Pieneläin PET/TT-analysointiohjelmiston päivittäminen ja validointi Pro Gradu Turun yliopisto Fysiikka 2025 Fil. yo. Lenni Sibelius Tarkastajat: Dos. Matti Murtomaa FT Maria Jaakkola Turun yliopiston laatujärjestelmän mukaisesti tämän julkaisun alkuperäisyys on tar- kastettu Turnitin OriginalityCheck-järjestelmällä TURUN YLIOPISTO Fysiikan ja tähtitieteen laitos Sibelius, Lenni Pieneläin PET/TT-analysointiohjelmiston päivittäminen ja vali- dointi Pro Gradu, 47 s. Fysiikka Huhtikuu 2025 SAPP-ohjelmisto (eng. Small Animal Brain PET/CT-pipeline) kehitettiin vuonna 2018 automatisoimaan pieneläinten positroniemissiotomografia- (PET, eng. Posit- ron Emission Tomography) ja tietokonekerroskuvien (TT, eng. Computed Tomo- graphy scan) käsittely. Tässä opinnäytetyössä SAPP-ohjelmisto päivitettiin käyt- tökelpoiseksi ja käsittelyä validoitiin hiiri- ja rottakuvilla. SAPP koostuu kolmesta moduulista, joista ensimmäinen esikäsittelee kuvat eli muun muassa rajaa eläin- ten päät, kohdistaa TT- ja PET-kuvat sekä sovittaa atlakset, joiden ROI-alueista (eng. Region of Interest) tehdään toisessa moduulissa analyysit. Kolmas moduu- li tekee parametrisen PET-kuvan, joka mahdollistaa kuvankäsittelyn kehittämisen tilavuusalkio-pohjaiseksi. Ensimmäisestä moduulista korjattiin laaduntarkastustiedosto, joka kirjoitti itsen- sä päälle ja sisälsi asetteluongelmia. Ensimmäinen moduuli päivitettiin toimimaan sekä Windows- että Linux-käyttöjärjestelmällä, ja sen rajausalgoritmia päivitettiin rajaamaan kuvauslaitteiston ympäröivät osat pois kuvasta. SAPP-ohjelmistoa va- lidoitiin analysoimalla sillä hiiren ja rotan aivoalueita. Saatuja semikvantitatiivisia radioaktiivisuuden mittausarvoja verrattiin prekliinisen tutkijan manuaalisesti piir- tämiin ROI-alueisiin, joista analysoitiin samat aivoalueet. Molemmissa tapauksissa SAPP-ohjelmiston laskemat arvot seurasivat hyvin manuaalisia arvoja. Hiiren ta- pauksessa SAPP-ohjelmiston tekemät arvot olivat usein hieman matalampia pien- ten ROI-alueiden takia. Rotalla SAPP-ohjelmiston saamat arvot seurasivat hiirtä paremmin manuaalisia arvoja muutamaa poikkeusta lukuun ottamatta. SAPP saa- tiin toimimaan ja sen kehittäminen vastaamaan tutkijoiden toiveita voi jatkua. Asiasanat: SAPP, koe-eläin, automatisointi Sisällys Johdanto 1 1 Teoriaa ja taustaa 2 1.1 Lääketieteellinen kuvantaminen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1.1.1 Positroniemissiotomografia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 1.1.2 Tietokonekerroskuvaus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 1.1.3 Koe-eläinten käyttö PET- ja TT-kuvantamisessa . . . . . . . . 11 1.2 Kuvien analysointi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 1.2.1 Neuroanatominen analyysi atlaksilla . . . . . . . . . . . . . . 12 1.2.2 ROI-analyysi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 2 Menetelmät 14 2.1 Data . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 2.2 Toteutusalusta . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 2.2.1 MATLAB . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 2.2.2 SPM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 2.2.3 Carimas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 2.3 SAPP-ohjelmiston rakenne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 2.3.1 Moduuli 1: Kuvien esikäsittely . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 2.3.1.1 Rajaus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 2.3.1.2 TT- ja PET-kuvien kohdistaminen . . . . . . . . . . 22 2.3.1.3 Atlas sovitus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 2.3.1.4 Aivojen avaruudellinen normalisaatio . . . . . . . . . 26 2.3.1.5 Esikäsittelyn virheiden määristys ja manuaalien kor- jaus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 2.3.2 Moduuli 2: Kuvien analysointi . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 2.3.3 Moduuli 3: Parametriset PET-kuvat . . . . . . . . . . . . . . 28 2.3.4 Graafinen käyttöliittymä . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28 3 Tulokset 29 3.1 SAPP-ohjelmiston korjaus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 3.1.1 Laaduntarkastustiedosto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 3.1.2 Käyttöjärjestelmä . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 3.1.3 Rajaus ja x-koordinaatin määrittäminen algoritmilla . . . . . 30 3.2 Validointi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35 3.2.1 Hiiri . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36 3.2.2 Rotta . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39 4 Pohdinta 42 5 Yhteenveto ja johtopäätökset 44 6 Kiitokset 45 1Johdanto Eläinkokeet ovat iso osa lääketieteen kehitystä, joten niiden laatu on eettisten ky- symysten rinnalla tärkeää. SAPP-ohjelmisto (eng. Small Animal Brain PET/CT- pipeline) on kehitetty automatisoimaan pieneläinten positroniemissiotomografia- (PET, eng. Positron Emission Tomography) ja tietokonekerroskuvien (TT, eng. Computed Tomography scan) käsittelyä. PET-kuvat visualisoivat käytetyn merkkiaineen mu- kaan erilaisia biologisia prosesseja ja TT-kuvat puolestaan anatomisia rakenteita. Yleensä molemmat kuvat otetaan samasta kohdasta ja yhdistetään, jolloin nähdään, mitä merkkiaineelle tapahtuu ja missä. SAPP-ohjelmiston on kehittänyt vuonna 2018 Turun PET-keskukselle Pro gradu -tutkielmana Diana Bocancea. [1] SAPP laskee otetusta kuvasta automaattisesti kullekin aivoalueelle erikseen PET- merkkiaineen kertymisen ajan funktiona. Se nopeuttaa tutkimusaineiston käsittelyä ja analysointia, vähentää inhimillisiä virheitä ja tekee tuloksista vertailtavia eri tut- kijoiden välillä, koska tutkijan ei tarvitse esimerkiksi manuaalisesti piirtää aivoaluei- ta, vaan kaikki kuvat käsitellään samalla tavalla. Aineiston käsittelyä standardisoidaan SAPP-ohjelmistolla niin, että kokemukses- ta riippumatta tutkijat pystyvät käyttämään sitä käyttöliittymän kautta ja saamaan vertailtavia tuloksia. Algoritmi rajaa ja analysoi aina samalla tavalla, mutta se voi myös epäonnistua, jos eläimen pää ei esimerkiksi ole aivan oletetussa asennossa tai koodi ei toimi oikein. Tutkijan on edelleen siis tutkittava tuloksia kriittisesti ja tie- dettävä, millaisia tulosten pitäisi todennäköisesti olla. Alkuperäisessä validoinnissa [1] rotilla SAPP onnistuu noin 75% ajasta analyysissä, ja hiirillä hieman paremmin. SAPP on kehitetty toimimaan MATLAB-ohjelmistossa [2] ja se automatisoi ku- van esikäsittelyn ja atlaspohjaisen aivoalueiden analyysin. Atlakset ovat kartastoja aivoista, joissa on eroteltu eri aivoalueet. Niissä on usein käytetty montaa aivokuvaa, joista on otettu keskiarvo yksittäisten eroavaisuuksien suodattamiseksi. TT-kuva an- 2taa SAPP-ohjelmistolle anatomisen pohjan, johon voidaan asettaa aivoalueiden at- lakset, jotta tiedetään, missä on PET:in mukaan aktiivisuutta. Kuvat pitää ensin kuitenkin orientoida atlasten mukaan, jotta molemmat ovat samassa asennossa, kun kuvat analysoidaan. Jyrsijöillä aivot ovat keskenään rakenteeltaan samanlaisia, joten niitä on mahdollista vertailla keskenään lajinsisäisesti. SAPP-ohjelmistossa on yk- sinkertainen graafinen käyttöliittymä, jotta tutkija voi käyttää sitä hakemalla oikean tiedoston tietokoneelta ja valitsemalla halutut parametrit. SAPP on ollut tärkeä työkalu prekliinisessä tutkimuksessa, mutta ohjelmisto on vanhentunut eikä sitä voi enää käyttää. Sen korjaamiselle on ollut paljon kysyntää, ja Essi Kerola aloitti sen päivittämisen kesällä 2024. Tässä opinnäytetyössä SAPP- ohjelmisto päivitettiin käyttökelpoiseksi ja ohjelmisto validoitiin hiiri- ja rottakuvil- la. 1 Teoriaa ja taustaa 1.1 Lääketieteellinen kuvantaminen Lääketieteellisen kuvantamisen tavoite on tutkia kehon sairauksia ja vammoja tark- koilla rakenne- ja toimintakuvilla. Niistä voidaan tehdä diagnoosi tai poissulkea vaihtoehtoja ja näin auttaa hoidossa. Kehon fyysistä ja kemiallista rakennetta selvi- tetään esimerkiksi tutkimalla, paljonko eri kehonosat magnetisoituvat, johtavat säh- köä, emissoivat tai läpäisevät säteilyä, sekä mikä niiden opasiteetti tai heijastavuus on. Näiden ominaisuuksien muutoksia ajan kuluessa voidaan visualisoida dynaami- silla kuvilla eli tulokset kertovat kehon muutoksista ajan funktiona. Tällöin kohtees- ta otetaan yhden kuvan sijaan monta. Tuloksista voidaan analysoida esimerkiksi kudosten alkuainekoostumus, elektronitiheys sekä veren tilavuus ja virtaus. Omi- naisuuksista muodostetaan anatomisia kuvia muun muassa magneettikuvantamisel- 3la, jossa hyödynnetään eri kudosten magnetisoitumistasoja. PET-kuvat visualisoi- vat rakenteiden sijaan kehon eri funktionaalisia prosesseja käytetyn merkkiaineen mukaan. [3] Kuvassa 1 näkyy, miten lääketieteellistä kuvantamista ja hoitoa tehdään ko- ko sähkömagneettisella spektrillä. Ionisoiva säteily on suurenergistä säteilyä, jo- ka pystyy muuttamaan kudoksen molekyylirakennetta ja sähkövarausta. Gamma- , röntgen- ja ultraviolettisäteily ovat ionisoivaa säteilyä, eli niiden käyttö vaurioittaa kuvattavaa aluetta, koska se rikkoo kudoksen rakennetta molekyylitasolla. Ionisoi- maton säteily tuottaa lähinnä lämpöä eikä aiheuta haittaa. Eri säteilymuotoja voi- daan käyttää yhdessä, jotta saadaan kokonaisvaltaisempi kuva. PET:in kanssa voi yhdistää esimerkiksi magneettikuvauksen, jolloin käytetään sekä gammasäteilyä että radioaaltoja. Kuva 1: Esimerkkejä sähkömagneettisen säteilyn spektrin käyttöstä lääketieteelli- sessä kuvantamisessa. 1.1.1 Positroniemissiotomografia PET-kuvaus on kuvantamismenetelmä, jossa käytetään lyhytikäisiä radioisotooppeja mittaamaan esimerkiksi veren läpivirtausta ja metabolista aktiivisuutta soluissa. Se pystyy tutkimaan molekyylitasolla tapahtuvia muutoksia ennen kuin anatomisia muutoksia pystytään huomaamaan. 4Radioaktiivinen merkkiaine on epävakaa ja säteilee potilaan sisällä saavuttaak- seen vakauden, ja tässä reaktiossa merkkiaineen protoni muuttuu neutroniksi sekä positroniksi. Se on elektronin antihiukkanen eli sillä on sama massa kuin elektro- nilla, mutta sen varaus on positiivinen. Positroni liikkuu kehossa muutaman mil- limetrin törmäillen muihin atomeihin menettäen liike-energiansa. Pysähtyessään se yhdistyy lähellä olevan elektronin kanssa, jolloin molemmat annihiloituvat ja syntyy kaksi fotonia, joiden energiat ovat 511 keV, mikä vastaa alkuperäisten partikkelien lepomassaa me = 0; 511MeVc2 . Massan ja energian ekvivalenssi on helppo varmistaa Einsteinin tunnetuimmalla kaavalla 1 [4]. Elektronilla ja positronilla on sama massa m = 9; 10938356  1031kg ja valonnopeus c tunnetaan. E = mc2 (1) = 9; 10938356  1031kg   299792458 m s 2 = 8; 18710565  1014J Muutetaan joulet elektronivolteiksi, kun tiedetään, että 1 eV = 1; 602  1019 J. 8; 18710565  1014J  1eV 1; 602  1019J = 511055; 284eV  511keV Partikkelin koko massa siis muuttuu energiaksi, ja koska ne ovat paikoillaan annihilaatiossa, niillä ei ole liike-energiaa. Annihilaatiossa ne säteilevät teoriassa täsmälleen eri suuntiin kuten kuvassa 2. 5Kuva 2: Piirroskuva annihilaatiosta, jossa punainen pallo on positroni (e+), joka emittoituu kehoon saatetusta radioaktiivisesta merkkiaineesta. Sininen pallo on ke- hossa oleva elektroni (e), johon positroni osuu, jolloin tapahtuu niiden annihilaatio. Siitä syntyy kaksi fotonia, jotka säteilevät vastakkaisiin suuntiin energioilla, mitkä vastaavat alkuperäisten partikkelien lepomassaa. Potilasta ympäröivät detektorit ottavat vastaan annihilaatioista syntyneet foto- nit. Tietokone laskee niiden saapumisajan ja energian perusteella yhdestä annihilaa- tiosta syntyneet fotonit, koska ne saapuvat vastakkaisille detektoreille korkeintaan muutaman nanosekunnin erolla, kuten kuvassa 3a. Fotonit voidaan tällöin olettaa pariksi, eli oikeaksi tapahtumaksi, joka pystytään erottamaan muusta säteilystä. 6(a) (b) Kuva 3: (a) Annihilaatiosta syntyneet fotonit saavat aikaan kaksi havaintotapahtu- maa A ja B vastakkaisilla puolilla detektoria. (b) Annihilaatiosta syntyneet fotonit eivät aina emitoi täsmälleen vastasuuntiin, mikä huonontaa resoluutiota. Kuvat läh- teestä [5]. Teoriassa annihilaatiossa fotonit lähtevät täsmälleen vastakkaisiin suuntiin, mut- ta positroni ei aina menetä kaikkea liike-energiaansa ennen annihilaatiota, jolloin käyttämätön momentti aiheuttaa noin  0; 25 poikkeaman. Tämä ei ole ongelma esimerkiksi pienissä hiirille tehdyissä PET-laitteissa, joissa detektoriympyrän hal- kaisija on noin 15 cm, mutta koko kehoa kuvaavilla humaanilaitteilla halkaisija on noin 90 cm ja fotoni voi osua kokonaan väärään detektoriin kuten kuvassa 3b. Kahdesta eri annihilaatiosta syntyneet fotonit voidaan myös virheellisesti määrit- tää pariksi, jos ne sattumalta saapuvat kahdelle vastakkaiselle detektorille samaan aikaan. Fotoni voi myöskin sirota jo kehon sisällä ja muuttaa suuntaansa, jolloin tietokone määrittää annihilaation tapahtumispaikan mahdollisesti väärin. Fotonit voivat silti vaimentua kehossa, vaikka ne eivät muuttaisi suuntaansa. Oi- keita parinmuodostuksia on siis tehtävä myös fotoneilla, joiden energia ei ole täsmäl- leen 511 keV, joten PET-laitteet hyväksyvät fotoneita isommassa energiaikkunassa 511 keV ympärillä. Annihilaatiotapahtuma voi jäädä myös kokonaan lukematta, jos fotoni vaimenee niin paljon, että se jää kehoon. Fotoni voi myöskin kulkea detektorin läpi aiheuttamatta signaalia. 7Säteilyä ei myöskään tapahdu pelkästään PET-laitteen keskiosassa, vaan lähem- pänä laitteen toista reunaa, jolloin pitemmän matkan kulkenut fotoni menettää enemmän energiaa. Se myös saapuu hieman myöhemmin, jolloin fotoneita ei välttä- mättä havaittaisi pariksi, joten aikaikkuna parinhavaitsemiselle ei voi olla liian pieni. Yleensä se on noin 12 ns, mutta jos oletetaan 90 cm halkaisijaa ja valonnopeus on 3  108 m s , suurin mahdollinen ero fotonien saapumisella on noin 3 ns. Merkkiainetta ei saa olla liikaa, koska detektorit ylisaturoituvat ja virheelliset parinmuodostukset lisääntyvät. Detektoreilla on myös hukka-aika havaitsemisen jäl- keen, jolloin ne eivät voi tehdä heti uutta havaintoa. Liiallinen säteily lisää hukat- tujen havaintojen määrää. Mittausaika ja potilaan kyky olla paikoillaan rajoittavat myös resoluutiota. Tämä PET-kuvantamisen yhteenveto perustuu D.L. Baileyn ja kolleegoiden kirjaan [5] . 1.1.2 Tietokonekerroskuvaus TT-kuvaus perustuu röntgensäteiden eritasoiseen vaimentumiseen erilaisissa kudok- sissa riippuen kudoksen tiheydestä ja mistä alkuaineista se on koostunut. Röntgen- putki liikkuu kuvattavan kehonosan ympäri ja osittain absorboituneet röntgensäteet saapuvat detektoreihin monesta eri kulmasta. Kuva-aineisto työstetään tietokoneel- la, jolloin saadaan kerroksittaisia kuvia, jotka muodostavat 3D-kuvan, kun ne ase- tetaan päällekkäin. Röntgenputken perusosat on esitetty kuvassa 4. Potentiaalierolla Ua kiihdyte- tyt elektronit on merkitty sinisinä partikkeleina. Ne lähtevät hehkukatodilta C ja törmäävät anodiin A. Elektronit hidastuvat nopeasti anodin atomien sähkökentässä lähettäen sähkömagneettista säteilyä, jota kutsutaan jarrutussäteilyksi. Elektronien iskeytyminen anodiin tuottaa kuitenkin paljon lämpöä, minkä takia sitä jäähdyte- tään vedellä. 8Kuva 4: Röntgenputken perusosat A: anodi, C: hehkukatodi, X: röntgensäteet, Uh: hehkujännite ja Ua: kiihdytysjännite, Win ja Wout: vesijäähdyttimen lämpövuo. Po- tentiaaliero kiihdyttää sinisellä merkityt elektronit katodilta anodille, jolloin vapau- tuu jarrutussäteilyä, sekä lämpöä. Kuva lähteestä [6]. Elektroni voi törmätessään myös iskeä anodissa atomista sisäkuoren elektronin irti eli ionisoida sen. Ulommalta kuorelta putoaa elektroni täyttämään tyhjän tilan, jolloin vapautuu energiaa sähkömagneettisena säteilynä. Tämän säteilyn energia on sama kuin elektronikuorten välinen energiaero ja sitä kutsutaan ominaissäteilyksi eli karakteristiseksi säteilyksi. Jokaisella alkuaineella on elektronien ominaiset ener- giatasot, joten aineen pystyy tunnistamaan sen ominaissäteilyspektristä. Röntgens- pektrissä ominaissäteily erottuu intensiteettipiikkinä jatkuvasta jarrutussäteilystä, jota syntyy kun elektroni luovuttaa vain osan energiastaan törmätessään anodin atomiin. Lähteestä [7] saadussa kuvassa 5 näkyy taustasäteilystä erottuvat karakte- ristisen säteilyn piikit. Spektrin anodimateriaalina käytettiin metallista alkuainetta volframia. 9Kuva 5: Röntgensäteilyn spektri volframista tehdystä anodista. Jarrutussäteilystä erottuu aineen ominaissäteilyä eli karakteristista säteilyä. Kuva suomennettu läh- teestä [7]. Jatkuvan jarrutussäteilyn spektrin approksimaatio röntgenputkessa saadaan Kra- mersin lailla eli kaavalla 2. Kaavoissa käytetyt suureet ja yksiköt on koottu tauluk- koon I. Kramersin laki annetaan yleensä säteilyn intensiteetin I, eli fotonien luku- määrän, jakautumana säteilyn aallonpituutta  vastaan. I0()d = K   min 1  1 2 d (2) Jossa I0()d on säteilyn intensiteetti aallonpituuden pituuden välillä d, K on vakio, joka riippuu anodin atomiluvusta, min on lyhin säteilty aallonpituus ja  on aallonpituus välin d keskellä. [8] [9] Röntgenspektrissä pienin mahdollinen aallonpituus eli min saadaan silloin, kun fotonilla on suurin mahdollinen energia, eli kun elektroni antaa koko liike-energiansa 10 yhdelle fotonille. Ekin = eUa hfmax = eUa fmax = eUa h Ekin on kiihdytettyjen elektronien saama liike-energia, e on elektronin varaus, Ua on potentiaaliero röntenputken katodin ja anodin välillä, h on Planckin vakio ja fmax on taajuuden maksimiarvo. Sitä voidaan kuvata myös fmax = cmin jolloin saadaan Duane Huntin kaava 3, joka kuvaa aallonpituuden minimiä. min = hc eUa (3) Jossa c on valonnopeus. Aallonpituuden maksimi on suurin piirtein 1,5-kertainen sen minimiin nähden, mutta riippuu myös jännitteestä sekä atomiluvusta. [9] Taulukko I: Suureet ja niiden yksiköt Suure Selitys Yksikkö Säteilyn intensieetti I0 [-] Aallonpituus  [nm] Vakio K [-] Kineettinen energia Ekin [J] Elektronin varaus e [C] Potentiaali Ua [V] Planckin vakio h [Js] Taajuus f [Hz] Valon nopeus c [m s ] 11 1.1.3 Koe-eläinten käyttö PET- ja TT-kuvantamisessa Ihmisten ja eläinten, varsinkin nisäkkäiden, fysiologiset prosessit ovat monimutkai- sia, mutta samankaltaisia. Samankaltaisuuksien ansiosta koe-eläimillä voidaan tehdä kokeita, jotka edistävät sekä ihmisten että eläinten sairauksien hoitoa ja ehkäisemis- tä. Koe-eläinten käyttöä valvoo ja kontrolloi EU-lainsäädäntö ja alueelliset hallin- tovirastot Suomessa. Siihen vaikuttaa myös yleinen mielipide ja tutkimus vaihtoeh- toisille tavoille tehdä sama tutkimus. Lainsäädäntö vaatii useimmissa maissa koh- telemaan koe-eläimiä hyvin, mutta myös vastakkaisesti testaamaan eläimillä ennen uusien lääkkeiden antamista ihmisille. Eläinkokeissa painotetaan 3R:n sääntöä, joka tulee englanninkielisistä sanoista reduction, refinement ja replacement. Eläimiä pyritään siis käyttämään mahdolli- simman vähän, niiden hoito ja toimenpiteet tehdään mahdollisimman hyvin koh- tuullisissa rajoissa tuottamatta ylimääräistä kipua tai kärsimystä. Koe-eläimiä ei tulisi myöskään käyttää, jos koe-asetelma on mahdollista korvata esimerkiksi kudos- viljelyn avulla. Lääkeaineiden kehitys ja turvallisuus on kasvanut valtavasti viime vuosikymme- nien aikana eläinmallien ansiosta. Niillä on suuri merkitys kokeellisessa tutkimuk- sessa, kun etsitään rokotteita ja lääkkeitä, jotka hoitaisivat tai jopa parantaisivat esimerkiksi AIDS:in ja Parkinsonin taudin [10] . Tässä opinnäytetyössä käytettiin jo olemassa olevia kuvia rotista ja hiiristä, eikä sitä varten tehty uusia kokeita. PET- ja TT-laitteiden toimintaperiaatteiden takia kuvat onnistuvat vain, jos kuvattavat eläimet ovat paikoillaan, joten ne on nukutettu ja anestesiamaskia pide- tään koko kuvauksen ajan, jotta ne pysyisivät paikoillaan ilman stressiä aiheuttavaa pakottamista. In vivo -kuvantaminen mahdollistaa myös sen, että sairauden kehi- tyksen tarkkailemiseen tarvitaan vähemmän eläimiä, kun samoja eläimiä voidaan kuvantaa toistuvasti. Ilman tätä mahdollisuutta koe-eläimiä pitäisi olla moninker- tainen määrä, koska osa jouduttaisiin lopettamaan kokeen edetessä, jotta saataisiin 12 dataa myös kokeen ajalta, eikä pelkästään loppuvaiheessa. [11] 1.2 Kuvien analysointi Lääketieteellisten kuvien tulkinta vaatii kuvattavan kohteen rakenteiden analysoin- tia, ja tutkimusten tulosten pitää olla toistettavia ja vertailtavia, jotta ne olisivat luotettavia. Siksi on tärkeää, että kokeita ja analysointia standardisoidaan ja vali- doidaan. Koe-eläimistä otettuihin kuviin ja tuloksiin vaikuttavat myös vaikeammin määritellyt muuttujat, kuten anestesian määrä ja käyttö, eläinten käsittely ja miten dataa saadaan ja käsitellään. 1.2.1 Neuroanatominen analyysi atlaksilla Atlakset koostuvat useista kolmiulotteisista kuvista, jotka muodostavat keskiarvoi- sen standardisoidun kuvan esimerkiksi aivoista. Ihmisille ja koe-eläimille on monia atlaksia esimerkiksi eri sairauksia varten, ja niitä on saatavilla kirjoina tai digitaa- lisesti. Yksittäisen kuvan taustakohinaan saattaa hukkua tiettyjä signaaleja, mutta mo- nesta kuvasta yhdistetty keskiarvoinen malli paljastaa herkemmin nämä heikommat- kin signaalit, jos ne toistuvat lajin sisällä. Atlaksia käytetään aivokuvien analysoin- nissa, koska voimakkaat poikkeavat signaalit yksittäisestä kuvasta näkyvät selkeästi verrattaessa atlakseen. Atlakset eroavat toisistaan muun muassa kuvauksen kohteen iän, sukupuolen, aivojen puoliskojen epäsymmetrian, anatomisen vastaavuuden ja aivojen avaruudellisen normalisointimenetelmän (eng. spatial normalization) perus- teella. Kaikki atlakset eivät ole keskenään yhteensopivia, mutta eri atlaksia vertai- lemalla saadaan tietoa eri laboratorioissa käytettävistä kuvantamismalleista ympäri maailmaa. Atlaksissa säilyy tietoa lajin keskiarvoista ja vaihtelusta anatomisissa ja fysiologisissa muuttujissa iän ja sairauksien mukaan. [12] 13 1.2.2 ROI-analyysi ROI-analyysiä (eng. Region Of Interest) käytetään prekliinisissä PET-kuvissa mit- taamaan radioaktiivisen merkkiaineen aktiivisuutta aivojen eri osissa. PET-kuvat ovat kolmiulotteisia, joten teknisesti terminä ROI on väärin, koska se viittaa kak- siulotteiseen alueeseen. Oikeampi termi olisi VOI (eng. Volume Of Interest), joka kuvastaa paremmin esimerkiksi aivojen eri osien tilavuuksia, mutta tästä käytetään selkeyden ja termien vakiintumisen vuoksi vanhaa merkintää. ROI:t voidaan piirtää käsin tai käyttää atlaksien valmiita tai muokattuja pohjia. Näiltä määritetyiltä anatomisilta alueilta mitataan PET-merkkiaineen aktiivisuutta mega Becquerelleissa (MBq). Vertailtavuuden vuoksi alueista määritetään standar- disoitu ottoarvo (SUV, eng. Standardized Uptake Values) sekä kudosmillilitraa kohti injektoitu annos (ID, eng. Injected Dose). SUV on isotooppilääketieteessä käytet- ty termi, jota käytetään paljon PET-kuvantamisessa. Epätavalliset SUV-arvot il- mentävät muutoksia aineenvaihdunnallisessa aktiivisuudessa ja auttavat löytämään esimerkiksi kasvaimia. SUV on suhde ROI-alueen keskiarvoisen aktiivisuuden eli periaatteessa aktiivi- suustiheyden (MBq ml ) ja koko kehoon injektoidun annoksen välillä (MBq), kun kuvat- tavan paino (g) otetaan huomioon kertomalla se. SUV esitetään usein yksiköttömä- nä, koska saatu arvo on g ml ja kehon keskiarvoinen tiheys on 1 g ml , jolloin saatu arvo supistuu yksiköttömäksi ja on karkea arvio merkkiaineen imeytymisestä. %ID ml on toinen PET-kuvantamisessa käytetty määritelmä kuvaamaan ROI-alueiden aktiivisuutta. Se on suhde ROI-alueen keskiarvoisen aktiivisuuden (MBq ml ) ja koko ke- hoon injektoidun annoksen välillä (MBq), mutta se ei ota huomioon kehon painoa tai tilavuutta niin kuin SUV. Se esitetään injektoidun annoksen prosenttiosuutena yhdessä millilitrassa tai grammassa kudosta. Kaava 4 kuvaa, miten SUV-arvot lasketaan, ja kaava 5 kuvaa %ID g arvoja. %ID g voidaan myös merkitä %ID ml lähteestä riippuen. 14 SUV = Keskiarvoinen ROI-aktiivisuus(MBq ml ) Injektoitu annos (MBq)=Paino(g) (4) %ID g = Keskiarvoinen ROI-aktiivisuus(MBq ml ) Injektoitu annos (MBq)  100% (5) Molempia käytetään tutkimaan keskiarvoista ROI-aktiivisuutta, kun se muut- tuu ajan kanssa merkkiaineen kerääntyessä eri alueille. SUV ottaa huomioon koh- teen massan, mutta sillä on myös monia ongelmia, koska se ei esimerkiksi ota huo- mioon lihas- ja rasvakudoksen jakautumista, merkkiaineen vaihtelevaa kertymää tai kuinka kauan eri kuvaukset kestävät. Nämä semikvantitatiiviset menetelmät antavat vertailukelpoisia tuloksia, mutta ovat kuitenkin arvioituja. [11] 2 Menetelmät 2.1 Data SAPP-ohjelmistolla tutkittiin hiirten ja rottien PET- ja TT-kuvia, jotka olivat DICOM-tiedostomuodossa (Digital Imaging and Communications in Medicine). Ku- vissa oli joko yksi tai kaksi eläintä rinnakkain. Taulukossa II ja III on esitetty SAPP- ohjelmiston tarvitseman Info.xlsx-tiedoston sisältö. Annokset on merkitty beque- relleissa, painot grammoissa ja mittausajanjaksot (eng. Time frame) sekunneissa. Kaikki käytetyt PET-kuvat ovat dynaamisia, eli aktiivisuuden muutosta tutkitaan ajan funktiona. Mittausajanjaksot kuvaavat, miten dynaaminen kuva on otettu. PET-kuvaus on aloitettu sillä hetkellä, kun merkkiaine on injektoitu, ja esimerkiksi kuvassa P102949 on ensin otettu kuusi kymmenen sekunnin mittausajanjaksoa, sit- ten neljä yhden minuutin mittausajanjaksoa ja niin edelleen. Alussa merkkiaineen konsentraatio muuttuu eniten, koska se on silloin aktiivisimmillaan ja alkaa levitä 15 verenkierrossa. Lopussa konsentraatio kehossa on tasaisempi ja merkkiaineen ak- tiivisuus on matalampi, joten mittausajanjaksot ovat pitempiä. Mittausajanjakson sisällä merkkiaineen pitää hajota tarpeeksi, jotta saadaan tarpeeksi datapisteitä, eli luotettava tulos aktiivisuudesta. Liian lyhyt mittausajanjakso johtaa kohinaan, mutta liian pitkä ajanjakso aiheuttaa myös virheellisen tuloksen, koska siinä menete- tään informaatiota. Mittausajanjaksojen pituus ja määrä vaihtelevat eri tutkimusten välillä käytetyn merkkiaineen ja kuvattavan kohteen mukaan. Taulukko II: SAPP-ohjelmistolla tutkittu data Kuva Laji Puoli Annos (MBq) Paino (g) P102949 Rotta Oikea 33 270 P102949 Rotta Vasen 32 244,1 P131960 Hiiri Oikea 4,3 37,7 P131960 Hiiri Vasen 3,7 33 P131962 Hiiri Oikea 4,4 36,3 P131962 Hiiri Vasen 4,5 34,6 P100292 Hiiri Oikea 7,96 45,90 P100292 Hiiri Vasen 7,87 44,90 ae3127 Hiiri Oikea 2,36 38,50 ae3127 Hiiri Vasen 1,59 41,60 P131512 Rotta Oikea 16,86 234,2 P131512 Rotta Vasen 20,71 237,3 16 Taulukko III: Mittausajanjaksot eri kuvissa sekä käytetty merkkiaine Kuva Mittausajanjaksot (s) Merkkiaine P102949 6x10, 4x60, 5x300, 9x600 Ei tiedossa P131960 6x10, 4x60, 5x300, 3x600 [18F]RVA P131962 6x10, 4x60, 5x300, 3x600 [18F]RVA P100292 30x10, 15x60, 4x300, 2x600 [18F]FDG ae3127 5x60, 5x300 [18F]FMPEP-d2 P131512 30x10, 15x60, 4x300, 2x600, 3x1200 [18F]FPATPP Merkkiaineet ovat PET-kuvaamisessa käytettyjä fluoripohjaisia radiolääkkeitä. Erilaisissa mittauksissa tarvitaan erilaisia merkkiaineita, koska niissä tutkitaan eri asioita. Esimerkiksi 18F-fluorideoksiglukoosi eli FDG on glukoosin johdannainen, jolloin se kerääntyy sokeria käyttäviin kudoksiin, kuten syöpäkasvaimiin. 2.2 Toteutusalusta 2.2.1 MATLAB MATLAB [2] on tietokoneohjelmisto ja ohjelmointikieli, jota käytetään monilla aloil- la sekä akatemiassa että teollisuudessa. Sillä voi käsitellä matriiseja, funktioita, to- teuttaa algoritmeja, luoda käyttöliittymiä ja visualisoida dataa. SAPP on tehty MATLAB:issa, koska sitä käytetään usein lääketieteellisessä tutkimuksessa ja siinä on monia funktioita ja työkaluja kuvien prosessointia varten. Alkuperäinen SAPP on kehitetty MATLAB:in versiolla R2016b (versio 9.1) [1] ja päivittäessä siitä käytettiin versiota R2024b (versio 24.2). 17 2.2.2 SPM SPM-valmisohjelmistoa (eng. Statistical parametric mapping) [13] käytetään laajasti aivokuvantamisessa käytettävän datan käsittelyssä. SPM:ää käytetään MATLAB:ssa ja se sisältää monia funktioita ja aliohjelmia sekä kuva- että tilastoanalyysissä. SPM on tärkeä osa SAPP-ohjelmiston rakennetta ja analyysia, ja päivittämisen aikana SPM:stä käytettiin versioita 12 ja 25. 2.2.3 Carimas Carimas [14] on Turun PET-keskuksessa lääketieteellisten kuvien käsittelyyn kehi- tetty visualisointi- ja analysointiohjelmisto, jota käytetään SAPP-ohjelmiston käsit- telemien kuvien avaamisessa ja ongelmanratkaisussa. Se ei ole osa SAPP-ohjelmiston analyysia, mutta sillä voidaan esimerkiksi tarkistaa, onko SAPP asettanut TT- ja PET-kuvat kohdakkain. 2.3 SAPP-ohjelmiston rakenne SAPP vaatii tiedot tietyssä tiedostorakenteessa toimiakseen, ja kuvat DICOM-tyyppisinä. Kuvassa voi olla joko kaksi eläintä rinnakkain tai yksi keskellä. Kuvassa 6A on esi- tetty projektikansion rakenne, jossa sen sisällä on kuvakansio sekä Excel-tiedosto In- fo.xls, jossa on koe-eläinten tunniste, paino ja injektoitu merkkiaineannos. Kuvakan- sion sisällä on TT- ja PET-kansiot, joissa koe-eläinten kuva on DICOM-tyyppisinä, eli ne sisältävät satoja kuvaleikkeitä yksittäisinä kuvina, joita SAPP käy läpi. Tu- loskansion rakenne on esitetty C-kohdassa. Jokaisella eläimellä on oma kansio, jo- ka sisältää laaduntarkastustiedoston, ROI-analyysin tulokset, alkuperäisen kuva- aineiston, rajatut ja käännellyt TT- ja PET-kuvat sekä parametrisen PET-kuvan eli normalisoidun PET-kuvan, jonka pikselit sisältävät lasketut SUV ja %ID g kudo- sarvot Bq ml :n sijaan. 18 Kuva 6: SAPP-ohjelmiston tiedostorakenne. A) Projektikansion sisällä on Excel- tiedosto koe-eläinten tiedoille ja kuvakansio, joissa on TT- ja PET-kuvat DICOM- tyyppisinä. B) Ensimmäisessä moduulissa SAPP muuttaa DICOM-tiedostot NifTI- tyyppisiksi, jonka jälkeen se reorientoi kuvat atlaksen mukaiseksi, yhdistää PET- ja TT-kuvat päällekkäin karkeasti ja rajaa päät. Seuraavaksi se sovittaa atlakset ja tekee avaruudellisen normalisaation ja hienosäätää PET- ja TT-kuvien kohdista- mista. Toisessa moduulissa SAPP analysoi atlasten asettamat ROI:t ja kolmannessa moduulissa tekee parametrisen PET-kuvan. C) Lopuksi tuloskansiossa on oma ala- kansio erikseen rajatuille vasemman ja oikean puoliselle koe-eläimen päälle. Alakan- siossa on laaduntarkastustiedosto (QC), ROI-analyysin tulokset, raaka data, rajatut ja käännetyt TT- ja PET- kuvat sekä parametrinen PET-kuva. SAPP-ohjelmiston voi suorittaa kerralla alusta loppuun, mutta se on mahdol- lista suorittaa kolmessa eri osassa eli moduulissa. Kuvan 6 B-kohdassa on esitetty, mitä SAPP-ohjelmiston kolme eri moduulia tekevät. Ensimmäisen moduulin nimi on kuvien esikäsittely (eng. Pre-process datasets) ja siinä kuvat esikäsitellään eli val- mistetaan analysointiin. Toinen moduuli on rajattujen kuvien eli koe-eläinten päi- 19 den analysointi (eng. Analyze subjects). Kolmas moduuli on parametristen kuvien muodostaminen (eng. Compute parametric PET images). 2.3.1 Moduuli 1: Kuvien esikäsittely Ensimmäistä moduulia varten käyttöliittymässä annetaan parametreiksi datasettien sijainti, onko kyseessä hiiri vai rotta, ja rotan tapauksessa valitaan vielä, käytetäänkö Sprague-Dawley vai Fischer-lajin rotilla tehtyä atlasta. SAPP-ohjelmiston käyttämä avaruudellinen normalisaatiomenetelmä vaikuttaa atlaksen ja kuvien yhteenasettamiseen. Käyttöliittymässä valitaan myös, millaista kohdistusta halutaan käyttää. Joustamattomassa kohdistuksessa (eng. rigid align- ment) vain translaatiot ja rotaatiot ovat sallittuja TT-kuvan muuttamisessa at- lakseen sopivammaksi. Affiinikohdistuksessa (eng. affine alignment) kuvaa voidaan kääntää, venyttää ja skaalata, eli se on vapaampi kuin joustamaton kohdistus. Tässä projektissa käytettiin vain affiinikohdistusta. Parametrit ja tarvittavat ohjeet saatuaan SAPP muuttaa DICOM-tyyppiset ku- vat yhdeksi NifTI-tiedostoksi ja pääkoodissa (sapp_main.m) jatkaa PET- ja TT- kuvien kohdistamiseen, mutta esikäsittelyn pääkoodissa (sapp_main_preprocess.m) se reorientoi kuvat atlaksen mukaiseksi tässä välissä. PET- ja TT-kuvat asetetaan päällekkäin eli kohdistetaan niin, että anatomisesta TT-kuvasta pystyy näkemään, missä PET-kuvan aktiivisuus on, ja niitä on mahdollista kohdella yhtenä kuvana. Käytännössä SAPP ei aina onnistu siinä, eli toinen kuva ei ole aivan kohdallaan. Sen takia ne asetetaan ensin karkeasti päällekkäin ja hienosäätö tapahtuu pään ra- jauksen jälkeen. 2.3.1.1 Rajaus Koe-eläimen pää rajataan algoritmilla, joka käyttää anestesiamaskia ja alustaa ra- jauksessa kuten kuvassa 7 näkyy. Kokeesta riippuen kuvassa voi olla joko yksi tai 20 kaksi eläintä, ja jälkimmäisessä tapauksessa molempien päät pitää rajata erikseen. TT-kuva projisoidaan x-akselille yksiulotteiseksi käyräksi, jolla on yhden kuvatta- van tapauksessa yksi huippu ja kahdella syntyy kaksi huippua. X-koordinaatiksi, joka erottaa kaksi eläintä toisistaan, valitaan tällöin kahden huipun välistä pienin arvo. Y-koordinaatti saadaan alustasta, jolla koe-eläin makaa kuvauksen ajan. Sa- gittaalitasossa alusta näyttää vaakasuoralta, ja algoritmi havaitsee sen ja asettaa koordinaatin. Z-koordinaatti saadaan anestesiamaskista, joka näkyy frontaalitasos- sa (eng. Coronal view) ympyränmuotoisena kuviona, jonka algoritmi havaitsee. Kuva 7: Rajausalgoritmin toimintaperiaate A) Koe-eläimen pään rajaava algoritmi saa x-koordinaatin projisoimalla kuvan yksiulotteisesti x-akselille. B) Sagitaalita- sossa peti näkyy pitkänä vaakasuorana viivana, jonka algoritmi havaitsee ja asettaa y-akseliksi. C) Frontaalitasossa anestesiamaski näkyy ympyränmuotoisena kuviona, jonka rajausalgoritmi havaitsee ja asettaa z-koordinaatin sen mukaan. 21 Esikäsittelyn alussa pitää määrittää parametrina, kuvataanko hiiriä vai rottia. Koordinaatit löydettyään algoritmi leikkaa TT-kuvista kuution, jonka tahkon sivun pituus on hiirien tapauksessa noin 22 mm ja rotilla 44 mm. PET-kuvissa kuvamatrii- sin koko on erilainen, joten koordinaatit, jotka perustuvat TT-kuviin, pitää muuttaa vastaaviin tilavuusalkioihin (eng. voxel) alla olevalla kaavalla 6. XYZPET =M 1 PET MTT XY ZTT (6) TT-kuviin perustuvat koordinaatit (XYZTT ) skaalataan, kierretään tai peila- taan affiinikuvauksella matriiseilla (MTT ). Arvot muutetaan vastaaviin PET:ssä (XYZPET ) kertomalla PET:in käänteismatriisilla (M1PET ). Epäonnistuneessa rajauksessa algoritmi ei löytänyt kuvattavan päätä, eli se voi olla kokonaan tai osittain rajauksen ulkopuolella, kuten kuvassa 8a. Koodi asetti myös skaalauspilarin yhdeksi kuvaksi, jolloin oikea kolmas kuva jäi keskimmäisen alle. Se korjattiin, ja kuvassa 8b näkyy kaikki kuvat, sekä onnistunut rajaus kolmesta eri suunnasta. 22 (a) Epäonnistunut rajaus ja kuvien asettelu (b) Onnistunut rajaus ja kuvien asettelu Kuva 8: Kuvakaappauksia kuvan P102949 oikean puolisen rotan laaduntarkastus- kansiosta (a) Epäonnistunut pään rajaus ja ote laaduntarkastustiedostosta ennen kuin asettelu korjattiin (b) Onnistunut pään rajaus laaduntarkastustiedoston aset- telun korjaamisen jälkeen 2.3.1.2 TT- ja PET-kuvien kohdistaminen Ennen rajausta PET- ja TT-kuvat kohdistettiin karkeasti, jotta ne olisivat päällek- käin ja niitä voitaisiin kohdella yhtenä kuvana. Rajauksen jälkeen tapahtuu koh- 23 distuksen hienosäätö. Dynaamisella PET-kuvalla otetaan kaikista aikapisteistä kes- kiarvo, jotta saadaan paras mahdollinen kohdistus TT-kuvan kanssa. 2.3.1.3 Atlas sovitus Käytetyt atlakset ovat avoimesta lähdekoodista ja koostuvat T2-painotetuista MRI- kuvista, sekä aivojen tärkeimpiä anatomisia alueita vastaavista ROI-alueista. Hii- riatlaksena käytettiin lähteen [15] atlasta ja se koostuu yleisimmän koehiirikan- nan (C57BL/6J) kahdestatoista täysikasvuisesta uroshiirestä. Kuvat otettiin in vivo magneettiresonanssimikroskoopilla (MRM). SAPP-ohjelmistoa varten ROI:ta myös muutettiin, nimettiin uudelleen ja pienennettiin 5 % eli analyysivaiheessa ei saada täsmälleen kuvan 9 ROI:ta. Sama tehtiin myös rottien atlakselle. [16] Kuva 9: (A) Hiiren aivojen frontaali-, horisontaali- ja sagittaalitasot kolmiulottei- sessa in vivo MRI-kuvassa. Aivojen eri alueet on rajattu eri värisillä viivoilla. (B) Rekonstruktoitu kolmiulotteinen poikkileikattu kuva atlaksesta (C) Aivojen syvem- mät osat. Kuvasta poistettu näkyvistä neokorteksi, hajukäämi ja aivorunko. (D) Aivojen eri osia. Kuvasta poistettu aivokurkiainen ja etu-kommissuura. Kuva suo- mennettu lähteestä [15] Rotta-atlaksena käytettiin lähteen [17] atlasta ja se koostuu täysikasvuisista 24 Sprague-Dawley -linjan urosrotista. ROI:sta tehtiin kaksi eri versiota, joista ensim- mäisessä ROI:t nimettiin erikseen vasemmalle ja oikealle aivopuoliskolle ja toisessa vasenta ja oikeanpuolista ROI-aluetta ei erotettu nimillä. Vasemman ja oikean puo- len erottavalla ROI-ryhmällä alueita on 55 ja toisella ryhmällä 30. ROI-alueita on enemmän kuin hiirellä, koska rotan aivot ovat suuremmat ja ne jaetaan useampiin anatomisiin alueisiin. Rajauksen jälkeen SAPP asettaa punaisen referenssikuvan TT-kuvan päälle ku- ten kuvassa 10. Ylempänä on visualisoitu epäonnistunut sovitus, kun pään auto- maattinen rajaus on virheellinen ja alempana onnistunut sovitus, kun käyttäjä on tehnyt rajauksen SAPP-ohjelmistolla manuaalisesti. Epäonnistuneessa sovitukses- sa TT-kuvaa ei saada sovitettua referenssiin kääntämällä tai siirtämällä, koska osa päästä on rajautunut pois, mutta onnistuneessa alustavassa sovituksessa se on mah- dollista. Vasemman puoleinen kuva saadaan sopimaan referenssiin kääntämällä ku- vaa noin 45 myötäpäivään. Keskimmäisessä ja oikean puolisessa riittää siirtäminen, mutta epäonnistuneessa sovituksessa näkyy, että keskimmäisessä ei näy kallon luita ja oikean puolisessa osa päästä on rajautunut pois. 25 (a) Epäonnistunut alustava sovitus (b) Onnistunut alustava sovitus Kuva 10: Kuvakaappauksia kuvan P102949 vasemman puolisen rotan laaduntar- kastuskansiosta. (a) Kuvassa oikean ja punaisen referenssi TT-kuvan karkea koh- distaminen ei ole onnistunut. (b) Kuvassa rotan aivot on rajattu manuaalisesti ja referenssi TT-on osunut tarpeeksi lähelle oikeaa, jotta SAPP pystyy kohdistamaan atlakset myöhemmin oikein kääntämällä tai siirtämällä TT-kuvaa. Atlasten sovitus ei onnistu, jos referenssikuvankaan asettaminen ei ole onnistu- nut. Kuvassa 11 näkyy rotan epäonnistunut ja onnistunut atlassovitus. Onnistunees- sa kuvassa rotan pää on rajattu SAPP-ohjelmistolla manuaalisesti. 26 (a) Epäonnistunut atlas sovitus (b) Onnistunut atlassovitus Kuva 11: Kuvakaappauksia kuvan P102949 vasemman puolisen rotan laaduntarkas- tuskansiosta. (a) Epäonnistunut sovitus neuroanatomisiin atlaskuviin (b) Onnistu- nut sovitus neuroanatomisiin atlaksiin 2.3.1.4 Aivojen avaruudellinen normalisaatio Viimeinen vaihe ensimmäisessä moduulissa on aivojen avaruudellinen normalisaatio, eli PET- ja TT-kuvat skaalataan atlaksiin. Kaikki aivot eivät ole lajinkaan sisällä täsmälleen saman kokoisia ja muotoisia, joten tämä vaihe tekee kaikista samaan atlakseen skaalatuista aivoista saman kokoisia, jolloin tulokset ovat vertailukelpoisia. 2.3.1.5 Esikäsittelyn virheiden määristys ja manuaalien korjaus Esikäsittelyn on mentävä oikein, jotta seuraavat moduulit toimisivat, joten SAPP- ohjelmiston käyttömanuaalissa [16] on monta vianmääritystapaa. SAPP printtaa vir- 27 helogin, johon kirjataan virheilmoitukset, jos koodi ei esimerkiksi löytänyt Info.xls- tiedostoa. Jos SAPP ei tunnista yksittäistä kuvaa DICOM-tiedostoissa, tai jokin menee vikaan, se jättää sen väliin ja menee seuraavaan. DICOM-tiedostot pitää esi- merkiksi olla nimetty oikein. Jos virhelogista ei selviä ongelmaa, kannattaa tarkistaa, että lukeeko kuvien ja eläinten nimet ja tiedot Info.xls:ssä oikein. Kuvia voi myös avata SPM:llä ja Carimaksella ja tarkistaa, että ne eivät ole esimerkiksi korruptoituneita. Esikäsittelyn lopputulosten kansiossa on myös laadun- tarkastuskansio, johon on kerätty kuvia eri prosessin vaiheista, jotta ongelman mää- rittäminen olisi helpompaa. Kuvissa 8 ja 11 on otteita epäonnistuneesta ja onnistu- neesta rajauksesta sekä atlassovituksesta. Rajaamisen ja esikäsittelyn voi tehdä irrallaan toisistaan moduulivalikon työ- kaluriviltä. Sillä voi selvittää, oliko ongelmana vain koordinaattien löytäminen vai onko esikäsittelyssä jotain muuta vialla. Atlassovituksen epäonnistuminen voi joh- tua siitä, että alkuperäinen arvaus ei ollut tarpeeksi lähellä, jolloin kuvaa voi yrittää kääntää SPM:llä atlakseen sopivammaksi. PET- ja TT-kuvat voi asettaa paremmin kohdikkain Carimaksella, jos ne eivät ole tarpeeksi hyvin päällekkäin. Koe-eläin voi myös olla huonosti anestesiamaskissa, jolloin algoritmi ei rajaa päätä oikein. 2.3.2 Moduuli 2: Kuvien analysointi Toinen moduuli tekee kuvien analysoinnin (eng. Analyze Subjects) PET-kuvan atlas- karttojen rajaamilla ROI-alueilla. Niistä lasketaan annos millilitroissa (Bq ml ), SUV:it, ja %ID g normalisoituna kaavoilla 4 ja 5. Tarvittavat tiedot löytyvät Info.xlsx-tiedostosta. Dynaamisessa PET:ssä voidaan laskea tietyn aikavälin keskiarvot. Toisessa moduulissa annetaan parametreiksi ensimmäisen moduulin tuloskansion sijainti, sekä laji. Se määrittää, mitä ROI-alueita käytetään analyysissä. Rotan ta- pauksessa pitää valita myös, käytetäänkö aivopuoliskot yhdistäviä vai erottavia ROI- alueita, vai molempia. Käyttöliittymässä voi valita yhden tai useamman referenssia- 28 lueen, joiden arvoihin muita verrataan. Dynaamisten PET-kuvien ROI-analyysien tuloksista pystyy ottamaan keskiarvon tietyistä mittausajanjaksoista. Tuloksena SAPP tekee Excel-tiedoston, jossa on eri välilehdillä Bq ml , SUV, ja %ID g arvot jokaiselle eri aivoaluetta kuvaavalle ROI-alueelle. Osa saaduista kuvan P100292 oikeanpuolisen hiiren SUV-arvoista on esitetty graafisesti kuvassa 15 vaaleammalla ja ohuemmalla viivalla. 2.3.3 Moduuli 3: Parametriset PET-kuvat Kolmannessa moduulissa lasketaan parametrinen PET-kuva (eng. Compute para- metric PET images), joka yhdessä ROI-analyysin ja normalisoitujen kuvien kanssa mahdollistaa tilavuusalkiokohtaiseen analyysiin (eng. Voxel-wise analysis) kehittä- misen osaksi SAPP-ohjelmistoa. Parametrinen kuva saadaan, kun ensimmäisen mo- duulin lopussa tehdyn normalisoidun PET-kuvan pikseleihin sisällytetään lasketut SUV ja %ID g kudosarvot alkuperäisten mitattujen arvojen (Bq ml ) sijaan. Kuvat nor- malisoidaan joka eläimen kohdalla niiden massan ja injektoidun annoksen suhteen. Parametreiksi tätä moduulia varten annetaan tuloskansio sekä laji. Parametrisen kuvan tyypiksi (eng. parametric image type) pitää valita joko suhde haluttuun refe- renssialueeseen, SUV tai %ID g . Laji vaikuttaa, mitä atlasta käytetään, jos lasketaan tulosten suhde referenssialueeseen. Yksittäinen parametrinen staattinen kuva (eng. single parametric static frame) saadaan, kun dynaamisesta kuvasta valitaan yksi tai useampi aikapiste. Näin saa- daan staattinen kuvaus tietystä hetkestä dynaamisessa kuvassa. 2.3.4 Graafinen käyttöliittymä SAPP-ohjelmiston käyttöliittymä (eng. Graphical User Interface, GUI) helpottaa tutkijan tehtävää, koska se nopeuttaa kuvien prosessointia ja mahdollistaa haluttu- jen parametrien valitsemisen ilman koodin käsittelyä. Tutkijan, joka käyttää ohjel- 29 maa, pitää valita tiedostot ja kertoa, onko kyseessä hiirien vai rottien kuvia ja mitä muita parametreja haluaa käyttää kuvien käsittelyssä. Käyttöliittymä kehitettiin käyttämällä GUIDE-työkalua (eng. GUI development environment) MATLAB:ssa. Käyttöliittymä on kehitetty yhteistyössä prekliinisten tutkijoiden kanssa [1]. 3 Tulokset 3.1 SAPP-ohjelmiston korjaus Osa korjausta vaativista asioista on todennäköisesti toiminut ennen, mutta esimer- kiksi eri käyttöjärjestelmän tai vanhentuneiden ohjelmistojen takia jotkut SAPP- ohjelmiston perusasiatkaan eivät onnistu. Tämän opinnäytetyön yhteydessä tehtiin jatkossa SAPP-ohjelmiston kanssa työskenteleviä varten englanniksi yksityiskohtai- nen käyttöohje, jossa neuvotaan, miten sen kanssa kannattaa aloittaa. 3.1.1 Laaduntarkastustiedosto SAPP tekee ensimmäisessä moduulissa tuloskansioon laaduntarkastus- eli QC-tiedoston (eng. Quality Control), jossa on kuvia esikäsittelyn eri vaiheista. Tiedosto kirjoitti itsensä päälle niin, että aina kun tiedostoon lisättäisiin mitään, lisäämisen sijaan se teki uuden tiedoston samalla nimellä, jolloin vanha poistettiin. Koodi korjattiin niin, että jos tiedosto on jo olemassa, se kirjoittaa siihen uuden sivun. SAPP-manuaalissa viitattiin, että tiedosto olisi ennenkin ollut useamman sivun mittainen eli ongel- ma on todennäköisesti syntynyt SAPP-ohjelmiston käytön aikana. Visualisoinnin eri osat menivät päällekkäin, kuten kuvassa 8a näkyy. Taitto korjattiin ja kaikki osat näkyvät nyt ongelmitta. 30 3.1.2 Käyttöjärjestelmä SAPP-ohjelmistoa päivitettiin ensin Linux-ympäristössä, jolloin Excelin sijaan käy- tettiin LibreOfficea, mutta koodi ei suostunut avaamaan sitä. Tuloksia yritettiin ot- taa csv-tiedostona, mutta lopulta päädyttiin Windowsiin, koska SAPP-ohjelmistoa on lopuksi tarkoitus käyttää Windows-pohjaisella koneella ja alkuperäinen versio SAPP-ohjelmistosta on myös tehty sillä. Ongelmia käyttöjärjestelmien välillä oli muun muassa kauttaviivojen eri suunnat. Ensimmäinen moduuli tehtiin toimivaksi sekä Linuxilla että Windowsilla, mutta toinen ja kolmas vaihe toimivat vain Exce- lillä. 3.1.3 Rajaus ja x-koordinaatin määrittäminen algoritmilla SAPP-ohjelmistoa testattiin aluksi pelkästään rotan kuvilla, joita SAPP ei osannut automaattisesti rajata oikein. Atlakset eivät tällöin osu kohdilleen, ja analysointi ei onnistu, kuten näkyy kuvissa 10a ja 11a. Manuaalisesti rajaus toimi niin, että avataan haluttu NifTI-tiedosto ja piirretään ensin ylempään kuvaan neliö, jossa rajauksen sisällä on eläimen koko pää, kuten kuvassa 12. 31 Kuva 12: Kuvakaappaus SAPP-ohjelmiston rajaustyökalusta, kuvassa kuvan P131960 hiiret Rajattava alue ilmestyy myös alempaan kuvaan, mutta sitä ei kannata raahata vaan siirtää laatikon reunoja, koska muuten rajausalueet eivät vastaa toisiaan. Jos kuvassa on monta eläintä, rajattu kuva pitää tallentaa oikealla nimellä ja ohjelma sulkea ja avata uudestaan ennen seuraavan pään rajaamista. Todennäköinen syy näiden rottakuvien huonolle menestykselle on, että ainakin toisen rotan kuono on huonosti anestesiamaskissa. SAPP ei aseta erikseen kummalle- kin omaa z-koordinaattia, josta rajata, vaan molemmilla on sama. Tällöin osa rotan päästä jää rajauksen ulkopuolelle, kuten näkyy kuvassa 10. Manuaalisesti tämänkin rotan rajaaminen onnistui. 32 Ensimmäisessä moduulissa SAPP-ohjelmiston pitäisi pystyä toimimaan erilais- ten kuvien kanssa ja määrittämään, kuinka monta koe-eläintä niissä on. Jos niitä on kaksi, algoritmi määrittää x-koordinaatin, mistä kuva pitää leikata, jotta kaksi päätä rajataan erikseen. Yhden eläimen tapauksessa ei tarvitse tehdä mitään. Kol- miulotteinen kuva projisoidaan x-akselille, jolloin siihen muodostuu kuvaaja TT- kuvan mukaan. Kuvassa 13 on esimerkki kuvan P131960 hiirien yhdestä TT-kuvan DICOM-kuvasta frontaalitasossa. Kuvaan on merkitty kohdat, jotka luovat vahvim- mat signaalit x-akselille, eli tässä tapauksessa vaakatasoon, projisoitaessa. Yläosas- sa olevasta kaaresta tulee myös kohinaa, mutta se on niin pientä, ettei se vaikuta projisoinnissa. Kuva 13: DICOM-tiedosto eli yksittäinen kuvaleike kuvan P131960 hiirien TT- kuvasta frontaalitasossa. Kuvaan on merkitty kohdat, jotka luovat vahvimmat sig- naalit x-akselille, eli tässä tapauksessa vaakatasoon, projisoitaessa. Hiiristä pitäisi muodostua kaksi huippua, ja yhden hiiren tapauksessa yksi, kun kuvat projisoidaan x-akselille. Kahdella hiirellä x-akselin rajauskoordinaatti määri- tetään kahden huipun välisellä pienimmällä arvolla. Kuvassa 14a kuva 13 on proji- soitu x-akselille ja algoritmi on löytänyt hiiret B ja D, mutta myös kuvassa näkyvät 33 mittauslaitteiston rakenteet A, C ja E. Sovitettu gaussinkäyrä ei toimi, ja algorit- mi lukee, että kuvassa olisi vain yksi eläin, jolloin x-koordinaatin määrittäminen oikein ei onnistu. Ongelma ratkaistiin rajaamalla kummaltakin puolelta kuvaa 50 tilavuusalkiota, jolloin rakenteet A ja E rajautuvat pois ja oikeat huiputB ja D löy- tyvät ja algoritmi onnistuu löytämään Gaussinkäyrästä huippujen välisen pienim- män arvon, jota käytetään kaksi eläintä erottavana x-koordinaattina, kuten kuvassa 14b näkyy. 34 (a) Epäonnistunut Gaussin käyrän sovitus (b) Onnistunut Gaussin käyrän sovitus Kuva 14: Koe-eläimen x-koordinaatin määrittämiseksi sen TT-kuva projisoidaan x-akselille ja siihen sovitetaan Gaussin käyrä, jolloin löydetään kahden eläimen ta- pauksessa matalin arvo kahden huipun välillä eli x-koordinaatti, josta kuva ja eläimet rajataan erilleen. Kuvaan on merkitty kuvan 13 tuottamat signaalit. (a) Epäonnis- tunut projisointi. (b) Onnistunut projisointi. 35 3.2 Validointi SAPP-ohjelmistolla käsiteltiin monia eri kuvia sen kehittämisen aikana. Kuvan P100292 oikean puolisen hiiren sekä kuvan P131512 vasemman puolisen rotan SUV-arvoja vertailtiin prekliinisen tutkijan käsin piirtämiin ROI-alueisiin. Nämä aktiivisuuskäy- rät ovat kuvissa 15 ja 16. Rotan kuvaus alkaa, kun merkkiaine injektoidaan, ja hii- ren kuvaus alkaa muutaman sadasosa-sekunnin injektion jälkeen. Sen takia hiiren SUV-arvot eivät ala nollasta. Aktiivisuus nousee alussa ja on ensimmäisten sekuntien ajan korkeimmillaan, koska merkkiaine on juuri injektoitu ja se on silloin aktiivisimmillaan. Merkkiaine ei ole vielä levinnyt joka puolelle kehoa, vaan kulkee vasta verenkierrossa ja ajan kuluessa merkkiaineen konsentraatio tasaantuu eri puolille kehoa. Aktiivisuuskäy- rissä ollaan usein kiinnostuneita siitä, kuinka nopeasti ja mihin kehon osaan aktiivi- suus kerääntyy. Sydämen aktiivisuuskäyrä nousee nopeasti, koska sinne merkkiaine kulkeutuu verenkierron kautta ennen kuin se imeytyy esimerkiksi aivoihin. Alussa käytetään lyhyempiä mittausajanjaksoja, jotta saataisiin nämä nopeasti tapahtuvat muutokset talteen, mutta se voi johtaa myös kohinaan. Kohina ilmenee kuvaajissa piikkeinä. Hiiren ja rotan tuloksia ei voi vertailla toisiinsa, koska lajien välillä on liikaa eroja. Lisäksi eri henkilöt ovat tehneet manuaalisen aivoalueiden piirtämisen. Osalle SAPP-ohjelmiston tekemistä arvoista ei löytynyt manuaalisesti piirrettyä vastaparia, mutta taulukossa IV on esitetty kummallakin eläimellä vertaillut aivoalueet sekä niiden englanninkieliset termit. 36 Taulukko IV: Aivoalueet joissa vertailtiin SAPP-ohjelmiston tuottamia ja manuaa- lisesti tehtyjä SUV-arvoja toisiinsa Aivoalueiden nimet Englanninkielinen nimi Hiiri Rotta Kaikki aivoalueet Whole Brain x x Isoaivokuori Neo Cortex x x Aivojen otsalohko Frontal Cortex/Frontal lobe x Päälaen- ja ohimolohko Pariteo-temporal Cortex x Aivojuovio Striatum x Näkökukkula Thalamus x x Hypotalamus Hypothalamus x x Aivosilta Pons x Ydinjatke Medulla x Mantelitumake Amygdala x Keskiaivot Midbrain x Pihtipoimu Cingulate cortex x Pikkuaivot Cerebellum x x Aivoturso Hippocampus x x 3.2.1 Hiiri Kuvassa 15 on kuvan P100292 oikean puolisen hiiren SUV-arvot jokaisessa tau- lukkoon IV hiirelle merkityssä aivoalueessa ajan funktiona. Aivoalueissa on mer- kitty manuaalisesti saadut arvot paksummalla ja tummemmalla viivalla ja SAPP- ohjelmiston tekemät ohuemmalla ja vaaleammalla viivalla. Kuvien aika-akseli on lo- garitminen, koska sillä on helpompi tarkastella SAPP-ohjelmiston ja manuaalisesti tehtyjen kuvaajien eroja. 37 (a) Kaikki aivoalueet (b) Isoaivokuori (c) Aivojen otsalohko (d) Päälaen- ja ohimolohko (e) Aivojuovio (f) Näkökukkula (g) Hypotalamus (h) Pikkuaivot (i) Aivoturso Kuva 15: Kuvan P100292 oikean puolisen hiiren SUV arvot taulukon IV aivoalueissa manuaalisesti sekä SAPP-ohjelmistolla tutkittuina. Manuaalisesti saadut arvot on merkitty tummemmalla ja paksummalla viivalla ja SAPP-ohjelmiston tekemät arvot ohuemmalla ja vaaleammalla. Kuvassa 15a on keskiarvo kaikkien aivoalueiden SUV-arvoista ja SAPP on saa- nut hyvin samanlaisia tuloksia manuaalisesti käsitellyn kuvan kanssa. Kuvassa 15b SAPP-ohjelmiston arvot isoaivokuorella ovat selkeästi noin 0,1 SUV:ia alempana koko ajan, paitsi aivan lopussa. SAPP-ohjelmiston arvot ovat myös tasaisemmat, ei- kä niissä ole yhtä paljon hajontaa eli piikikkyyttä kuin manuaalisissa. Kuvassa 15c 38 SAPP-ohjelmiston arvot aivojen otsalohkosta seuraavat hyvin manuaalisesti saa- tujen arvojen muotoja, mutta manuaalisesti tehdyissä arvoissa on paljon kohinaa. Kuvassa 15d päälaen- ja ohimolohkon SAPP-ohjelmiston arvot ovat selkeästi 0,5-1 SUV:ia pienempiä kuin manuaalisesti saadut arvot. Kuvassa 15e SAPP-ohjelmiston arvot aivojuoviossa ovat samankaltaisia manuaalisten kanssa. Manuaalisissa arvoissa on enemmän kohinaa. Kuvassa 15f SAPP-ohjelmiston arvot näkökukkulassa seuraa- vat hyvin manuaalisia. Alussa manuaalisissa arvoissa on paljon kohinaa, joka näkyy myös SAPP-ohjelmiston arvoissa, mutta paljon pienempänä. Kuvassa 15g hypo- talamuksessa molemmilla kuvaajilla esiintyy paljon kohinaa, eikä kuvaaja muistu- ta onnistunutta aktiivisuuskäyrää. Kuvassa 15h SAPP-ohjelmiston arvot vastaavat pikkuaivoissa hyvin manuaalisesti saatuja arvoja, vaikka kummassakin on kohinaa. Kuvassa 15i SAPP-ohjelmiston ja manuaaliset aivoturson arvot sopivat hyvin yh- teen. Manuaalisissa arvoissa on enemmän hajontaa, mutta ne ovat silti muodoiltaan hyvin samankaltaisia. Hiiren aivot ovat pienet ja PET-laitteiston kyky saada tarkkoja ja vertailukel- poisia tuloksia on koetuksella pienten ROI-alueiden kanssa. Muutamankin pikselin heitto sekä käsin piirrettynä että atlassovituksessa aiheuttaa kohinaa tai aiheetto- man signaalin. Pikkuaivoja 15h ja hypotalamusta 15g lukuun ottamatta SAPP- ohjelmiston saamat arvot ovat alempana kuin manuaalisesti tehdyt. Aivoalueiden ROI:ta on pienennetty malliatlaksesta viisi prosenttia, jotta vältyttäisiin osumasta kallon luihin. Tämä voi kuitenkin haitata oikean signaalin saantia ja on todennä- köinen syy sille, että SAPP-ohjelmiston saamat arvot ovat manuaalisia pienemmät. Pienikin prosentuaalinen vähentäminen jo valmiiksi pienestä alueesta vaikuttaa pal- jon. Rajatumpi atlassovitus ei myöskään ota niin herkästi virheellisiä signaaleja, minkä takia SAPP-ohjelmiston tekemissä kuvaajissa ei ole yhtä paljon kohinaa. On tärkeää yrittää löytää tasapaino, jossa kohina on vähäistä, mutta informaa- tiota olisi mahdollisimman paljon. Kuvassa 15a on vähiten kohinaa ja se näyttää 39 parhaimmalta aktiivisuuskäyrältä, mutta se on keskiarvo kaikkien aivoalueiden ar- voista, jolloin menetetään informaatiota. Yksittäisten aivoalueiden kuvaajissa on enemmän kohinaa, mutta niistä voitaisiin tehdä tutkimusta määrittämällä ajanhet- ki, jolloin aktiivisuus on korkeimmillaan ja kuinka nopeasti se laskee. SAPP seuraa hyvin kaikkia manuaalisia arvoja ja sitä voidaan käyttää tutki- muksessa. Tulosten parantamiseksi olisi kannattavaa tarkastella, onko malliatlasten pienentäminen viidellä prosentilla kannattavaa. On mahdollista, että kuvaajien ko- hina kasvaisi liikaa virheellisten signaalien määrän kasvaessa. Hiirien ROI-alueita voisi myös muokata ja yhdistää lisää, koska selvästi ainakin hypotalamuksesta 15g on vaikea saada kunnollisia arvoja sekä käsin että SAPP-ohjelmistolla. 3.2.2 Rotta Kuvassa 16 on kuvan P131512 vasemmanpuolisen rotan SUV-arvot jokaisessa tau- lukkoon IV rotalle merkityssä aivoalueessa ajan funktiona. Aivoalueissa on mer- kitty manuaalisesti saadut arvot paksummalla ja tummemmalla viivalla ja SAPP- ohjelmiston tekemät ohuemmalla ja vaaleammalla viivalla. Kuvien aika-akseli on lo- garitminen, koska sillä on helpompi tarkastella SAPP-ohjelmiston ja manuaalisesti tehtyjen kuvaajien eroja. 40 (a) Kaikki aivoalueet (b) Isoaivokuori (c) Näkökukkula (d) Hypotalamus (e) Aivosilta (f) Ydinjatke (g) Mantelitumake (h) Keskiaivot (i) Pihtipoimu (j) Pikkuaivot (k) Aivoturso Kuva 16: Kuvan P131512 vasemman puolisen rotan SUV-arvot taulukon IV aivoa- lueissa manuaalisesti sekä SAPP-ohjelmistolla tutkittuina. Manuaalisesti saadut ar- vot on merkitty tummemmalla ja paksummalla viivalla ja SAPP-ohjelmiston teke- mät arvot ohuemmalla ja vaaleammalla. Kuvassa 16j on merkitty erikseen valkea ja harmaa aine ja kuvassa 16k aivoturso eri orientaatioista. 41 Kuvassa 16a on keskiarvo kaikkien aivoalueiden SUV-arvoista ja SAPP on saanut hyvin samanlaisia tuloksia manuaalisesti käsitellyn kuvan kanssa. SAPP-ohjelmiston arvot ovat noin 0,2 SUV:ia korkeammalla, mutta tämä voidaan olettaa osittain ku- vien 16f ja 16j syyksi, koska niissä arvot ovat selvästi manuaalisesti tehtyjä kor- keammalla, mutta kaikki muut seuraavat manuaalisia hyvin. Kuvassa 16b SAPP- ohjelmiston arvot isoaivokuorella seuraavat hyvin manuaalisia. SAPP-ohjelmiston arvoilla on vähemmän kohinaa. Kuvassa 16c SAPP-ohjelmiston arvot näkökukku- lassa vastaavat suurusluokaltaan hyvin manuaalisia. Kohinaa esiintyy yhtä paljon kummallakin. Kuvassa 16d sekä SAPP-ohjelmistolla että manuaalisesti lasketuilla hypotalamuksen arvoilla on paljon kohinaa, mutta SAPP-ohjelmistolla vähemmän. SAPP kuitenkin seuraa manuaalisia arvoja hyvin suuruusluokaltaan. Kuvassa 16e SAPP seuraa hyvin aivosillan manuaalisia arvoja ja sillä esiintyy hieman vähem- män kohinaa. Kuvassa 16f SAPP seuraa manuaalisesti lasketun ydinjatkeen kuvaa- jan muotoja hyvin, mutta on selvästi 1 SUV:ia korkeammalla. Kahden kuvaajan välillä on selvä ero suuruusluokassa. Kuvassa 16g SAPP-ohjelmiston ja manuaali- sesti lasketut arvot ovat hyvin kohdikkain mantelitumakkeessa. SAPP-ohjelmistolla on vähemmän kohinaa. Kuvassa 16h SAPP seuraa äärimmäisen hyvin keskiaivois- sa manuaalisesti laskettuja arvoja. Kuvassa 16i pihtipoimussa on paljon kohinaa molemmilla tehdyissä arvoissa, SAPP-ohjelmiston arvoilla kuitenkin vähemmän ja kuvaajan muoto vastaa hyvin manuaalista. Kuvassa 16j on esitetty manuaalisesti tehdyt arvot sekä SAPP-ohjelmiston laske- mat arvot pikkuaivojen valkeassa ja harmaassa aineessa. Harmaasta aineesta saatu signaali on esitetty yhtenäisenä vaaleampana ja ohuempana viivana ja sen arvo on lähempänä manuaalisesti laskettua, mutta silti 1 SUV:ia korkeammalla manuaalisiin arvoihin verrattuna. Valkeasta aineesta saatu signaali on esitetty ohuempana ja vaa- leana pisteviivana ja sen arvot ovat tuplasti korkeammalla kuin harmaan aineen eli 2 SUV:ia korkeammalla manuaalisiin nähden. Kuvassa 16k on esitetty manuaalisesti 42 tehdyt arvot sekä SAPP-ohjelmiston laskemat arvot aivotursossa eri orientaatioissa piirrettyinä. Yhtenäisellä vaalealla ja ohuemmalla viivalla on merkitty aivoturson ROI-analyysi anterodorsaali puolelta piirrettynä ja vaaleana ja ohuella pisteviival- la posteriori puolelta piirrettynä. Molemmat seuraavat manuaalisesti tehtyjä arvoja hyvin ja kaikilla kohinaa suurin piirtein saman verran. Rotan aivot ovat suuremmat, joten niihin on helpompi saada ROI:t piirrettyä oikein, ja PET-laitteiston tarkkuus on parempi ja luotettavampi. Viiden prosentin pienentäminen ei vaikuta enää niin paljon, että se tekisi SAPP-arvoista huomat- tavasti matalampia manuaalisiin verrattuna. Tämän takia SAPP-ohjelmiston arvot seurasivat manuaalisia arvoja paremmin rotilla kuin hiirillä. Isoaivokuori 16f ja keskiaivot 16h olivat äärimmäisen hyvin manuaalisten arvo- jen mukaisia. SAPP kykeni tutkimaan näitä isompia aivoalueita hyvin, mutta se epäonnistui ydinjatkeen 16f ja pikkuaivojen 16j kohdalla. On kyseenalaista, miten manuaalisesti tehty kuvaaja pikkuaivoista on moninkertaisesti pienempi kuin SAPP- ohjelmiston laskemat arvot pikkuaivoille, kun se on vielä jakanut alueen harmaaseen ja valkeaan. Rotankin tapauksessa on tärkeää löytää tasapaino informaation tarkkuuden ja kohinan välillä. Rotalla on helpompi saada tarkempia tuloksia, mutta ROI-alueita voisi muokata ja yhdistellä, jotta vältytään virhesignaaleilta liian pienten ROI- alueiden takia. 4 Pohdinta SAPP-ohjelmiston työstäminen aloitettiin Linux-pohjaisella koneella ja kuvilla, joi- ta SAPP ei osannut rajata ja käsitellä itsenäisesti. Toisaalta tämä oli hyvä, koska se kannusti jo heti alussa tutustumaan, miten SAPP ajetaan pala palalta. Laaduntar- kastustiedoston korjaaminen oli alussa tärkein tehtävä, koska siitä pystyi näkemään, miten ensimmäinen moduuli toimii. Osa ongelmista oli pieniä ja hankalia löytää, 43 esimerkiksi DICOM-tiedostoilta saattoi puuttua tietoja, joita SAPP ei periaattees- sa tarvitse, mutta ei silti toimi ilman niitä. Jos DICOM-tiedostolla ei ollut otsikkoa (eng. header) sen analysoiminen ei onnistunut, joten se korjattiin niin, että koodi asettaa otsikoksi "CT", jos sillä ei jo ole otsikkoa. SAPP-ohjelmistoa pitäisi kehittää vastaamaan paremmin prekliinisten tutkijoi- den toiveita. Kolmas moduuli tekee parametrisen PET-kuvan tilavuusalkiokohtaista analyysia varten, mutta sitä ei ole vielä tehty SAPP-ohjelmistoon. Koko SAPP- ohjelmistossa on myös edelleen korjattavana perusasioita, jotka jäävät tämän opin- näytetyön ulkopuolelle. NifTI-tyyppiset kuvat ovat korvanneet DICOM-tyyppiset, eikä niitä enää käyte- tä. SAPP-ohjelmistossa on toiminto, joka tarkistaa, ovatko NifTI-tiedostot jo ole- massa, mutta jos SAPP ei ole itse muuttanut DICOM-tiedostoja jokaisen analyy- sikierroksen alussa, analysointi ei onnistu. Ongelmaa yritettiin ratkaista käyttämäl- lä SPM:n sijaan MRIcron [18] kuvankatseluohjelmaa, joka kykeni DICOM-NifTI- muutokseen, mutta se ei auttanut. MRIcron jätettiin kuitenkin vaihtoehtoiseksi ta- vaksi tehdä DICOM-NifTI -muutos, koska se tekee laajemman tiedostokansion, jossa näkyy muun muassa tiedostotyypit. SAPP olisi paljon tehokkaampi, jos sillä pystyisi analysoimaan monta kuvaa pro- jektikansiosta. Alkuperäisissä ohjeissa [1] [16] annetaan ymmärtää, että SAPP on kyennyt käsittelemään monta kuvaa kerralla, jos kaikki ovat samaa lajia ja niille käytetään samoja parametrejä, mutta nyt se suorittaa analyysin väärin ja vain en- simmäiselle kansiolle. Ongelman voisi korjata muuttamalla tiedostorakennetta niin, että SAPP osaisi käydä kansio kerrallaan kuvia läpi, mutta se vaatisi todennäköi- sesti korjauksia kaikissa koodin osissa. Tämä jää kehitysideaksi SAPP-ohjelmiston kanssa seuraavaksi työskentelevälle. SAPP myös luottaa usein tiedostorakenteen olevan tietynlainen, esimerkiksi alus- sa se oletti, että tietty kansio, jota se tarvitsee, on esimerkiksi neljäs alakansio. Jos 44 SAPP-ohjelmiston kanssa työskentelee eri koneella, se voidaan tallentaa eri paik- kaan. Ongelma korjattiin useassa kohdassa niin, että SAPP etsii tietorakenteen po- lusta oikean nimiset tiedostot ja kansiot, jos se ei ole oletetussa kohdassa. Rajaustyökalua korjattiin myös yhden hiirikuvan perusteella rajaamaan reunois- ta hieman enemmän, mutta se voi myös olla haitaksi, kun analysoidaan kuvia, joissa on esimerkiksi rottia tai työskennellään kokonaan eri PET-laitteen kanssa ottamien kuvien kanssa, jolloin koelaitteistoa ei välttämättä näy ja kuva on jo valmiiksi tiu- kasti rajattu. SAPP-ohjelmiston tekemiä analysointeja validoitiin vertailemalla SUV-arvoja manuaalisesti tutkijan piirtämien ROI-alueiden sekä SAPP-ohjelmiston atlasten aset- tamien alueiden välillä. SUV ottaa huomioon kohteen massan, mutta ei lihas- ja rasvakudoksen jakautumista, miten merkkiaine on kertynyt, tai kuinka kauan eri kuvaukset ovat kestäneet. Tutkimusmenetelmät ovat semikvantitatiivisia tuloksia, joita voidaan vertailla, mutta pitää muistaa, että ne ovat arvioituja. 5 Yhteenveto ja johtopäätökset Tämän opinnäytetyön yhteydessä SAPP-ohjelmistossa korjattiin seuraavat asiat. (a) Laaduntarkastustiedoston luomisen ja visuaalisen asettelun ongelmat (b) Ensimmäisen moduulin käyttö Linux- ja Windows-käyttöjärjestelmissä (c) Kahden koe-eläimen välisen rajan tunnistaminen Lisäksi tulokset validoitiin sekä hiirellä että rotalla vertailemalla automaattisesti erotettuja eri aivoalueiden aktiivisuuskäyriä manuaalisesti käsin erotettuihin. Perusosat SAPP-ohjelmistosta saatiin toimimaan ja monen vuoden tauon jäl- keen se onnistuu pieneläinten analysoinnissa, mutta laaja validointi monella erilai- sella projektilla olisi kannattavaa tehdä tulevaisuudessa. Prekliinisen tutkimuksen 45 nopeuttamiseksi ja analysoidun datan vertailtavuuden parantamiseksi on tärkeää, että SAPP saadaan toimivana asennettua Turun prekliinisen tutkimuslaboratorion analysointitietokoneelle. 6 Kiitokset Tämän opinnäytetyön toteuttamisessa auttoivat monet henkilöt. Maria Jaakkola toimi ohjaajana Turun PET-keskuksen puolelta, ja Matti Murtomaa toimi ohjaaja- na fysiikan ja tähtitieteen laitokselta. PET-keskuksen puolelta myös Jarmo Teuho ja Riku Klén edesauttoivat projektin valmistumista. Jatta Helin toimi kytköksenä prekliinisen tutkimuksen puolelle, johon SAPP-ohjelmisto tullaan asentamaan, ja antoi käytettäväksi kuvat P100292 ja ae3127. Kuvan P102949 antoi Anna Roivanen, kuvat P131960 ja P131962 Xiang-Guo Li ja kuvan P131512 Anna Kirjavainen. Essi Kerola aloitti SAPP-ohjelmiston päivittämisen kesällä 2024 ja antoi hyvät ohjeet ja lähtökohdan aloittaa. 46 Viitteet [1] Bocancea, D.-I. Computational pipeline for small animal brain PET/CT image analysis. 2018, [2] MATLAB(R2022a). 2022; https://www.mathworks.com. [3] Hendee, W. R.; Ritenour, E. R. Medical Imaging Physics ; Wiley, 2002. [4] Lorentz, H. A. The principle of relativity; a collection of original memoirs on the special and general theory of relativity ; London : Methuen amp; Co. ltd., 1923. [5] Bailey, D. L.; of Physicists in Medicine, A. A.; Agency, I. A. E. Nuclear medicine physics : a handbook for teachers and students ; International Atomic Energy Agency, 2014. [6] Pandey, G.; Vora, A. Open Electronics for Medical Devices: State-of-Art and Unique Advantages. Electronics 2019, 8, 1256. [7] X-Ray Technology Oxford Instruments; Typical X-ray Spectra by Anode Material. https://xray.oxinst.com/learning/view/article/ typical-x-ray-spectra-by-anode-material, Accessed: 2025-03-20. [8] Laguitton, D.; Parrish, W. Experimental spectral distribution versus Kramers’ law for quantitative X-ray fluorescence by the fundamental parameters method. X-Ray Spectrometry 1977, 6, 201–203. [9] Grieken, R. V., Markowicz, A., Eds. Handbook of X-Ray Spectrometry ; CRC Press, 2001. [10] Mukherjee, P.; Roy, S.; Ghosh, D.; Nandi, S. K. Role of animal models in biomedical research: a review. Laboratory Animal Research 2022, 38, 18. [11] Kuntner, C.; Stout, D. Quantitative preclinical PET imaging: opportunities and challenges. Frontiers in Physics 2014, 2 . [12] Evans, A. C.; Janke, A. L.; Collins, D. L.; Baillet, S. Brain templates and atlases. NeuroImage 2012, 62, 911–922. [13] SPM25. 2025; https://www.fil.ion.ucl.ac.uk/spm/. [14] Rainio, O.; Han, C.; Teuho, J.; Nesterov, S. V.; Oikonen, V.; Piirola, S.; Laiti- nen, T.; Tättäläinen, M.; Knuuti, J.; Klén, R. Carimas: An Extensive Medical Imaging Data Processing Tool for Research. Journal of Digital Imaging 2023, 36, 1885–1893. [15] Ma, Y.; Hof, P.; Grant, S.; Blackband, S.; Bennett, R.; Slatest, L.; McGui- gan, M.; Benveniste, H. A three-dimensional digital atlas database of the adult C57BL/6J mouse brain by magnetic resonance microscopy. Neuroscience 2005, 135, 1203–1215. 47 [16] Bocancea, D.-I. SAPP User Manual ; Preclinical Imaging Laboratory, Turku PET Centre, 2018. [17] Schiffer, W. K.; Mirrione, M. M.; Biegon, A.; Alexoff, D. L.; Patel, V.; Dewey, S. L. Serial microPET measures of the metabolic reaction to a micro- dialysis probe implant. Journal of Neuroscience Methods 2006, 155, 272–284. [18] Rorden, C.; Brett, M. Stereotaxic Display of Brain Lesions. Behavioural Neu- rology 2000, 12 .