhdisteiden määrä. Erityisesti 2- metyylibutaanihappo, 2-metyylibutyylibutanaatti ja etyyli-2-metyylibutanaatti osoittautuivat kypsyyttä merkitseviksi yhdisteiksi tutkituissa lajikkeissa. Heksanaali oli hallitseva yhdiste jokaisen lajikkeen vihreissä marjoissa. Kypsymisen edetessä haihtuvien yhdisteiden kokonaismäärä nousi, mutta vihreiden aldehydien (heksanaali, (E)-2-heksenoli ja (Z)-3-heksenyyliasetaatti) määrä puolestaan laski. Esterien määrä nousi huomattavasti marjan kypsyessä ¾ punaisesta tumman punaiseksi. Mansikan ominaistuoksuun merkitsevästi vaikuttavan yhdisteen furaneolin konsentraatio vaihteli kypsymisen aikana. Tämä saattaa johtua furaneolin epästabiilista luonteesta (Pérez ja muut 2002). Pérez ja 20 muut eivät löytäneet furaneolia omista mansikkanäytteistään oletettavasti epästabiiliuden tai lajikkeiden ja kasvuolosuhteiden erojen takia. Yamashita ja muut (1997) kertovat esterien löytyvän lähinnä vain kypsemmistä marjoista, sillä niitä muodostavaa entsyymiä ei esiinny raaoissa marjoissa. Haihtuvat rasvahapot ovat tärkeä esiaste esterien muodostumiselle mansikassa. Tutkimusryhmä esittää alkoholidehydrogenaasin olevan aktiivisimmillaan marjan kypsemmissä asteissa, mikä lisää alkoholien muodostumista aldehydeistä myöhemmillä kypsyysasteilla. Yamashita ja muut havaitsivat pentanaalin konsentraation vähenevän samalla, kun 1-pentanolin ja sen estereiden määrä nousi kypsymisen edetessä. 1-pentyyliesteriä ei kuitenkaan esiintynyt alle 30 päivän ikäisissä marjoissa. 1-pentyyliasetaattia ja 1-pentyyli-n-butyraattia löydettiin runsaasti 30–40 päivän ikäisistä marjoista. Esterien esiintyminen rinnastui marjojen koon ja värin voimakkuuden kanssa: kypsemmistä (yli 30 päivän ikäisistä) marjoista löytyi runsaimmin estereitä ja olivat suurimpia, tummempia sekä mansikanmakuisia. Kypsymisen edetessä myös haihtuvien rasvahappojen määrä nousi. Etikkahappoa ja voihappoa esiintyi vain pienissä määrin alle 30 päivän ikäisissä marjoissa, mutta kypsemmissä marjoissa niiden konsentraatio oli moninkertainen. (Yamashita ja muut 1977.) 1.6 Olosuhteiden vaikutus haihtuviin yhdisteisiin keräyksen jälkeen 1.6.1 Mustaherukka, Ribes nigrum Pagès-Hélary ja muut (2022) kartoittivat parinkymmenen mustaherukan haihtuviin yhdisteisiin liittyvän tutkimuksen tuloksia. Muun muassa yhdisteet karyofylleeni, α-terpineoli, α-terpinene ja (Z)-2-heksenaali olivat tunnistettavissa vain tuoreissa mustaherukoissa, pakastettuihin verrattuna. Nämä yhdisteet luokitellaan oleellisiksi mustaherukan haihtuviksi yhdisteiksi, mutta niiden poissaolo ei kuitenkaan muuttanut olennaisesti marjan tuoksuprofiilia. (Pagès- Hélary, Dujourdy ja Cayot, 2022.) Kontrolloidussa ympäristössä (CO2 ja O2 suhdetta muutettu) säilytettyjen mustaherukoiden terpeenialkoholien synteesi estyi alhaisen happitason tai korkean hiilidioksiditason myötä. Alhainen happitaso vaikutti etenkin eukalyptolin ja terpineeni-4-olin määrään negatiivisesti. Samojen yhdisteiden määrät kuitenkin kaksinkertaistuivat normaalissa ilmassa säilytetyissä marjoissa. Terpeenialkoholien lisäksi kuuden viikon ajan normaali-ilmassa säilytetyissä 21 herukoissa terpeeniesterien kokonaismäärät kasvoivat. Normaali-ilmassa tai kontrolloidussa ympäristössä säilyttäminen ei vaikuttanut merkitsevästi monoterpeenien määrään. Säilytysajan pidentäminen kolmesta kuuteen viikkoon vähensi monoterpeenien määriä jopa puolella ja erityisesti alhaisessa O2:ssa määrä väheni jo kolmen viikon aikana. Juuri poimittujen marjojen ja kolme viikkoa alhaisessa O2:ssa ja korkeassa CO2:ssa säilytettyjen marjojen yksittäisissä monoterpeeneissä oli eroja: tuoreet marjat sisälsivät runsaimmin 3-kareenia, α- pineeniä ja β-myrseeniä, kun taas säilötyissä oli runsaimin β-pineeniä, D- limoneenia ja β-symeeniä. Tuoreet marjat sisälsivät myös merkitsevästi enemmän seskviterpeenejä kuin kontrolloidussa ympäristössä säilytetyt. Kolmen ja kuuden viikon säilytys laski merkitsevästi alkoholien määrää muissa paitsi alhaisen O2-tason ympäristössä. (Harb, Bisharat ja Streif, 2008.) Marsol-Vall ja muut (2019) totesivat ettei vuoden mittainen säilytys +4 °C vaikuta olennaisesti haihtuviin yhdisteisiin tai niiden aistinvaraisiin ominaisuuksiin mustaherukkamehussa. Muun muassa α-pineenin, metyyli- ja etyylibutanaatin määrät laskivat jo ensimmäisen kuukauden jälkeen huoneenlämmössä säilytetyssä käsittelemättömässä mehussa. Nämä yhdisteet tuoksuvat makeilta ja hedelmäisiltä (The Good Scents Company, TGSC Information System 2021, sähköinen lähde). Eukalyptolin määrä ei juurikaan muuttunut 12 kuukauden säilytyksen aikana, minkä syynä saattaa olla eukalyptolinen muodostuminen limoneenista ja α-terpineolista happamissa (pH ~ 3) oloissa (Fariña ja muut 2005). 1.6.2 Vadelma, Rubus idaeus Säilytyksen vaikutusta vadelman haihtuviin yhdisteisiin tutkivat Morales ja muut (2014) huomasivat merkittäviä eroja kahden eri vadelmalajikkeen (Sevillana ja Maravilla) välillä. He mittasivat haihtuvien yhdisteiden määriä tuoreesta marjasta, viikon ja kolmen viikon säilytyksen jälkeen 0,5 °C asteessa. Sevillanan ja Maravillan sisältämissä haihtuvissa yhdisteissä tapahtui merkittäviä muutoksia: säilytyksen aikana esterien määrä laski ja terpeenien määrä kasvoi. Monoterpeeneistä erityisesti linaloolin, geraniolin ja L-4-terpineolin määrä nousi viikon mittaisen säilytyksen aikana molemmissa lajikkeissa. Lajikkeiden välillä oli kuitenkin myös eroja, Sevillanassa kokonaishaihtuvien yhdisteiden määrä laski 25 %, kun puolestaan Maravillassa nousi 67 %. Molempien lajikkeiden haihtuvien yhdisteiden profiili muuttui huomattavasti säilytyksen aikana. Heksanaalin, eukalyptolin ja β-jononin määrä kasvoi merkitsevästi viikon ja kolmen viikon 22 säilytyksen aikana Maravilla, mutta laskivat Sevillanassa. Lajikkeiden haihtuvissa yhdisteissä oli runsaasti eroja jo tuoreissa marjoissa. Säilytyksellä voidaan mahdollisesti vaikuttaa marjan tuoksuprofiiliin, sillä erityisesti terpeenit luovat kukkaisen ja yrttimäisen tuoksun. (Hui ja muut 2010, Morales ja muut 2014.) 1.7 Marjojen käsittelyn vaikutus haihtuviin yhdisteisiin Entsyymien käytöllä voidaan lisätä haihtuvien yhdisteiden määrää, sillä ne vapauttavat muun muassa marjan pektiiniin, selluloosaan ja ligniiniin sitoutuneita haihtuvia yhdisteitä. Marsol-Vall ja muiden (2021) tutkimuksessa todettiin viiden eri entsyymin lisäävän VOC:ien pitoisuuksia puolukasta puristetussa mehussa. Tutkimuksessa käytettiin pektinaasi-, sellulaasi-, β-glukosidaasi-, ksylaasi- ja arabinaasiaktiivisuuden omaavia entsyymejä. Entsyymin annoskoko ja inkubaatioaika ei vaikuttanut oleellisesti haihtuvien yhdisteiden pitoisuuden kasvuun. Entsyymikäsittelyn lisäksi fermentaatiolla voidaan vaikuttaa marjan tuoksuprofiiliin: vuonna 2014 tehdyssä tutkimuksessa Viljanen ja muut havaitsivat entsyymikäsittelyn ja entsyymi sekä fermentaation lisäävän puolukan aistittua makeutta aistinvaraisessa kokeessa. Lisäksi fermentaatio hiivalla lisäsi koettua makeutta. Voin tuoksuisen diasetyylin pitoisuus nousi 7-kertaiseksi hiivalla ja maitohappobakteerilla fermentoiduissa näytteissä. Myös kukkaisen tuoksuisen asetofenonin pitoisuus kaksinkertaistui. Aldehydien määrä puolestaan laski tai pysyi muuttumattoma tutkittavissa näytteissä. Marjojen ja hedelmien maseraatio eli murskaus saattaa lisätä lipoksygenaasientsyymin vapautumisen myötä vihreän tuoksuisten yhdisteiden kuten heksanaalin ja (E)-2-heksenaalin määriä. Pektinaasin lisääminen edelleen lisää tuoksuvien haihtuvien yhdisteiden muodostumista vapauttamalla niiden glykosidisidottuja esiasteita. Lisäksi esimerkiksi kuivan omenan puristusjätteen käyttäminen mansikoiden, vadelmien ja mustikoiden maseroinnissa lisäsi tuoksuvien estereiden ja hedelmäisten haihtuvien yhdisteiden määriä mehussa. Marjamehun kuumennus puolestaan johtaa estereiden ja vihreältä tuoksuvien yhdisteiden hajoamiseen ja lisää karamellimaisten yhdisteiden määriä. (Hui ja muut 2010.) Suolaus vaikuttaa marjojen haihtuvien yhdisteiden pitoisuuksiin, sillä se vähentää entsyymiaktiivisuutta. Niin sanottujen ”vihreiden tuoksuvien yhdisteiden” eli (Z)- 2- ja (E)-2-heksanaalin, heksanolin ja (E)-2- ja (Z)-3-heksenolien määrä oli 23 kaksinkertainen mustikoissa, joihin ei ollut lisätty suoloja (20 % NaCl ja 1 % NaF) hillitsemään entsyymiaktiivisuutta. NaCl:ia käytettiin inhiboimaan lipoksygenaasin aktiivisuutta ja NaF:a inhiboimaan mikrobien kasvua sekä hillitsemään polyfenolioksidaasin aktiivisuutta. Vihreämpi tuoksu suolaamattomissa marjoissa kävi myös ilmi alustavassa aistinvaraisessa arvioinnissa. (Du ja Rouseff, 2014.) Picon ja muiden (2022) tekemässä tutkimuksessa huomattiin NaCl:n, L-askorbiini- ja sitruunahapon lisäyksen vähentävän heksanaalin ja (E)-2-heksenaalin määrää merkittävästi mustikassa. Samalla, α-terpineolin ja guajakolin määrät kasvoivat suolauksen myötä. 1.8 Tutkimuksen tarkoitus Puolukan suosio markkinoilla ja ruokapöydässä ei valitettavasti välity tutkimusmaailmaan. Puolukkaa onkin tutkittu suhteellisen vähän muihin Vaccinium-marjoihin verrattuna. Puolukan haihtuvista yhdisteistä on tehty vain kymmenkunta tutkimusta, ja ne ovat keskittyneet kvantitoimaan ja kvalifioimaan haihtuvia yhdisteitä. Puolukan aistinvaraisiin ominaisuuksiin keskittyviä tutkimuksia on vain muutama. Haihtuvat yhdisteet ovat tärkeässä osassa maun ja tuoksun aistimisessa. Näiden yhdisteiden konsentraatioon vaikuttaa olennaisesti kasvin genotyyppi, kypsyysaste sekä kasvupaikka ja -olosuhteet. Pohjoisessa ja etelässä kasvaneiden puolukoiden marjojen haihtuvien ja muiden yhdisteiden koostumuksessa on tutkitusti eroja. (Kowalska, 2021.) Monien marjojen haihtuvista yhdisteistä ja niiden pitoisuuksiin vaikuttavista tekijöistä on runsaasti tutkimustietoa puolukkaan verrattuna. Puolukan yhdisteiden tutkimus ja etenkin sen haihtuvien yhdisteiden kartoitus kaipaa uusia ja kattavia tuloksia. Tämä opinnäyte pyrkii parantamaan tilannetta laajalla katsauksella yleisesti puolukan haihtuviin yhdisteisiin sekä niihin vaikuttaviin tekijöihin. Haihtuvia yhdisteitä on satoja ja jokaisella lajilla on sille ominainen tuoksuprofiili ja muutama tai useampi oleellisesti kyseisen marjan tyypilliseen tuoksuun vaikuttava yhdiste. Nämä yhdisteet eivät välttämättä ole pitoisuuksiltaan korkeita, mutta ovat sitäkin tärkeämpiä marjan ominaistuoksulle. Viljeltävien marjojen aistinvaraisia ominaisuuksia voidaan parantaa vaikuttamalla marjan tuoksuprofiiliin muuttamalla muun muassa kasvuolosuhteita, perimää ja valon määrä. Näiden lisäksi VOC:eihin voi vaikuttaa entsyymikäsittelyllä, fermentaatiolla tai vaikka suolauksella. 24 Tutkielman tarkoituksena oli selvittää kvalitatiivisesti ja kvantitatiivisesti puolukan haihtuvat yhdisteet erilaisissa näytteissä. Varsinaisessa tarkkailussa oli Etelä- ja Pohjois-Norjassa Åssa ja Tromssassa kasvaneet puolukan marjat. Tutkimuksen kohteena oli niin lämpötilan, kuin kypsyysasteen vaikutus haihtuviin yhdisteisiin. Tässä työssä käytettiin SPME-tekniikkaa (engl. solid-phase microextraction) eli kiinteäfaasiuuttoa, jossa marjanäytteen haihtuvat yhdisteet kerätään kuidun avulla. Yhdisteet analysoitiin ja tunnistettiin GC-MS:llä. 25 2 Materiaalit ja menetelmät 2.1 Näytteiden hankinta ja alkuperä Norjalaiset puolukat saatiin Norjasta osana Wildberry-projektia kahdelta eri paikkakunnalta. Marjat kerättiin Åssa ja Tromssassa aikavälillä 23.7.-17.9.2020. Näytteitä kerättiin kolmelta eri kasvualueelta (A, B ja C) paikkakunnan sisällä. Eri kypsyysasteita oli viisi: vihreä/valkoinen, punertava, punainen, tulipunainen ja tummanpunainen (ylikypsä). Marjojen kasvupaikkojen koordinaatit otettiin ylös. Fytotronissa kasvaneet marjat luokiteltiin kasvu- ja kasvulämpötilan (9 °C tai 15 °C) sekä käytetyn fytotronin (A, B ja C) mukaan (TAULUKKO 2). Marjat säilytettiin -20 asteessa näytteiden tekoon asti. TAULUKKO 1. Norjan kypsyysasteen puolukkanäytteiden paikkatiedot, keräämisajankohta sekä kypsyysaste. Paikka Alue Kypsyys Kuvaus Koordinaatit Keräämisaika Ås A 1 Vihreä/valkoinen 5936394N, 1048336E 23.07.2020 Ås B 1 Vihreä/valkoinen 5936484N, 1048326E 23.07.2020 Ås C 1 Vihreä/valkoinen 5938175N, 1048590E 24.07.2020 Ås A 2 Punertava 5936394N, 1048336E 24.07.2020 Ås B 2 Punertava 5936484N, 1048326E 24.07.2020 Ås C 2 Punertava 5938175N, 1048590E 24.07.2020 Tr - 2 Punertava Kvaløya/Krabbenes 25.09.2020 Ås A 3 Punainen 5936394N, 1048336E 08.08.2020 Ås B 3 Punainen 5936484N, 1048326E 08.08.2020 Ås C 3 Punainen 5938175N, 1048590E 08.08.2020 Tr - 3 Punainen Kvaløya/Krabbenes 25.09.2020 Ås A 4 Tulipunainen 5936394N, 1048336E 27.08.2020 Ås B 4 Tulipunainen 5936484N, 1048326E 27.08.2020 Ås C 4 Tulipunainen 5938175N, 1048590E 27.08.2020 Tr - 4 Tulipunainen Kvaløya/Krabbenes 25.09.2020 Ås A 5 Tulipunainen 5936394N, 1048336E 17.09.2020 Ås B 5 Tulipunainen 5936484N, 1048326E 17.09.2020 Ås C 5 Tulipunainen 5938175N, 1048590E 17.09.2020 Tr - 5 Tulipunainen Kvaløya/Krabbenes - 26 TAULUKKO 2. Fytotroninäytteiden laitetiedot, keräämisajankohta ja -vuosi sekä paikkakunta. Paikka Lämpötila Laite Fytotroni Keräämisaika Ås 15 A SKP, Ås 14.08.-21.08.2020 Ås 15 B SKP, Ås 14.08.-21.08.2020 Ås 15 C SKP, Ås 14.08.-21.08.2020 Ås 9 A SKP, Ås 14.08.-21.08.2020 Ås 9 B SKP, Ås 14.08.-21.08.2020 Ås 9 C SKP, Ås 14.08.-21.08.2020 Tr 15 A Holt, Tromssa 01.09.-11.09.2020 Tr 15 B Holt, Tromssa 01.09.-11.09.2020 Tr 15 C Holt, Tromssa 01.09.-11.09.2020 Tr 9 A Holt, Tromssa 01.09.-11.09.2020 Tr 9 B Holt, Tromssa 01.09.-11.09.2020 Tr 9 C Holt, Tromssa 01.09.-11.09.2020 27 2.2 Näytteiden valmistaminen ja GC-MS −ajo 2 grammaan hieman sulaneita puolukoita lisättiin 10 µl sisäisiä standardeja (100,25 µg/ml 4-metyyli-2-pentanolia (Sigma-Aldrich, Ranska) ja 112,5 µg/ml neryyliasetaattia (Sigma-Aldrich, Ranska)). Tämän jälkeen marjat murskattiin metallisella tikulla ja vorteksoitiin 5 sekuntia. Jokaisesta näytteestä valmistettiin neljä rinnakkaisnäytettä. Lisäksi valmistettiin sekoitus useasta haihtuvasta yhdisteestä, joita käytettiin apuna retentioindeksien laskemisessa. 1 µl p- symeeniä, heksanaalia, α-pineenia, 1-okten-3-olia, eukalyptolia, (Z)-2- heksenaalia, pentaanihappoa, 2,4-heptadienaalia, 2-metyylibutanaalia ja (Z)- karyofylleeniä (Sigma-Aldrich, Ranska) sekoitettiin 2 ml Milli-Q −vettä. Kaasukromatografina käytettiin Trace 1310 GC (Thermo Scientific, Yhdysvallat) ja massadetekronia ISQ 7000 Single Quadruple Mass Spectrometer (Thermo Scientific, Yhdysvallat). Näytteitä tasapainotettiin 45 asteessa 10 min ajan ja kuidun annettiin uuttaa yhdisteitä 45 °C 30 minuuttia. Näytteet uutettiin DVB/CAR/PDMS SPME -kuidulla (24Ga, df 50/30 µm, StableFlex,2 cm ja neulakoko Supelco, Yhdysvallat). Injektorin lämpötila 220 °C ja kantokaasu helium splitless-injektoituna. Heliumin virtausnopeus 1,60 ml/min. Tämän jälkeen näytteet siirtyivät J&W DB-WAX-kolonniin (60 m × 0,25 µm × 0,25 mm, Agilent, Yhdysvallat). Uunin aloituslämpötilana oli 50 °C, minkä jälkeen uunin lämpötilaa nostettiin 5 °C/min aina 200 °C asti. 14 minuutin odotusajan jälkeen näytteet ionisoitiin. Siirtolinjan lämpötila 220 °C ja näytteiden ionisointi suoritettiin 70 eV. Ionilähteen lämpötilana käytettiin 220 °C ja massaspektrometrin 240 °C. Yhdisteiden detektointi suoritettiin 33-300 m/z alueella. 2.3 Yhdisteiden tunnistus ja varmistus Alustava tunnistus tehtiin vertaamalla saatua MS-spektriä NIST20 Mass Spectral Library:n (National Institute of Standards and Techonology) referenssispektrehin. Yhdisteiden tunnistus varmistettiin NIST-tietokannasta vertaamalla saatuja retentioindeksejä (RI) mahdollisimman samankaltaisissa olosuhteissa ajettujen yhdisteiden RI-arvoihin. Retentioindeksien laskemiseen käytettiin C7-C30 Saturated Alkanes (Sigma-Aldrich, Yhdysvallat). Lopuksi yhdisteiden piikit identifioitiin ja integroitiin manuaalisesti Chromeleon-ohjelmalla (7.2.10, Thermo Scientific, Sveitsi). 28 3 Tulokset 3.1 Haihtuvien yhdisteiden kvantitointi ja kvalitointi SPME-GC/MS:lla Haihtuvia yhdisteitä tunnistettiin yhteensä 60, joista suurimmat yhdisteluokat olivat aldehydit, esterit, alkoholit ja terpeenit. Aldehydejä ja estereitä tunnistettiin molempia 13, alkoholeja 12, terpeenejä 11, karboksyylihappoja 8 ja ketoneita kolme. Heteroaromaattisia yhdisteitä tunnistettiin vain yksi (2-etyylifuraani). Taulukkoon 3 on koottu tunnistettujen yhdisteiden retentioindeksit ja niiden referenssit sekä tuoksureferenssit The Good Scents Companylta. Orgaanisia happoja tunnistettiin 8, ketoneita kolme ja aromaattisia yhdisteitä kaksi. 3- ja 2- heksenaalit tunnistettiin NIST:n tietokantojen avulla, mutta sopivaa retentioindeksin referenssiä ei löytynyt. Tiettyjä yhdisteitä, kuten dodekaanihapon estereitä ja sitronnellonia löydettiin näytteistä vain vähäisissä määrissä. Vuonna 1969 Anjou ja Sydow määrittelivät aldehydit runsaslukuisammaksi yhdisteluokaksi puolukassa. Aldehydien jälkeen tulivat alkoholit, terpeenit ja ketonit. Bentsoehappo, bentsyylialkoholi, bentsaldehydi, 2-metyyli-3-buten-2-oli ja linalooli olivat heidän tutkimuksessaan suuripitoisimmat yhdisteet. Myös tässä tutkimuksessa samaiset yhdisteet löytyvät suurimmissa konsentraatioissa. Bentsoehappo kattoi jopa 45 % kaikista haihtuvista yhdisteistä kuten esimerkiksi näytteissä Tr 15A ja Tr 15B. Bentsoehapon vaikutus karpalon tuoksuun osoittautui suhteellisen voimaakkaaksi Zhun ja muiden tutkimuksessa (2016). Se sijoittui 9:ksi karpalon tuoksuun voimakkaimmin vaikuttavaksi yhdisteeksi. Tutkijat kuvailivat bentsoehapon tuoksua makeaksi ja hunajaiseksi. The Good Scents Company puolestaan kuvailee yhdisteen tuoksua balsamia ja virtsaa muistuttavaksi. Viljanen ja muut (2014) ilmoittavat tutkimuksessaan etanolin, metyylibentsoaatin, etyyliasetaatin, bentsyylialkoholin, bentsaldehydin ja 3-metyylibutaanihapon runsaimmiksi yhdisteiksi puolukassa. Muun muassa metyylibentsoaatti on metanolin ja bentsoehapon muodostama esteri ja kumpaakin sen esiastetta esiintyy yleisesti kypsissä tai ylikypsissä marjoissa (Horvat ja Senter 1985). 29 Marjojen painoon vaikuttaa olennaisesti kypsyysaste, kuten nähdään kuviosta 2. Raa’at ja vihertävät marjat ovat selvästi muiden kypsyysasteen marjoja kevyempiä: raa’at marjat painavat keskimäärin 0,16 grammaa kun taas ylikypsä marja painaa 0,23–0,38 grammaa. Muun muassa sokerien määrä kasvaa jopa 40-kertaisesti marjan kypsyessä raa’asta ylikypsäksi ja vaikuttaa osaltaan marjan painoon (Matthews ja muut 1970). Fytotronissa kasvaneiden puolukoiden marjojen painot eivät eroa toisistaan erityisesti, sillä marjat olivat kypsyysasteeltaan samaa luokkaa. Fytotronissa kasvatettujen puolukoiden painot kuvattu kuviossa 3. Voidaan siis olettaa, että suurin vaikuttava tekijä marjan painoon on sen kypsyysaste. 30 TAULUKKO 3. SPME/GC-MS:llä mitattujen puolukan haihtuvien yhdisteiden retentioindeksit, peruspiikit, referenssit ja tuoksut. RI a referenssi RI Yhdiste BP d Kirjallisuuslähde Tuoksu e 722 690 Asetaldehydi 44,05 Rizzolo, Cambiaghi, ja muut 2005 Pistävä, eetteri, raikas ja hedelmä 819 818 2-metyylipropanaali 43,05 Umano, Hagi, ja muut 2000 Raikas, kukkaisa ja vihreä 893 885 Etyyliasetaatti 43,04 Shimoda, Shiratsuchi, ja muut 1993 Eetteri, hedelmä ja rypäle 918 910 2-metyylibutanaali 57,05 Hayata, Sakamoto, ja muut 2002 Tunkkainen, suklaa ja pähkinä 923 914 3-metyylibutanaatti 44,05 Shimoda, Shiratsuchi, ja muut 1993 Eetteri, aldehydi ja suklaa 961 944 2-etyylifuraani 81,02 Horiuchi, Umano, ja muut 1998 Kemiallinen ja mallas 1027 1027 α-Pineeni 55,03 Shimizu, Imayoshi, ja muut 2009 Puu, mänty ja tärpätti 1028 1022 1-penten-3-oni 55,00 Ganeko, Shoda, ja muut 2008 Pistävä, eetteri, pippuri ja sipuli 1042 1035 Butaanihapon etyyliesteri 43,07 Paniandy, Chane-Ming, ja muut 2000 Hedelmä, mehevä ja konjakki 1046 1030 1-propanoli 42,08 Binder, Flath, ja muut 1989 Alkoholi, fermentoitunut ja hiiva 1047 1036 2-metyyli-3-buten-2-oli 71,04 Umano, Hagi, ja muut 2002 Yritti, multa ja öljy 1070 1063 Kamfeeni 93,04 Wei A. ja Shibamoto T., 2007 Kamferi, viileä ja mänty 1087 1084 Heksanaali 56,03 Rizzolo, Cambiaghi, ja muut 2005 Vihreä, rasva ja vihannes 1105 1112 β-Pineeni 93,07 Shimizu, Imayoshi, ja muut 2009 Viileä, puu ja minttu 1124 1130 3-metyylibutyyli asetaatti 43,05 Wada ja Shibamoto, 1997 Makea, banaani ja hedelmä 1136 1121 (E)-2-pentenaali 55,05 Horiuchi, Umano, ja muut 1998 Pistävä, vihreä ja omena 1148 b 3-heksenaali 41,04 b Ruoho, vihreä ja omena 1198 1202 D-limoneeni 68,06 Shimizu, Imayoshi, ja muut 2009 Makea ja sitrus 1214 1204 Eukalyptoli 43 Cai, Lin, ja muut 2006 Yrttinen ja lääke 1215 1236 3-metyyli-1-butanoli 45,06 Wada ja Shibamoto, 1997 Alkoholi, pistävä ja hedelmä 1236 1236 Heksaanihapon etyyliesteri 41,08 Paniandy, Chane-Ming, ja muut 2000 Makea, hedelmä ja vaha 31 RI a referenssi RI Yhdiste BP d Kirjallisuuslähde Tuoksu e 1245 1251 γ-Terpineeni 93,06 Christoph, 2001 Sitrus, puu ja kamfori 1257 1259 1-pentanoli 42,01 Chyau ja Mau, 2001 Pistävä, fermentoitunut, hiiva ja liuotin 1270 1265 p-symeeni 119,1 Cai, Lin, ja muut 2006 Kemikaalinen, mauste ja sitrus 1276 1271 Heksyyliasetaatti 43,03 Hayata, Sakamoto, ja muut 2002 Vihreä, hedelmä ja makea 1295 1287 Asetoiini 45,04 Wada ja Shibamoto, 1997 Makea, kerma ja rasva 1316 1318 (Z)-3-heksenyyli asetaatti 43,04 Paniandy, Chane-Ming, ja muut 2000 Rasva, vihreä ja makea hedelmä 1341 1332 6-metyyli-5-hepten-2-oni 43,02 Binder, Turner, ja muut 1990 Sitrus, vihreä ja tunkkainen 1361 1345 1-heksanoli 56,07 Ravichandran ja Parthiban, 1998 Pistävä, eetteri, alkoholi ja makea 1397 1397 Nonanaali 57,07 Chyau ja Mau, 2001 Vaha, sitrus ja raikas vihreä 1405 1398 (E,E)-2,4-heksadienaali 81,02 Paniandy, Chane-Ming, ja muut 2000 Vihreä, hedelmä, sitrus ja vaha 1415 1405 (E)-2-heksen-1-oli 67,05 Ravichandran ja Parthiban, 1998 Raikas, rasva, vihreä ja öljy 1438 1430 (E)-2-oktenaali 55,05 Chyau ja Mau, 2001 Raikas, rasva, vihreä ja yrtti 1442 1443 Oktaanihapon etyyliesteri 41,07 Wada ja Shibamoto, 1997 Vaha, makea, tunkkainen ja hedelmä 1454 1454 1-okten-3-oli 57,05 Chyau ja Mau, 2001 Multa, vihreä ja öljy 1457 1448 Etikkahappo 43,03 Cai, Lin, ja muut 2006 Terävä, pistävä ja hapan 1472 1508 (E,E)-2,4-heptadienaali 81,02 Chyau ja Mau, 2001 Rasva, vihreä ja öljy 1485 1471 trans-Linaloolioksidi 59,06 Umano, Nakahara, ja muut 1999 Puu, kukkaisa ja viileä 1538 1535 Bentsaldehydi 105,06 Wada ja Shibamoto, 1997 Manteli, hedelmä ja pähkinä 1611 1601 Karyofylleeni 83,01 Shimizu, Imayoshi, ja muut 2009 Makea, puu ja mauste 1616 1612 Terpineeni-4-oli 71,06 Wei A. ja Shibamoto T., 2007 Puu, setripuu ja mentoli 1623 1615 (E)-2-okten-1-oli 57,04 Umano, Hagi, ja muut 2000 Vihreä, sitrus ja rasva 1642 1641 Bentsoehapon metyyliesteri 105,03 Wei A. ja Shibamoto T., 2007 Kemikaalinen, fenoli ja kirsikka 1646 1637 Dekaanihapon etyyliesteri 45,06 Wada ja Shibamoto, 1997 Makea, vaha ja hedelmä 32 RI a referenssi RI Yhdiste BP d Kirjallisuuslähde Tuoksu e 1673 1656 Asetofenoni 77,02 Sekiwa, Kubota, ja muut 1997 Makea, marsipaani ja kumariini 1685 1656 Bentsoehapon etyyliesteri 45,06 Binder ja Flath, 1989 Makea, ikivihreä ja hedelmä 1749 1743 Pentaanihappo 60,01 López, Ezpeleta, ja muut 2004 Hapan, terävä, juusto ja tupakka 1774 769 1-dekanoli 55,08 Werkhoff, Güntert, ja muut 1998 Rasva, vaha, hedelmä ja makea 1779 1766 Sitronelloni 41,07 Christoph, 2001 Kukkaisa, makea ja sitrus 1814 1814 Dodekaanihapon metyyliesteri 45,06 Choi 2004 Vaha, saippua ja kerma 1839 1828 Fenetyyliasetaatti 104,08 Wada ja Shibamoto, 1997 Makea, kukkaisa ja hiiva 1856 1843 Dodekaanihapon etyyliesteri 88,08 López, Ezpeleta, ja muut 2004 Makea, vaha ja hedelmä 1859 1852 Heksaanihappo 60,01 Wada ja Shibamoto, 1997 Hapan, rasva ja juusto 1895 1879 Bentsyylialkoholi 79,05 Wada ja Shibamoto, 1997 Makea, kukkaisa ja hedelmä 1939 1930 Fenetyylialkoholi 45,06 Wada ja Shibamoto, 1997 Makea, kukkaisa, raikas ja leipä 1965 1956 Heptaanihappo 60,02 Sekiwa, Kubota, ja muut 1997 Juusto, vaha, fermentoitunut ja hedelmä 2064 2072 Oktaanihappo 45,06 Wada ja Shibamoto, 1997 Rasva, vaha ja eltaantunut 2168 2165 Nonaanihappo 73,03 Dregus ja Engel, 2003 Vaha, lika ja juusto 2499 2420 Bentsoehappo 105,01 Krammer, Winterhalter, ja muut 1991c Balsami ja virtsa a Mitattu retentioindeksi, b ei referenssi-RI:tä, c referenssilähteessä käytetty 30m kolonnia, d peruspiikki (engl. Base peak) ja e tuoksukuvailut The Good Scents Companylta. 33 KUVIO 2. Marjojen keskimääräinen paino (g) kypsyysastenäytteissä Åsasta ja Tromssasta. Eri kypsyysasteet: vihreä/valkoinen, punertava, punainen, tulipunainen ja tummanpunainen (ylikypsä). KUVIO 3. Marjojen keskimääräinen paino (g) fytotroninäytteissä Åsasta ja Tromssasta 9° ja 15° asteessa. 3.2 Fytotroninäytteet: 9 °C ja 15 °C Kontrolloiduissa kasvuolosuhteissa kasvaneista puolukoista tunnistettiin yhteensä 35 eri haihtuvaa yhdistettä. Runsaslukuisammaksi yhdisteluokaksi 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 Ås A1 Ås A2 Ås A3 Ås A4 Ås A5 Ås B1 Ås B2 Ås B3 Ås B4 Ås B5 Ås C1 Ås C2 Ås C3 Ås C4 Ås C5 Tr2 Tr3 TR4 Tr5 gr am m aa 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 0,45 Ås 9A Ås 9B Ås 9C Ås 15A Ås 15B Ås 15C Tr 9A Tr 9B Tr 9C Tr 15A Tr 15B Tr 15C gr am m aa 34 nousi esterit ja alkoholit, joita kumpaakin tunnistettiin 9. Aldehydit ja terpeenit olivat seuraavina. Aldehydejä tunnistettiin 6 ja terpeenejä 5. Ketoneita tunnistettiin vain kaksi ja karboksyylihappoja neljä. Kuvioon 4 on koottu muutamia fytotroninäytteiden suuripitoisimpia yhdisteitä. Kuvaajasta näkee, että bentsoehappo esiintyy suurissa pitoisuuksissa muihin yhdisteisiin verrattuna. Bentsoehapon lisäksi näytteistä löytyi runsaasti heksanaalia, 2-heksenaalia ja 2- metyylipropanaalia. Muiden haihtuvien yhdisteiden pitoisuus oli vain murto-osa edellä mainituista yhdisteistä. Bentsoehapon pitoisuus oli keskimäärin suurempi 15 asteen näytteissä kuin 9 asteessa kasvaneissa. Tromssan 15 asteen näytteissä bentsoehapon osuus oli reilusti yli puolet kaikista haihtuvista yhdisteistä. Tr9 B:ssä ja Tr15 C:ssä oli huomattavasti enemmän vihreän ja raikkaan tuoksuista 2-metyylipropanaalia. Vihreän tuoksuisista yhdisteistä, kuten heksanaali ja 2-heksenaali löytyi runsaammin Åsin näytteistä kuin Tromssan lämpötilasta huolimatta. Taulukkoihin 4 ja 5 on koottu fytotroninäytteistä tunnistetut haihtuvat yhdisteet. KUVIO 4. Fytotronissa kasvatettujen näytteiden suuripitoisimmat haihtuvat yhdisteet Åsasta ja Tromssasta. Näytteitä kasvatettiin joko 15 tai 9 asteessa kolmessa eri laitteessa (A-B). Kirjaimet A-C kuvaavat eri kasvupaikkoja paikkakuntien sisällä. 0 5 10 15 20 25 As 9A As 9B As 9C As 15 A As 15 B As15 C TR 9A Tr9 B Tr9 C Tr15 A Tr15 B Tr15 C µ g/ 2 g Näyte 2-metyylipropanaali Heksanaali 2-heksenaali Heksyyliasetaatti 1-heksanoli (E)-2-heksen-1-oli Bentsyylialkoholi Bentsoehappo 35 TAULUKKO 4. Fytotroninäytteet A. SPME/GC-MS:llä mitattujen puolukan haihtuvien yhdisteiden pitoisuudet (µl/2 g) näytteittäin. Yhdiste Ås 9A Ås 9B Ås 9C Ås 15A Ås 15B Ås 15C Asetaldehydi 0,2±0,051 0,167±0,022 0,179±0,03 0,359±0,135 0,209±0,209 0,416±0,416 2-metyylipropanaali 0,041±0,006 0,041±0,005 0,08±0,031 0,082±0,033 0,075±0,075 0,082±0,082 Etyyliasetaatti 0,121±0,008 0,102±0,059 0,084±0,046 0,141±0,011 0,104±0,104 0,138±0,138 2-etyylifuraani 0,271±0,072b 0,076±0,025 0,096±0,019 0,26±0,067b 0,084±0,084 0,029±0,029 1-penten-3-oni 0,717±0,145b 0,273±0,128 0,27±0,052 0,709±0,103c 0,373±0,373b 0,138±0,138 Heksanaali 6,943±0,783b 4,157±1,309 4,483±0,909 6,304±0,916c 4,366±4,366b 1,921±1,921 3-heksenaali 6,956±1,533b 2,656±0,996 3,144±0,771 5,165±1,381b 2,098±2,098 0,668±0,668 3-metyyli-1-butanoli - 0,006±0,004 0,007±0,002 0,013±0,013 0,003±0,003 0,034±0,034b 2-heksenaali 5,795±1,711b 1,967±0,787 2,411±0,403 5,669±1,427b 1,8±1,8 0,613±0,613 γ-Terpineeni 0,002±0b 0,001±0 0,001±0 0,002±0,001b 0,001±0,001 0,001±0,001 1-pentanoli 0,064±0,008 0,057±0,009 0,062±0,01 0,074±0,009 0,077±0,077 0,042±0,042a p-symeeni 0,002±0,001 0,002±0 0,002±0 0,004±0,001b 0,002±0,002 0,001±0,001 Heksyyliasetaatti 0,115±0,1 0,046±0,057 0,035±0,022b 0,052±0,03 0,022±0,022 0,019±0,019 Asetoiini 0,007±0,003 0,007±0,002 0,021±0,007b 0,034±0,038 0,006±0,006 0,144±0,144b 1-heksanoli 0,481±0,024b 0,405±0,077b 0,424±0,049 0,607±0,207b 0,39±0,39ab 0,192±0,192a (E)-2-heksen-1-oli 0,174±0,039b 0,101±0,071b 0,054±0,027 0,125±0,03 0,179±0,179 0,036±0,036a trans-Linaloolioksidi 0,048±0,018 0,039±0,01 0,035±0,011 0,01±0,003c - 0,004±0,004b Bentsaldehydi 0,031±0,002 0,027±0,006 0,031±0,006 0,248±0,378 0,032±0,032 0,021±0,021 Terpineeni-4-oli 0,001±0,001 0,001±0 0,002±0b 0,002±0,001b - 0,001±0,001 Asetofenoni 0,033±0,019 0,034±0,019 0,044±0,012 0,034±0,019 0,035±0,035 0,034±0,034 Bentsoehapon etyyliesteri - - - 0,001±0,002 - 0,007±0,007b Pentaanihappo 0,129±0,032 0,071±0,022 0,092±0,037 0,11±0,043 0,153±0,153 0,088±0,088 Sitronelloni 0,002±0,001 0,002±0,001 0,001±0,001 - - - Fenetyyliasetaatti - - - 0,001±0,001 - 0,001±0,001 Heksaanihappo 0,62±0,1b 0,374±0,084b 0,519±0,068 0,509±0,094 0,525±0,525 0,504±0,504 36 Yhdiste Ås 9A Ås 9B Ås 9C Ås 15A Ås 15B Ås 15C Bentsyylialkoholi 0,366±0,039 0,242±0,116 0,301±0,177 1,385±2,158 0,242±0,242 0,364±0,364 Fenetyylialkoholi - - - 0,006±0,009 - 0,001±0,001 Oktaanihappo 0,04±0,01 0,032±0,006 0,04±0,009 0,048±0,01 0,037±0,037 0,054±0,054 Bentsoehappo 4,572±1,972 2,92±1,232 7,455±3,263 6,54±3,817 4,216±4,216 12,646±12,646 Kokonaispitoisuus 37,734±5,014 23,806±3,095 29,875±5,28 38,495±9,532 25,029±25,029 28,195±28,195 Kirjaimet b ja c tarkoittavat yhdisteiden keskiarvojen olevan eri ryhmissä ja eroavan tilastollisesti toisistaan. Kirjaimeton tulos (eli a-ryhmä) on myös omassa ryhmässään ja tilastollisesti poikkeaa muista ryhmistä. Tilastollinen analyysi suoritettu kolmen näytteen sarjassa (Ås 9A-9C ja Ås 15A-15C). 37 TAULUKKO 5. Fytotroninäytteet B. SPME/GC-MS:llä mitattujen puolukan haihtuvien yhdisteiden pitoisuudet (µl/2 g) näytteittäin. Yhdiste Tr 9A Tr 9B Tr 9C Tr 15A Tr 15B Tr 15C Asetaldehydi 0,072±0,019 0,059±0,059 0,06±0,06 0,061±0,013 0,056±0,011 0,075±0,01 2-metyylipropanaali 4,658±7,656 0,059±0,059 0,06±0,06 0,077±0,009 0,079±0,011 6,374±8,832 Etyyliasetaatti 0,134±0,012 0,127±0,127 0,134±0,134 0,13±0,014 0,096±0,008a 0,115±0,002 2-etyylifuraani 0,013±0,004 0,033±0,033b 0,018±0,018 0,018±0,006 0,017±0,004 0,027±0,007 1-penten-3-oni 0,052±0,027 0,072±0,072 0,054±0,054 0,085±0,023 0,081±0,013 0,149±0,051 Voihapon etyyliesteri 0,002±0 0,002±0,002 0,001±0,001 0,001±0 0,001±0,001 0,002±0 1-propanoli - - - - 0,001±0 0,002±0,001 Heksanaali 0,339±0,252 0,579±0,579 0,527±0,527 0,704±0,178 0,983±0,301 0,917±0,563 3-heksenaali 0,144±0,088 0,314±0,314 0,262±0,262 0,184±0,061 0,191±0,051 0,274±0,073 3-metyyli-1-butanoli 0,038±0,043a 0,038±0,038b 0,006±0,006ab 0,043±0,029 0,041±0,032 0,046±0,025 2-heksenaali 0,509±0,225 1±1 0,685±0,685 0,696±0,192 0,806±0,306 0,972±0,112 γ-Terpineeni 0,002±0,001b 0,002±0,002 0,002±0,002 0,045±0,029 0,016±0,016 0,054±0,089 1-pentanoli 0,069±0,014 0,052±0,052 0,046±0,046 0,053±0,006 0,053±0,008 0,062±0,008 p-symeeni - - - 0,103±0,063b 0,037±0,039b - Heksyyliasetaatti - - - 0,568±0,237 0,313±0,095 0,382±0,418 Asetoiini 0,037±0,005 0,037±0,037 0,033±0,033 0,069±0,016 0,076±0,015 0,081±0,02 1-heksanoli 0,577±0,312ab 0,74±0,74b 0,461±0,461a 0,74±0,225 0,715±0,153 0,991±0,489 (E)-2-heksen-1-oli 0,691±0,465 0,714±0,714 0,513±0,513 0,479±0,171 0,787±0,158 0,738±0,113 Oktaanihapon etyyliesteri - - - 0,002±0,001 0,001±0,001 0,001±0,001 trans-Linaloolioksidi 0,104±0,111b - - 0,071±0,018 0,083±0,017 0,079±0,046 Bentsaldehydi 0,033±0,007 0,041±0,041 0,028±0,028 0,038±0,005 0,061±0,045 0,049±0,008 Terpineeni-4-oli 0,208±0,315 0,213±0,213 0,031±0,031 0,002±0,001 0,191±0,194 0,473±0,395 Dekaanihapon etyyliesteri - - - 0,002±0,001 0,002±0,001 0,001±0,001 Asetofenoni 0,066±0,009 0,079±0,079a 0,082±0,082 0,036±0,02 0,068±0,02 0,062±0,009 Bentsoehapon etyyliesteri 0,003±0,002b 0,002±0,002a - 0,004±0,002 - 0,002±0,002 38 Yhdiste Tr 9A Tr 9B Tr 9C Tr 15A Tr 15B Tr 15C Pentaanihappo 0,043±0,023 0,068±0,068 0,054±0,054 0,087±0,034 0,055±0,032 0,08±0,038 1-dekanoli 0,001±0,001 0,001±0,001 0,002±0,002 0,003±0,001 0,003±0 0,004±0,001 Sitronelloni 0,011±0,003 0,006±0,006 0,006±0,006 0,003±0,001 0,003±0,001 0,004±0,001 Fenetyyliasetaatti - - - 0,002±0,001b 0,001±0,001b - Dodekaanihapon etyyliesteri - - - 0,001±0,001 0,002±0,001 - Heksaanihappo 0,204±0,069 0,326±0,326 0,215±0,215 0,422±0,066 0,281±0,137 0,317±0,059 Bentsyylialkoholi 0,466±0,023 0,431±0,431 0,529±0,529 0,54±0,163 1,11±0,704 0,811±0,19 Fenetyylialkoholi 0,003±0 0,002±0,002 0,003±0,003 0,013±0,01 0,01±0,006 0,005±0,001 Oktaanihappo 0,055±0,011 0,026±0,026 0,038±0,038 0,048±0,009 0,047±0,022 0,046±0,008 Bentsoehappo 6,326±6,34 5,282±5,282 - 12,728±1,353 13,545±2,076 7,897±8,152 Kokonaispitoisuus 24,971±11,232 20,335±20,335 16,604±16,604 28,082±2,037 29,845±2,482 31,223±14,633 Kirjaimet a, b ja c tarkoittavat yhdisteiden keskiarvojen olevan eri ryhmissä ja eroavan tilastollisesti toisistaan. Kirjaimeton tulos (eli a-ryhmä) on myös omassa ryhmässään ja tilastollisesti poikkeaa muista ryhmistä. Tilastollinen analyysi suoritettu kolmen näytteen sarjassa (Tr 9A-9C ja Tr 15A-C). 39 3.3 Kypsyysasteen vaikutus haihtuviin yhdisteisiin Eri kypsyysasteen puolukoissa suurin yhdisteluokka oli aldehydit. Aldehydien jälkeen suurimmat yhdisteluokat olivat alkoholit, terpeenit, esterit ja karboksyylihapot. Yhteensä näytteistä tunnistettiin 53 haihtuvaa yhdistettä. Näistä aldehydejä oli 13, alkoholeja 11, terpeenejä 10, karboksyylihappoja ja estereitä 7. Ketoneja tunnistettiin vain kolme. Bentsoehapon pitoisuus nousi marjan kypsyessä, kuten kuvasta 3 näkyy. Marjan kypsyessä myös muiden karboksyylihappojen pitoisuus nousi: taulukoissa 1 ja 2 ylikypsien näytteiden (A5, B5, C5 ja Tr5) bentsoehapon pitoisuus erosi tilastollisesti merkitsevästi muista näytteistä. Taulukossa kirjaimet a, b, c ja d kertovat näytteen poikkeavan tilastollisesti muista näytesarjan näytteistä. Myös pentaani-, heksaani-, heptaani- , oktaani- ja nonaanihapon pitoisuudet eroavat ylikypsien marjojen ja muiden kypsyysasteiden marjojen pitoisuuksista tilastollisesti merkitsevästi. Ylikypsien marjojen haihtuvien yhdisteiden pitoisuudet poikkesivat useasti tilastollisesti merkitsevästi muista kypsyysasteiden marjoista (TAULUKKO 6). Marjan kypsyminen selvästi lisäsi haihtuvien yhdisteiden kokonaismäärää. Kuviossa 3 esitetään eri kypsyysasteella olevien puolukoiden haihtuvien yhdisteiden kokonaismäärät raa’asta marjasta ylikypsään. Åsin marjat sisältävät keskimäärin enemmän haihtuvia yhdisteitä kuin Tromssan. Lisäksi Åsasta kerättyjen puolukoiden kasvualuiden (A-C) välillä on eroja: alueen C kypsissä ja ylikypsissä puolukoissa esiintyy hieman enemmän haihtuvia yhdisteitä kuin alueiden A ja B puolukoissa. Tromssan kypsissä ja ylikypsissä marjoissa on puolestaan vähemmän haihtuvia yhdisteitä kuin Åssa kasvaneissa. Bentsoehapon pitoisuus oli huomattavasti alhaisempi Tromssan kuin Åsin marjoissa, mikä selittää Tromssan haihtuvien yhdisteiden kokonaispitoisuuden alhaisuuden (KUVIO 7). Kuvasta 6 nähdään, että puolukan ominaistuoksuun merkittävästi vaikuttavan 2-metyylibutaanihapon pitoisuus oli kuitenkin suurempi pohjoisemman leveyspiirin näytteissä Tromssassa kuin Åssa. Yhdisteen pitoisuus nousi marjan kypsyessä. Kuvioon 6 on koottu haihtuvien yhdisteiden kokonaispitoisuudet lukuunottamatta runsaspitoista bentsoehappoa. Nyt huomataan, että Åsin A1-A5 näytteiden muiden VOC:ien kokonaispitoisuus on keskimäärin alhaisempi kuin muiden näytteiden. Tromssan näytteistä löytyi kohtalaisen paljon muita haihtuvia yhdisteitä kuin bentsoehappoa, mutta hajonta oli myös suhteellisen suurta. Vihreän tuoksuista heksanaalia ja muita 40 rasvahappojen hapettumisen seurauksena syntyneitä yhdisteitä 2- ja 3- heksenaalia esiintyi runsaimmin Åsin alueen B näytteissä. Tromssan näytteissä näiden yhdisteiden määrät olivat suhteellisen pieniä. Miellyttävän tuoksuisia yhdisteitä, kuten asetofenonia löytyi enemmän kypsistä marjanäytteistä. D-limoneeni tunnistettiin kypsyysnäytteistä, mutta fytotroninäytteissä sitä esiintyi erittäin pienissä määrissä. Asetofenoni on miellyttävän makea, marsipaanin ja kumaariinin tuoksuinen ja D-limoneeni sitruksisen makea. Puolukan ominaistuoksusta osittain vastaavaa 2- metyylivoihappoa tunnistettiin runsaimmissa määrin tummanpunaisista marjoista. Etenkin Tromssan marjat sisälsivät runsaasti tätä yhdistettä (KUVIO 7) KUVIO 5. Haihtuvien yhdisteiden kokonaismäärä Ås:in ja Tromssan näytteissä Ås A1-5, Ås B1-5, Ås C1-5 ja Tr 2-5. Värit kuvastavat marjan kypsymisen edistymistä vihreänvalkoisesta raa’asta marjasta ylikypsäksi (tumman punainen). Kirjaimet A-C kuvaavat eri kasvupaikkoja paikkakuntien sisällä. 0 20 40 60 80 100 120 140 As A1 As A2 As A3 As A4 As A5 As B1 As B2 As B3 As B4 As B5 As C1 As C2 As C3 As C4 As C5 Tr2 Tr3 Tr A4 Tr5 µ g/ 2 g Näyte 41 KUVIO 6. Haihtuvien yhdisteiden kokonaismäärä Ås:in ja Tromssan näytteissä Ås A1-5, Ås B1-5, Ås C1-5 ja Tr 2-5 lukuunottamatta bentsoehappoa. Värit kuvastavat marjan kypsymisen edistymistä vihreänvalkoisesta raa’asta marjasta (harmaa) ylikypsäksi (tumman punainen). Kirjaimet A-C kuvaavat eri kasvupaikkoja paikkakuntien sisällä. KUVIO 7. Kypsyysasteen näytteistä tunnistetut suuripitoisimmat yhdisteet Åsasta Å1-5, Ås B1-5, Ås C1-5 ja Tromssasta Tr2-5. Kirjaimet A-C kuvaavat eri kasvupaikkoja paikkakuntien sisällä. 0 10 20 30 40 50 60 As A1 As A2 As A3 As A4 As A5 As B1 As B2 As B3 As B4 As B5 As C1 As C2 As C3 As C4 As C5 Tr2 Tr3 Tr A4 Tr5 µ g/ 2 g Näyte 0 20 40 60 80 100 120 Ås A1 Ås A2 Ås A3 Ås A4 Ås A5 Ås B1 Ås B2 Ås B3 Ås B4 Ås B5 Ås C1 Ås C2 Ås C3 Ås C4 Ås C5 Tr2 Tr3 Tr A4 Tr5 µ g/ 2 g Näyte Butaanihapon etyyliesteri Heksanaali 3-heksenaali 2-heksenaali 2-metyylibutaanihappo Bentsoehappo 42 TAULUKKO 6. Kypsyysastenäytteet A. SPME/GC-MS:llä mitattujen puolukan haihtuvien yhdisteiden pitoisuudet (µl/2 g) näytteittäin. Yhdiste Ås A1 Ås A2 Ås A3 Ås A4 Ås A5 Ås B1 Ås B2 Ås B3 Ås B4 Ås B5 (E)-2-heksen-1-oli 0,033±0,038 0,014±0,004 0,025±0,006 0,026±0,009 0,071±0,033 0,139±0,046b 0,029±0,016 0,029±0,007 0,041±0,008 0,046±0,023 (E)-2-okten-1-oli 0,004±0,004 0,003±0,004 0,012±0,002b 0,008±0,001a b 0,005±0,002 0,004±0,003 0,007±0 0,017±0,001b 0,011±0,003 0,028±0,007c (E)-2-oktenaali 0,053±0,005b 0,021±0,003 0,069±0,009b 0,028±0,004 0,061±0,014b 0,069±0,011a b 0,032±0,004a 0,078±0,003c 0,032±0,007a 0,06±0,005b (E)-2-pentenaali 0,089±0,014b c 0,033±0,003a 0,107±0,027c 0,061±0,02ab 0,087±0,023bc 0,155±0,007b 0,086±0,023a 0,271±0,042c 0,094±0,01a 0,28±0,013c (E,E)-2,4-heksadienaali 0,025±0,004 0,017±0,001 0,061±0,013b 0,034±0,008 0,073±0,025b 0,047±0,009 0,047±0,01 0,17±0,026b 0,083±0,016 0,145±0,036b (E,E)-2,4-heptadienaali 0,066±0,014c 0,021±0,002a 0,042±0,007b 0,025±0,005a b 0,039±0,008b 0,112±0,019c 0,041±0,007a 0,077±0,004b 0,04±0,006a 0,076±0,005b (Z)-3-heksenyyli asetaatti 1,354±0,386b 0,194±0,047 0,316±0,072 0,256±0,126 0,146±0,034 1,226±0,332a 0,117±0,032 0,184±0,058 0,274±0,296 0,148±0,064 1-heksanoli 0,259±0,07b 0,094±0,017a 0,318±0,076b c 0,303±0,099b c 0,427±0,062c 0,276±0,056 0,148±0,072a 0,501±0,144b 0,346±0,114 0,45±0,191b 1-okten-3-oli 1,716±2,784 0,046±0,007 0,146±0,019 0,099±0,014 0,197±0,059 2,391±3,966b 0,073±0,006a 0,173±0,013 0,129±0,031a 0,425±0,22 1-pentanoli 0,174±0,025c 0,054±0,005a 0,137±0,018b 0,076±0,012a 0,113±0,026b 0,339±0,054c 0,141±0,015a b 0,169±0,016b 0,087±0,016a 0,143±0,016ab 1-penten-3-oni 0,384±0,092c d 0,161±0,023b - 0,276±0,072b c 0,469±0,109 0,642±0,029 0,392±0,095 1,154±0,068b 0,01±0,003a 1±0,568b 1-propanoli - - - - - 0,005±0 0,005±0 - - 0,023±0,018b 2-etyylifuraani 0,189±0,071c 0,04±0,006ab 0,016±0,002a b - 0,087±0,026b 0,366±0,05b 0,081±0,022 - - 0,091±0,094 2-heksenaali 2,018±0,461c 0,626±0,071 1,625±0,452b c 0,824±0,305 1,059±0,304ab 4,48±0,382ab 2,122±0,58 5,421±0,944c 1,991±0,241 3,557±0,808b 2-metyyli-3-buten-2-oli - - - 0,009±0,009 0,009±0,01 - - 0,128±0,079b 0,283±0,025c - 2-metyylibutanaali 0,02±0,003 0,015±0 0,005±0,003a 0,015±0,006 0,023±0,004 0,024±0,001 0,019±0,002 0,005±0,001a 0,019±0,007 0,015±0,005 2-metyylipropanaali 0,315±0,046c 0,169±0,016 0,203±0,022 - 0,165±0,025 0,324±0,053b 0,24±0,113b - - - 43 Yhdiste Ås A1 Ås A2 Ås A3 Ås A4 Ås A5 Ås B1 Ås B2 Ås B3 Ås B4 Ås B5 2-metyylibutaanihappo 0,044±0,009 0,016±0,022 0,23±0,073 1,629±0,831a b 2,748±1,337b 0,021±0,012 0,045±0,005 0,264±0,064 0,552±0,139 1,999±0,524b 3-heksenaali 0,28±0,059 0,305±0,015 1,444±0,363b 0,697±0,259 1,212±0,387b 0,541±0,066a 1,409±0,358b 4,673±0,753d 1,708±0,236b 3,665±0,503c 3-metyylibutanaali 0,053±0,028b 0,006±0,007 0,052±0,023b 0,013±0,005 0,008±0,006 0,052±0,019 0,006±0,004 0,003±0,003 0,015±0,005 - 6-metyyli-5-hepten-2-oni 0,087±0,006c 0,028±0,002a b 0,023±0,005a b 0,019±0,004a 0,034±0,009b 0,145±0,017a 0,059±0,005 0,037±0,005 0,035±0,007 0,038±0,012 Asetaldehydi 0,28±0,069b 0,113±0,019 0,02±0,023 0,049±0,049 0,61±0,133c 0,292±0,083 0,137±0,039 - 0,044±0,045 0,363±0,303b Asetofenoni 0,043±0,038 0,048±0,048 0,037±0,021 0,07±0,032 0,075±0,076 0,088±0,009 0,057±0,033a 0,033±0,006a 0,101±0,07 0,195±0,09b Asetoiini 0,015±0,002c 0,006±0,001b - - - 0,022±0,008a 0,009±0,005 - - - Bentsaldehydi 0,035±0,003 0,022±0,001 0,052±0,016 0,037±0,011 0,1±0,099 0,034±0,004 0,039±0,003 0,054±0,005 0,044±0,015 0,103±0,04b Bentsoehapon metyyliesteri 0,11±0,015 0,004±0,003 0,128±0,018 0,121±0,017 0,261±0,122b 0,069±0,006a 0,107±0,019 0,131±0,008 0,186±0,058 0,241±0,088c Bentsoehappo 0,034±0,035 0,164±0,177 3,067±0,816 14,393±1,543 52,426±15,961 b - 0,437±0,04 6,449±3,045 18,474±10,20 2 50,865±19,579 b Bentsyylialkoholi 0,114±0,014 0,1±0,097 0,258±0,102 0,198±0,017 1,294±1,537 0,077±0,011a 0,35±0,074 0,838±0,202 0,621±0,33 1,32±0,607c D-limoneeni 0,02±0,001 0,013±0,006 0,012±0,001 0,013±0,005 0,012±0,001 0,023±0,002a 0,06±0,009ab 0,119±0,004b 0,13±0,018b 0,461±0,083c Dodekaanihapon metyyliesteri - - - - - - - 0,006±0,001 0,008±0,002b 0,003±0,006 Etikkahappo 0,068±0,005a b 0,032±0,019a 0,072±0,019a b 0,093±0,029b 0,072±0,02ab 0,115±0,029b 0,047±0,006a 0,09±0,02 0,058±0,015a 0,096±0,035 Etyyliasetaatti 0,217±0,034 0,17±0,006 0,007±0,002a 0,315±0,034c 0,208±0,024 0,27±0,035b 0,21±0,023 0,157±0,009a 0,244±0,026 0,196±0,01 Eukalyptoli 0,026±0,015 0,003±0,004 - 0,027±0,032 0,005±0,005 0,051±0,027 0,114±0,028 0,957±0,326 0,553±0,036 3,254±0,851b Fenetyylialkoholi 0,003±0,001 0,002±0,002 0,002±0,001 0,003±0,001 0,006±0,005 0,003±0,004 0,001±0,001 0,004±0,001 0,003±0,002 0,003±0,002 Heksaanihappo 0,189±0,023 0,101±0,093 0,41±0,109ab 0,622±0,252b 0,663±0,309b 0,205±0,034a 0,363±0,082 0,531±0,134 0,671±0,165 0,858±0,307c Heksanaali 2,723±0,718a b 1,301±0,146a 9,3±0,152c 3,799±0,533b 8,884±1,835c 4,069±0,184 3,487±1,121 20,607±0,286 b 6,483±1,055 20,066±2,814b Heksyyliasetaatti 0,025±0,005a b 0,006±0,002a 0,032±0,008a b 0,051±0,027b 0,027±0,009ab 0,02±0,006 0,001±0,001 0,01±0,004 0,02±0,023 0,017±0,007 44 Yhdiste Ås A1 Ås A2 Ås A3 Ås A4 Ås A5 Ås B1 Ås B2 Ås B3 Ås B4 Ås B5 Heptaanihappo 0,025±0,005 0,012±0,011 0,028±0,006 0,051±0,024 0,098±0,045b 0,028±0,005 0,037±0,005 0,039±0,012 0,08±0,028b 0,087±0,032b Kamfeeni 0,005±0,003 0,002±0,003 0,002±0 0,001±0,001 0,004±0,001 0,008±0,002a 0,076±0,016c 0,163±0,026c 0,106±0,019b 0,189±0,036c Karyofylleeni 0,026±0,027 0,002±0,001 0,001±0 0,015±0,025 0,001±0,001 0,011±0,007 - 0,592±1,021 0,819±0,82 0,004±0,001 Nonaanihappo 0,06±0,017 0,028±0,025 0,093±0,026a b 0,191±0,058b 0,547±0,118c 0,061±0,015 0,09±0,031 0,174±0,037 0,227±0,05 0,425±0,156b Nonanaali 0,037±0,002b 0,013±0,003a 0,023±0,003a b 0,019±0,007a b 0,056±0,018c 0,042±0,003b 0,023±0,001 0,028±0,004 0,024±0,006 0,044±0,01b Oktaanihappo 0,019±0,005 0,008±0,007 0,015±0,006 0,028±0,012 0,122±0,03b 0,021±0,005 0,027±0,008 0,025±0,005 0,051±0,019 0,066±0,028b Pentaanihappo 0,042±0,006a b 0,001±0,001a 0,148±0,055c d 0,195±0,051d 0,094±0,048bc 0,037±0,009a 0,069±0,022 0,169±0,035b 0,139±0,042 0,191±0,108b p-symeeni - 0,008±0,011 0,002±0 0,012±0,016 0,008±0,006 0,013±0,023a - 0,724±0,04b 0,58±0,044 1,068±0,635b Sitronelloni - - 0,002±0 - 0,008±0,006b - - - 0,003±0,002 0,002±0,002 Terpineeni-4-oli 0,005±0,002 0,005±0,003 0,002±0,001 0,029±0,049 0,004±0,001 0,046±0,013 0,003±0,001 3,044±1,191 3,078±0,155 3,102±3,082 Voihapon etyyliesteri - - 0,009±0,002 0,069±0,086 0,014±0,005 27,22±3,29 22,01±2,14 61,27±3,26 51,07±11,85 109,69±22,22 α-Pineeni - - 0,446±0,1b 0,025±0,025 0,031±0,024 - - 2,338±0,276b 1,818±0,365b 2,073±1,308b β-Pineeni 0,008±0,002 0,027±0,04 0,005±0,001 0,004±0,003 0,01±0,001 0,023±0,006 0,145±0,026 0,164±0,088 0,13±0,077 0,21±0,125 γ-Terpineeni 0,004±0,001 0,005±0,002 0,002±0 0,006±0,006 0,004±0,002 0,013±0,002a 0,182±0,026 0,258±0,017 0,243±0,14 0,521±0,101c Kokonaispitoisuus 21,46±1,20 14,62±0,26 29,02±1,54 34,93±0,79 82,91±21,25 27,22±3,29 22,011±2,14 61,27±3,26 51,07±11,85 109,69±22,22 Kirjaimet b ja c tarkoittavat yhdisteiden keskiarvojen olevan eri ryhmissä ja eroavan tilastollisesti toisistaan. Tulokset, joista puuttuu kirjain (eli a-ryhmä) ovat omassa tilastollisessa ryhmässänsä. Taulukossa kirjaimet b, c ja d kertovat näytteen poikkeavan tilastollisesti muista näytesarjan näytteistä. 45 TAULUKKO 7. Kypsyysastenäytteet B. SPME/GC-MS:llä mitattujen puolukan haihtuvien yhdisteiden pitoisuudet (µl/2 g) näytteittäin. Yhdiste Ås C1 Ås C2 Ås C3 Ås C4 Ås C5 Tr2 Tr3 Tr A4 Tr5 Asetaldehydi 0,299±0,052 0,303±0,06 0,321±0,034 0,733±0,155b 0,479±0,287ab 0,166±0,021 0,235±0,061 - 0,202±0,065 2-metyylipropanaali 0,25±0,029 0,105±0,113 0,079±0,081 0,116±0,117 0,069±0,069 0,101±0,014 0,106±0,11 - 0,14±0,083 Etyyliasetaatti 0,269±0,018 0,212±0,024 0,253±0,013 0,377±0,032b 0,232±0,029 0,181±0,007a 0,417±0,048c 0,34±0,018 0,37±0,028 2-metyylibutanaali 0,025±0 0,02±0,001a 0,023±0,003 0,034±0,002b 0,024±0,012 0,016±0,001a 0,037±0,004 0,105±0,01c 0,034±0,003b 3-metyylibutanaatti 0,025±0,008b 0,015±0,01ab 0,07±0,016d 0,048±0,013c - 0,019±0,003 0,031±0,009b 0,032±0,007b 0,016±0,003 2-etyylifuraani 0,32±0,077b 0,114±0,081 0,104±0,015 0,045±0,006 0,067±0,071 0,022±0,003 0,008±0,005ab - 0,041±0,024b α-Pineeni - 0,012±0,01 0,009±0,005 - 0,086±0,041b - 0,014±0,005 0,009±0,001 1,985±1,377b 1-penten-3-oni 0,417±0,086 0,399±0,09 0,447±0,055 0,278±0,056a 0,86±0,442b 0,167±0,009 0,214±0,049 0,137±0,03 0,316±0,051b 2-metyyli-3-buten-2-oli - - 0,019±0,006b - 0,006±0,006 Voihapon etyyliesteri 0,002±0,002a 0,003±0,002a 0,019±0,006b 0,018±0,004b 0,009±0,005a 0,006±0,001 0,008±0,001 0,013±0,002b 0,008±0,001 Kamfeeni 0,008±0,008 0,001±0 0,001±0 0,002±0 0,005±0,003 - - - 0,137±0,065b Heksanaali 4,693±1,607 5,8±1,111 10,65±1,878b 4,343±0,613 13,252±3,067b 1,048±0,078 0,873±0,144 1,271±0,402 2,224±0,135b β-Pineeni 0,059±0,078 0,003±0,001 0,004±0,002 0,004±0,001 0,028±0,02 0,001±0 0,002±0,001 - 0,181±0,069b (E)-2-pentenaali 0,114±0,017b 0,106±0,025b 0,074±0,013ab 0,039±0,007a 0,197±0,033c 0,023±0,002 0,028±0,006 0,028±0,006 0,04±0,004b 3-heksenaali 0,527±0,159 1,746±0,415b 1,64±0,232b 0,565±0,082 2,128±0,164b 0,163±0,028 0,093±0,021ab 0,299±0,162b 0,334±0,027b D-limoneeni 0,017±0,003 0,013±0,002 0,012±0,001 0,01±0,001 0,02±0,008b 0,009±0,001 0,011±0,002 0,009±0,001 0,153±0,047b 3-metyyli-1-butanoli - - - - 0,009±0,007 0,006±0,004 - - 0,105±0,106 Eukalyptoli 0,019±0,01 0,007±0,004 0,011±0,007 0,009±0,002 2,26±0,447b 0,006±0 0,008±0,005 0,008±0,005 0,748±0,183b 2-heksenaali 4,139±1,118c 3,105±0,911 1,719±0,385 0,512±0,062a - 0,334±0,045ab 0,157±0,037 0,47±0,265b 0,719±0,063c γ-Terpineeni 0,004±0 0,003±0 0,003±0 0,002±0 0,183±0,012c 0,002±0 0,002±0 0,002±0,001 0,159±0,045b 1-pentanoli 0,161±0,017 0,139±0,03b 0,121±0,018b 0,076±0,015a 0,034±0,043 0,042±0,006 0,055±0,003b 0,038±0,007 0,071±0,007c p-symeeni 0,008±0,01 0,002±0,001 - - 0,029±0,012 - - 0,004±0,001 0,274±0,284 Heksyyliasetaatti 0,036±0,003 0,033±0,02 0,029±0,007 0,046±0,018 - 0,023±0,011 0,02±0,025 0,143±0,117 0,353±0,121b Asetoiini 0,01±0,006 0,014±0,009 0,027±0,028 - 0,291±0,123 0,013±0,003 - - 0,03±0,03 46 Yhdiste Ås C1 Ås C2 Ås C3 Ås C4 Ås C5 Tr2 Tr3 Tr A4 Tr5 (Z)-3-heksenyyli asetaatti 1,126±0,055c 0,611±0,203b 0,293±0,078 0,235±0,063 0,059±0,014b 0,236±0,095 0,173±0,218 1,08±1,192 1,263±0,269 6-metyyli-5-hepten-2-oni 0,079±0,01c 0,057±0,005b 0,022±0,003 0,021±0,002 0,744±0,173b 0,017±0,003 0,019±0,001 0,021±0,002 0,028±0,004b 1-heksanoli 0,432±0,119 0,277±0,044 0,621±0,078b 0,317±0,083 0,108±0,045b 0,082±0,026 0,111±0,107 0,558±0,384ab 0,937±0,314b Nonanaali 0,036±0,003 0,024±0,002 0,027±0,006 0,029±0,007 0,103±0,024c 0,037±0,013 0,044±0,009 0,057±0,013 0,07±0,024 (E,E)-2,4-heksadienaali 0,047±0,012 0,085±0,016bc 0,06±0,012ab 0,042±0,009 0,196±0,092b 0,011±0,001ab 0,007±0,002 0,014±0,005b 0,017±0,002b (E)-2-heksen-1-oli 0,186±0,072b 0,086±0,017 0,146±0,039 0,038±0,017 0,087±0,032b 0,015±0,009 0,02±0,015 0,235±0,173 0,185±0,102 (E)-2-oktenaali 0,049±0,009 0,031±0,003 0,035±0,006 0,03±0,003 0,379±0,091 0,022±0,001 0,028±0,003 0,02±0,005 0,024±0,002 1-okten-3-oli 2,682±4,447 0,098±0,003 0,177±0,019 0,158±0,017 0,059±0,016 0,042±0,005 0,045±0,004 0,047±0,008 0,064±0,005b Etikkahappo 0,061±0,004 0,062±0,01 0,05±0,014 0,078±0,011 0,062±0,02b 0,024±0,026a 0,117±0,018 0,112±0,035 0,139±0,06 (E,E)-2,4-heptadienaali 0,098±0,011c 0,062±0,018b 0,026±0,004 0,025±0,002 0,187±0,132 0,015±0,002 0,019±0,001 0,017±0,002 0,027±0,002b Bentsaldehydi 0,089±0,024 0,061±0,023 0,076±0,011 0,058±0,008 0,007±0,005 0,101±0,023 0,116±0,015 0,083±0,016 0,115±0,016 Karyofylleeni 0,016±0,01b 0,003±0,003 - - 0,013±0,008b 0,001±0 0,001±0 0,001±0 0,001±0,001 Terpineeni-4-oli 0,006±0,001 0,002±0,001 0,001±0,001 0,002±0,001 0,023±0,004b 0,001±0 0,001±0,001 0,002±0,001 0,008±0,004b (E)-2-okten-1-oli 0,004±0,002 0,006±0,003 0,02±0,003b 0,007±0,002 1,032±0,897 0,004±0,001 0,005±0 0,005±0,001 0,007±0,001b Bentsoehapon metyyliesteri 0,12±0,024 0,119±0,029 0,124±0,028 0,187±0,013 0,57±0,205b 0,072±0,004 0,117±0,006b 0,088±0,014ab 0,102±0,023ab Asetofenoni 0,076±0,007 0,068±0,038 0,158±0,09 0,462±0,057b 4,375±1,585c 0,057±0,016 0,126±0,082ab 0,24±0,096b 0,118±0,021ab 2-metyylibutaanihappo 0,08±0,016 0,164±0,026 0,616±0,395 2,21±0,22b 0,066±0,037 0,318±0,081 1,146±0,575 6,101±0,872b 5,544±1,482b Bentsoehapon etyyliesteri - - - - - 0,003±0,001 - - 0,264±0,093b Pentaanihappo 0,091±0,014 0,098±0,029 0,114±0,04 0,123±0,031 - 0,042±0,027 0,236±0,063c 0,132±0,085b - Sitronelloni - - - - - 0,001±0,001 - 0,02±0,032 - Dodekaanihapon metyyliesteri 0,003±0 - 0,004±0,006 0±0 0,624±0,334 - - - - Heksaanihappo 0,519±0,13 0,377±0,12 0,853±0,222 0,57±0,121 1,008±0,756b 0,199±0,073 0,79±0,307b 0,478±0,157ab 1,527±0,348c Bentsyylialkoholi 0,023±0,004 0,288±0,119ab 0,188±0,054 0,309±0,05ab 0,007±0,003b 0,126±0,006 0,363±0,022 0,724±0,077b 0,66±0,28b Fenetyylialkoholi 0,002±0,001 0,002±0 0,002±0 0,005±0,001ab 0,089±0,048 0,002±0,001 0,029±0,046 0,002±0 0,002±0,001 Heptaanihappo 0,03±0,009 0,036±0,017 0,099±0,054 0,089±0,019 0,139±0,05b 0,032±0,01 0,033±0,02 0,058±0,012 0,146±0,043b Oktaanihappo 0,016±0,005 0,022±0,012 0,079±0,052ab 0,073±0,017ab 0,671±0,245b 0,041±0,025 0,036±0,018 0,043±0,008 0,084±0,032 47 Yhdiste Ås C1 Ås C2 Ås C3 Ås C4 Ås C5 Tr2 Tr3 Tr A4 Tr5 Nonaanihappo 0,04±0,024 0,099±0,057 0,262±0,132 0,499±0,066b 79,081±14,483c 0,121±0,041 0,186±0,053 0,316±0,068b 0,331±0,087b Bentsoehappo 0,142±0,031 1,299±0,671 12,398±10,556 59,307±2,759b 120,639±19,325 3,261±1,496 8,599±2,985ab 19,149±10,08bc 23,408±6,93c Kokonaispitoisuus 27,606±4,505 26,261±2,67 42,167±12,356 82,337±2,703 120,639±19,325 17,375±1,979 25,014±2,473 42,834±10,173 53,926±9,957 Kirjaimet b ja c tarkoittavat yhdisteiden keskiarvojen olevan eri ryhmissä ja eroavan tilastollisesti toisistaan. Tulokset, joista puuttuu kirjain (eli a-ryhmä) ovat omassa tilastollisessa ryhmässänsä. Tilastollinen analyysi suoritettu kolmen näytteen sarjassa (Tr 9A-9C ja As Tr 15A-C). 48 4 Tulosten pohdinta Marjan haihtuvien yhdisteiden pitoisuuksiin vaikuttavat olennaisesti marjan kypsyysaste: haihtuvien yhdisteiden kokonaiskonsentraatio kasvaa marjan kypsyessä. Lisäksi pitoisuuksiin vaikuttavat lajike, käsittely poiminnan jälkeen sekä kasvu- että säilytysolosuhteet. Muun muassa mansikassa haihtuvien yhdisteiden kokonaispitoisuus oli 100 kertaa suurempi täysin kypsissä punaisissa marjoissa kuin vaaleanpunaisissa tai vihreänvalkoisissa marjoissa. (Forney, 2001). Kypsymisen vaikutus haihtuvien yhdisteiden kokonaispitoisuuteen on esitetty kuvassa 5. Eniten vaihtelua kokonaispitoisuuksien välillä esiintyi raa’an valkoisessa marjassa näytteissä Ås B1 ja Ås C1 sekä raa’an vihreässä Tr2 marjassa. Muun muassa Rusen ja muiden (2012) tutkimuksessa villikarpalo sisälsi runsaammin heksanaalia kuin viljelty variantti. Lisäksi kukkaisen tuoksuista α- terpineolia esiintyi vähemmän villeissä kuin viljellyissä marjoissa. Fytotroninäytteistä käy ilmi, että kasvin fenotyyppi ja kasvupaikka vaikuttavat yhdisteiden muodostumiseen, sillä Åsin marjat sisälsivät huomattavasti enemmän vihreitä aldehydejä (heksanaali ja 2-heksenaali) kuin Tromssan marjat. Marjojen pakastamisella on myös osansa yhdisteiden muodostumisessa. Jungin ja muiden (2017) tutkimuksesta käy ilmi, että linoli- ja oleiinihapon hapettumisen myötä heksanaalin, dekanaalin ja nonanaalin pitoisuus nousi pakastuksen aikana. Tässä tutkimuksessa käytetyt marjat olivat pakastettuja. Marsol-Vall ja muut (2018) osoittivat pohjoisemmalla leveyspiirillä kasvaneiden mustaherukoiden sisältävän runsaammin haihtuvia yhdisteitä kuin etelämmässä kasvaneet. Kuitenkin tässä tutkimuksessa tulokset ovat päinvastaiset. Kyse on eri lajista, mutta eteläisemmällä leveyspiirillä kasvaneissa puolukoissa haihtuvien yhdisteiden määrä oli keskimääräisesti suurempi. Bentsoehappoa löytyi runsaasti Tromssan 15 asteen fytotroninäytteistä, mikä nostaa haihtuvien yhdisteiden kokonaispitoisuutta melkoisesti. 2-metyylibutaanihappo osoittautui sekä Anjoun ja muiden (1967) että Viljakaisen ja muiden (2010) tutkimuksessa runsaspitoiseksi ja vahvasti puolukan 49 ominaistuoksuun vaikuttavaksi yhdisteeksi. Marjan kypsyessä tämän yhdisteen pitoisuus kasvoi kaksinkertaisesti. Tässä tutkimuksessa fytotroninäytteistä ei kuitenkaan tunnistettu 2-metyylibutaanihappoa. 2-metyylibutaanihappoa löytyi vaihtelevasti kypsyysastenäytteistä, runsaimmin sitä tunnistettiin punaisista ja tummanpunaisista marjoista. 50 5 Yhteenveto Marjojen haihtuvien yhdisteiden tutkimus on keskittynyt muihin marjoihin kuin puolukkaan osaksi puolukan haastavien aistinvaraisten ominaisuuksien takia. Puolukka on kuitenkin ravitsemuksellisilta ominaisuuksiltaan yhtä hyvä kuin mustikka tai karpalo. Haihtuvien yhdisteiden kartoitus puolukasta auttaa ymmärtämään sen aistinvaraisia ominaisuuksia ja antaa mahdollisuuksia muokata niitä eri tarpeisiin. Tutkimuksen tavoitteena oli kartoittaa puolukan haihtuvia yhdisteitä eri sijainnissa ja lämpötilassa kasvaneista sekä eri kypsyysasteen marjoista. 9 ja 15 asteessa kontrolloidussa kasvuympäristössä kasvaneita marjoja käytettiin selvittämään lämpötilan vaikutusta haihtuviin yhdisteisiin. Kypsyysasteen vaikutuksen tutkintaan tarkoitettuja näytteitä oli viittä eri luokkaa: raaka, vihertävä, punertava, kypsä ja ylikypsä. Marjan kypsyysaste vaikutti erityisesti bentsoehapon määrään, mikä nousi huomattavasti marjan kypsymisen edetessä. Tämä osaltaan vaikutti myös marjojen kokonaishaihtuvien yhdisteiden pitoisuuden korkeuteen kypsissä ja ylikypsissä marjoissa. Lisäksi kypsyminen vaikutti marjan painoon: kypsät ja ylikypsät marjat olivat painavampia kuin vihreät ja punertavat. Lämpötilan vaikutus fytotroninäytteissä näkyi yksittäisissä haihtuvissa yhdisteissä, mutta Åssan näytteissä oli selkeästi enemmän vihreän tuoksuisia yhdisteitä. Åssa ja Tromssassa kerätyt marjat esivalmisteltiin ja analysoitiin hyödyntäen SPME/GC-MS -menetelmää. Menetelmänä SPME-GC/MS on suoraviivainen ja näytteiden valmistelu on nopeaa sekä yksinkertaista. Se on myös herkkä ja kykenee tunnistamaan pieniäkin pitoisuuksia. Tähän tutkimustyöhön se sopi erittäin hyvin, sillä suuren näytemäärän käsittely oli nopeaa ja vaivatonta. Yhdisteiden kvantitointi ja tunnistaminen onnistui hyvin NIST:n referenssikirjaston avulla. Massaspektrometrin resoluutio oli myös riittävä samoihin aikoihin eluoituvien yhdisteiden tunnistamiseen toisistaan. Fytotroninäytteiden yhdisteiden tunnistuksen olisi voinut suorittaa tarkemmin, sillä siinä ei tullut otettua huomioon ihan pienimpiä retentiopiikkejä. Molempien näytekategorioiden kohdalla olisi pitänyt käyttää samanlaista piikin poissulkemiskriteeriä: 51 yhdistetaulukoista huomaa, että kypsyysastenäytteissä on erittäin pieniä pitoisuuksia ja fytotroninäytteissä ei vähemmän. Tutkimuksessa käytetty menetelmä SPME-GC/MS on toimiva, mutta sillä on rajoitteensa, kun halutaan kvantitatiivisia tuloksia. Puolukan haihtuvien yhdisteiden tutkimuksen kehittämisen kannalta olisi tärkeää pystyä määrittämään yhdisteiden pitoisuuksia tarkasti. Vasta tämän jälkeen voi miettiä puolukan tuoksulle ominaisia hallitsevia ja vähäisiä yhdisteitä. Näiden yhdisteiden tunnistaminen tarkoittaisi, että puolukan tuoksuprofiilia voitaisiin muokata ja näin kehittää yleisesti miellyttävämpään suuntaan. Tuoksuvat yhdisteet vaikuttavat myös koettuun makuaistimukseen, joten haihtuvien yhdisteiden kautta voidaan vaikuttaa myös makuun. Tutkimus on onnistuneesti kartoittanut puolukan haihtuvia yhdisteitä ja niihin vaikuttavia tekijöitä. Mikäli puolukkaa halutaan viljellä, on näistä tuloksista hyötyä, kun halutaan lisätä tai laskea tietyn VOC:n pitoisuutta. Marjastaja saattaa myös hyötyä tämän tutkimuksen tuloksista, sillä marjoja voidaan kerätä tietynlaiselta kasvualueelta tietyn kypsyisenä. Marjan kypsyysaste onkin hyvä ottaa huomioon, sillä kypsyminen lisää happaman bentsoehapon määrää. Kasvupaikan sijainti sekä fenotyyppi vaikuttaa olennaisesti marjan tuoksuprofiiliin. Kasvupaikan sijainnin valinnalla on tärkeä rooli puolukan miellyttävyyden kehittämisessä. Oleellista olisi kuitenkin selvittää, millä tavalla puolukassa esiintyvät haihtuvat yhdisteet vaikuttavat sen ominaistuoksuun. Kuten johdannossa esiteltiin, yhdisteen suuri pitoisuus ei välttämättä tarkoita, että yhdiste myös tuoksuu voimakkaasti. 52 6 Lähteet Alfaddagh, A., Martin, S., Leucker, T., Michos, E., Blaha, M., Lowenstein, C., Jones, S. & Toth, P. (2020) Inflammation and cardiovascular disease: From mechanisms to therapeutics. American journal of preventive cardiology 4:100130. Anjou, K., & Sydow, E. (1967) The Aroma of Cranberries. I. Vaccinium vitis-idaea L. Acta Chemica Scandinavica, 21:945–952. Beaulieu, J. & Lea, J. (2003) Volatile and quality changes in fresh-cut mangos prepared from firm-ripe and soft-ripe fruit, stored in clamshell containers and passive MAP. Postharvest Biology and Technology 30(1):15–28. Beaulieu, J., Stein-Chisholm, R. & Boykin, D. (2014) Qualitative Analysis of Volatiles in Rabbiteye Blueberry Cultivars at Various Maturities Using Rapid Solid-phase Microextraction. Journal of the American Society for Horticultural Science, 139(2):167–177 Beema Shafreen, R., Dymerski, T., Namiesnik, J., Jastrezebski, Z., Vearasilp, S. & Gorinstein, S. (2017) Interaction of human serum albumin with volatiles and polyphenols from some berries. Food Hydrocolloids, 72:297–303. Berenbaum, M. R. (1995) The chemistry of defense: theory and practice. Proceedings of the National Academy of Sciences, 92(1):2–8. Brown, E., Nitecki, S., Pereira-Caro, G., Mcdougall, G., Stewart, D., Rowland, I., Crozier, A. & Gill, C. (2014) Comparison of in vivo and in vitro digestion on polyphenol composition in lingonberries: Potential impact on colonic health. BioFactors 40(6):611–623 Brückner, B. & Wyllie, S. G. (2008) Fruit and vegetable flavour: recent advances and future prospects. p. 317. Bujor, O., Ginies, C., Popa V. & Dufour C. (2018) Phenolic compounds and antioxidant activity of lingonberry (Vaccinium vitis-idaea L.) leaf, stem and fruit at different harvest periods. Food Chemistry 252:356–365 Chmiel, T., Kupska, M., Wardencki, W. & Namiesnik, J. (2017) Application of response surface methodology to optimize solid-phase microextraction procedure for chromatographic determination of aroma-active monoterpenes in berries. Food Chemistry 221:1041–1056 53 Christensen, L. P. & Pedersen, H. L. (2006) Varietal differences in the aroma compound profile of blackcurrant berries. Developments in Food Science 43(C):257–260 Davidson, E., Zimmerman, B., Jungfer, E. & Chrubasik-Hausmann, S. (2014) Prevention of Urinary Tract Infections with Vaccinium Products. Phytotherapy Research 28(3):465–470 Du, X., Olmstead, J. & Rouseff, R. (2012) Comparison of Fast Gas Chomatography–Surface Acoustic Wave (FGC-SAW) Detection and GC-MS for Characterizing Blueberry Cultivars and Maturity. Journal of Agricultural and Food Chemistry 60(20):5099–5106 Du, X. & Rouseff, R. (2014) Aroma Active Volatiles in Four Southern Highbush Blueberry Cultivars Determined by Gas Chromatography–Olfactometry (GC-O) and Gas Chromatography–Mass Spectrometry (GC-MS). Journal of Agricultural and Food Chemistry 62(20):4537–4543 Dudareva, N., Klempien, A., Muhlemann, J. & Kaplan, I. (2013) Biosynthesis, function and metabolic engineering of plant volatile organic compounds. New Phytologist 198(1):16–32 Dymerski, T., Namiesnik, J., Vearasilp, K., Arancibia-Avila, P., Toledo, F., Weisz, M., Katrich, E. & Gorinstein, S. (2015) Comprehensive two-dimensional gas chromatography and three-dimensional fluorometry for detection of volatile and bioactive substances in some berries. Talanta 134:460–467 Eichholz, I., Huyskens-Keil, S., Keller, A., Ulrich, D., Kroh, L. & Rohn, S. (2011) UV-B-induced changes of volatile metabolites and phenolic compounds in blueberries (Vaccinium corymbosum L.). Food Chemistry 126(1):60–64 Elmore, J. S. (2015) Aroma extract analysis, Flavour Development, Analysis and Perception in Food and Beverages. Food Science, Technology and Nutrition 408- 417 Fariña, L., Boido, E., Carrau, F., Versini, G. & Dellacassa, E. (2005) Terpene Compounds as Possible Precursors of 1,8-Cineole in Red Grapes and Wines. Journal of Agricultural and Food Chemistry 53(5):1633–1636 Farneti, B., Khomenko, I., Grisenti, M., Ajelli, M., Betta, E., Algarra, A. A., Cappellin, L., Aprea, E., Gasperi, F., Biasioli, F. & Giongo, L. (2017) Exploring Blueberry Aroma Complexity by Chromatographic and Direct-Injection Spectrometric Techniques. Frontiers in Plant Science 0:617 Forney, C. F. (2001) Horticultural and other Factors Affecting Aroma Volatile Composition of Small Fruit. HortTechnology 11(4):529–538 54 Gilbert, J., Guthart, M., Gezan, S., Pisaroglo de Carvalho, M., Schwieterman, M., Colquhoun, T., Bartoshuk, L., Sims, C., Clark, D. & Olmstead, J. (2015) Identifying Breeding Priorities for Blueberry Flavor Using Biochemical, Sensory, and Genotype by Environment Analyses. PLoS ONE 10(9) Harb, J., Bisharat, R. & Streif, J. (2008) Changes in volatile constituents of blackcurrants (Ribes nigrum L. cv. “Titania”) following controlled atmosphere storage. Postharvest Biology and Technology 47(3):271–279 Hasin-Brumshtein, Y., Lancet, D. & Olender, T. (2009) Human olfaction: from genomic variation to phenotypic diversity. Trends in Genetics 25(4):178–184 Hausch, B. J., Lorjaroenphon, Y. & Cadwallader, K. R. (2015) Flavor chemistry of lemon-lime carbonated beverages. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 63(1):112–119 Hirvi, T& Honkanen, E. (1983) The aroma of blueberries. Journal of the Science of Food and Agriculture 34(9):992–996 Hirvi, T., Honkanen, E. & Pyysalo, T. (1981) The aroma of cranberries. Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und Forschung 1981 172:5, 172(5):365–367 Hjalmarsson, I. & Ortiz, R. (2008) Effect of genotype and environment on vegetative and reproductive characteristics of lingonberry (Vaccinium vitis‐idaea L.). Acta Agriculturae Scandinavica, 48(4):255–262 Horvat, R., Schlotzhauer, W., Chortyk, O. & Payne, J. (2011) Comparison of Volatile Compounds from Rabbiteye Blueberry (Vaccinium ashei) and Deerberry (V. stamineum) during Maturation. Journal of Essential Oil Research 8(6):645– 648 Hui, Y., Chen, F., Nollet, L., Guiné, R., Le Quéré, J., Martín-Belloso, O., Mínguez- Mosquera, M., Paliyath, G., Pessoa, F., Sidhu, J., Sinha, N. & Stanfield, P. (2010) Handbook of Fruit and Vegetable Flavors. Handbook of Fruit and Vegetable Flavors 25-155 Jung, K., Fastowski, O., Poplacean, I. & Engel, K. (2017) Analysis and Sensory Evaluation of Volatile Constituents of Fresh Blackcurrant (Ribes nigrum L.) Fruits. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 65(43):9475–9487 Jung, K., Fastowski, O. & Engel, K.-H. (2016) Occurrence of 4-methoxy-2-methyl- 2-butanethiol in blackcurrant (Ribes nigrum L.) berries. Flavour and Fragrance Journal, 31(6):438–441 55 Klavins, L., Mezulis, M., Nikolajeva, V. & Klavins, M. (2021) Composition, sun protective and antimicrobial activity of lipophilic bilberry (Vaccinium myrtillus L.) and lingonberry (Vaccinium vitis-idaea L.) extract fractions. LWT, 138:110784 Knudsen, J., Tollsten, L. & Bergström, L. (1993) Floral scents—a checklist of volatile compounds isolated by head-space techniques. Phytochemistry, 33(2):253–280 Kowalska, K. (2021) Lingonberry (Vaccinium vitis-idaea L.) Fruit as a Source of Bioactive Compounds with Health-Promoting Effects—A Review. International Journal of Molecular Sciences, 22(10) Laaksonen, O., Knaapila, A., Niva, T., Deegan, K. & Sandell, M. (2016) Sensory properties and consumer characteristics contributing to liking of berries. Food Quality and Preference, 53:117–126 Lo, M. et al. (2004) Characterization of an Ultraviolet B-Induced Lipase in Arabidopsis. Plant Physiology, 135(2):947–958 Loreto, F., Taylor, C., Wang, L., Nowack, L., Wang, T. & Thompson, J. (2014) Volatile isoprenoids and their importance for protection against environmental constraints in the Mediterranean area. Environmental and Experimental Botany, 103:99–106 Luo, M. et al. (2021) Insights into profiling of volatile ester and LOX-pathway related gene families accompanying post-harvest ripening of “Nanguo” pears. Food Chemistry, 335:127665 Matthews, B., Wickland, R. & Bhar, D. (1970) Relationship of Stage of Ripeness to Composition and Keeping Quality Highbush Blueberries. Journal of the American Society for Horticultural Science, 95(2):239–242 Mane, C., Loonis, M., Juhel, C., Dufour, C. & Malien-Aubert, C. (2011) Food Grade Lingonberry Extract: Polyphenolic Composition and In Vivo Protective Effect against Oxidative Stress. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 59(7):3330–3339 Marsol-Vall, A., Kelanne, N., Nuutinen, A., Yang, B. & Laaksonen, O. (2021) Influence of enzymatic treatment on the chemical composition of lingonberry (Vaccinium vitis-idaea) juice. Food Chemistry, 339:128052 Mazurek, B., Ryszko, U., Kostrzewa, D., Chmiel, M. & Kondracka, M. (2022) Brief characteristics of oxidative stability, fatty acids and metal content in selected berry seed extracts obtained by the SFE technique and used as potential source of nutrients. Food Chemistry, 367:130752 56 McDougall, G., Ross, H., Ikeji, M. & Stewart, D. (2008) Berry Extracts Exert Different Antiproliferative Effects against Cervical and Colon Cancer Cells Grown in Vitro. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 56(9): 3016–3023 Morales, M., Callejón, R., Ubeda, C., Guerreiro, A., Gago, C., Miguel, M. & Antunes, M. (2014) Effect of storage time at low temperature on the volatile compound composition of Sevillana and Maravilla raspberries. Postharvest Biology and Technology, 96: 128–134 Niimura, Y. (2012) Olfactory Receptor Multigene Family in Vertebrates: From the Viewpoint of Evolutionary Genomics. Current Genomics, 13(2):103 Nishida, N., Tamotsu, S., Nagata, N., Saito, C. & Sakai, A. (2005) Allelopathic effects of volatile monoterpenoids produced by Salvia leucophylla: Inhibition of cell proliferation and DNA synthesis in the root apical meristem of Brassica campestris seedlings. Journal of Chemical Ecology, 31(5):1187–1203 Pagès-Hélary, S., Dujourdy, L. & Cayot, N. (2022) Flavor compounds in blackcurrant berries: Multivariate analysis of datasets obtained with natural variability and various experimental parameters. LWT, 153:112425 Pateraki, I. & Kanellis, A. K. (2010) Stress and developmental responses of terpenoid biosynthetic genes in Cistus creticus subsp. creticus. Plant Cell Reports, 29(6):629–641 Penhallegon, R. (2006) Lingonberry Production Guide for the Pacific Northwest. PNW 583-E Pérez, A., Rios, J., Sanz, C. & Olías, J. (2002) Aroma components and free amino acids in strawberry variety Chandler during ripening. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 40(11):2232–2235 Pico, J., Gerbrandt, E. & Castellarin, S. (2022) Optimization and validation of a SPME-GC/MS method for the determination of volatile compounds, including enantiomeric analysis, in northern highbush blueberries (Vaccinium corymbosum L.). Food Chemistry, 368:130812 Popescu, I., Codrici, E., Mihai, S., Lintraru, C., Neagu, M. & Tanase, C. (2021) In vitro assessment of the cytotoxicity and anti-inflammatory properties of a novel dietary supplement. Experimental and Therapeutic Medicine, 22(4):1–10 Ribeaucourt, D., Bissaro, B., Lambert, F., Lafond, M. & Berrin, J. (2021) Biocatalytic oxidation of fatty alcohols into aldehydes for the flavors and fragrances industry. Biotechnology Advances, 1:107787 57 Sater, H., Bizzio, L., Tieman, D. & Muñoz, P. (2020) A Review of the Fruit Volatiles Found in Blueberry and Other Vaccinium Species. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 68(21):5777–5786 Singh, H., Batish, D., Kaur, S., Arora, K. & Kohli, R. (2006) α-Pinene Inhibits Growth and Induces Oxidative Stress in Roots. Annals of Botany, 98(6):1261– 1269 Small, D. (2012) Flavor is in the brain. Physiology & Behavior, 107(4):540–552 Tetali, S. (2019) Terpenes and isoprenoids: a wealth of compounds for global use. Planta, 249(1):1–8 The Good Scents Company, TGSC Information System 1980-2021 [sähköinen lähde] Viitattu 7.9.2022 http://www.thegoodscentscompany.com/ Tholl, D. (2006) Terpene synthases and the regulation, diversity and biological roles of terpene metabolism. Current Opinion in Plant Biology, 9(3):297–304 Turtiainen, M., Salo, K. & Saastamoinen, O. (2011) Variations of yield and utilisation of bilberries (Vaccinium myrtillus L.) and cowberries (V. vitis-idaea L.) in Finland. Silva Fennica, 45(2):237–251 Uleberg, E., Rohloff, J., Jaakola, L., Trôst, K., Junttila, O., Häggman, H. & Martinussen, I. (2012) Effects of Temperature and Photoperiod on Yield and Chemical Composition of Northern and Southern Clones of Bilberry (Vaccinium myrtillus L.). Journal of Agricultural and Food Chemistry, 60(42):10406–10414 Vavoura, M., Badeka, A., Kontakos, S. & Kontominas, M. (2015) Characterization of Four Popular Sweet Cherry Cultivars Grown in Greece by Volatile Compound and Physicochemical Data Analysis and Sensory Evaluation. Molecules 2015, 20(2):1922–1940 Viljakainen, S., Visti, A. & Laakso, S. (2010) Concentrations of Organic Acids and Soluble Sugars in Juices from Nordic Berries. Acta Agriculturae Scandinavica, Section B – Soil and Plant Science 52(2):101–109 Viljanen, K., Heiniö, R-L., Juvonen, R., Kössö, T. & Puupponen-Pimiä, R. (2014) Relation of sensory perception with chemical composition of bioprocessed lingonberry. Food Chemistry, 157:148–156 Vilkickyte, G., Motiekaityte, V., Vainoriene, R. & Raudone, L. (2022) Promising cultivars and intraspecific taxa of lingonberries (Vaccinium vitis-idaea L.): Profiling of phenolics and triterpenoids. Journal of Food Composition and Analysis 114:104796 58 Wang, L., Peng, A. & Proctor, A. (1990) Varietal difference in lipid content and fatty acid composition of highbush blueberries. Journal of the American Oil Chemists’ Society, 67(8):499–502 Yahya, A., Anderson, W. & Moo-Young, M. (1998) Ester synthesis in lipase- catalyzed reactions. Enzyme and Microbial Technology, 23(7–8):438–450 Yamashita, I., Ino, K., Nemoto, Y. & Yoshikawa, S. (1977) Studies on flavor development in strawberries. 4. Biosynthesis of volatile alcohol and esters from aldehyde during ripening. J. Agric. Food Chem. 25(5):1165–1168 Yang, W., Chen, X., Li, Y., Guo, S., Wang, Z. & Yu, X. (2020) Advances in Pharmacological Activities of Terpenoids. Natural Product Communications 15(3):1–13 Zhang, Z., Zhou, Q., Huangfu, G., Wu, Y. & Zhang, J. (2019) Anthocyanin extracts of lingonberry (Vaccinium vitis-idaea L.) attenuate serum lipids and cholesterol metabolism in HCD-induced hypercholesterolaemic male mice. International Journal of Food Science & Technology, 54(5):1576–1587 Zhu, J., Chen, F., Wang, L., Niu, Y., Chen, H., Wang, H. & Xiao, Z. (2016) Characterization of the Key Aroma Volatile Compounds in Cranberry (Vaccinium macrocarpon Ait.) Using Gas Chromatography− Olfactometry (GC-O) and Odor Activity Value (OAV). J. Agric. Food Chem 64:24:4990-4999