Polyfenolien metabolia hyönteisissä Pro gradu -tutkielma Erika Alander Turun yliopisto Luonnonyhdistekemia Toukokuu 2022 TURUN YLIOPISTO Kemian laitos ALANDER, ERIKA: Pro gradu -tutkielma, s. 1–35 Kemia Toukokuu 2021 Turun yliopiston laatujärjestelmän mukaisesti tämän julkaisun alkuperäisyys on tarkastettu Turnitin Originality Check -järjestelmällä. Hyönteisherbivorit metaboloivat kasvien puolustusyhdisteitä monin eri tavoin, mutta metabolian erityispiirteitä ei tunneta hyönteiskunnassa kovinkaan hyvin. Tässä työssä kehitettiin globaaliin käyttöön kvantitatiivinen MetaboKIT-työkalu, jonka avulla voidaan profiloida satojen hyönteislajien polyfenolimetaboliaa kahdeksan malliyhdisteen avulla. Yhdisteille ja niiden metaboliiteille kehitettiin herkät UHPLC-MS/MS menetelmät kahdella eri massaspektrometrilla ja yhdisteiden metaboliaa tutkittiin 11 eri pH:ssa kineettisten mittausten avulla. Lisäksi kehitettiin tapa, jolla hyönteisen suolen pH voidaan mallintaa malliyhdisteiden metaboliaa tuntemalla. Valmiin MetaboKIT-työkalun toimivuus testattiin lopuksi neljän hyönteislajin avulla. Valmis MetaboKIT-työkalu mahdollisti hyönteisten suolen pH:n arvioinnin vertaamalla kasviravinnon ja ulostenäytteen kahveoyylikviinihappoisomeerien määriä toisiinsa; mitä korkeampi pH, sitä pidemmälle isomerisaatio oli edennyt. Tutkimalla malliyhdisteiden metaboliaa ko. pH:ssa in vitro ja vertaamalla sitä yhdisteiden todelliseen metaboliaan in vivo, oli mahdollista päätellä, kuinka merkittävä rooli pH:lla oli erityyppisten yhdisteiden hapettumisessa ja hydrolyysin tai depolymerisaation kautta tapahtuneessa hajoamisessa. Metaboliittiprofiilieroista voitiin alustavasti päätellä, millaisia yhdisteitä todennäköisimmin oli siirtynyt suolesta esimerkiksi hemolymfan puolelle, tai jos tutkitulla hyönteislajilla oli mahdollisesti jokin muu poikkeuksellinen kyky käsitellä tietyn tyyppisiä malliyhdisteitä. Asiasanat: herbivori, polyfenoli, metabolia Sisällysluettelo 1. Johdanto ........................................................................................................................ 1 1.1 Polyfenolien metabolia hyönteisissä ....................................................................... 1 1.2 Hyönteisherbivorien ruuansulatuskanavan pH ja polyfenolien hapettuminen........ 2 1.3 Polyfenolien hapettuminen entsymaattisesti ........................................................... 3 1.4 Polyfenolien hydrolyysi ja depolymerisaatio .......................................................... 4 1.5 Polyfenolien konjugaatioreaktiot ............................................................................ 5 1.6 Polyfenolien metabolian tutkimiseen käytetyt menetelmät .................................... 6 1.7 Tutkimuksen tavoitteet ............................................................................................ 7 2. Materiaalit ja menetelmät .............................................................................................. 7 2.1 Kemikaalit ............................................................................................................... 7 2.2 UPLC-MS/MS menetelmät ..................................................................................... 8 2.3 Puhtaat malliyhdisteet ............................................................................................. 9 2.3.1 Yhdisteiden puhdistus Sephadex LH-20 geelikromatografialla .................... 10 2.3.2 Yhdisteiden puhdistus preparatiivisella ja semipreparatiivisella HPLC:llä ... 11 2.4 MRM -menetelmän luominen UPLC-MS/MS:lle ................................................. 12 2.5 Klorogeenihapon isomerisaatioasteen määritys .................................................... 13 2.6 Kineettiset mittaukset ............................................................................................ 14 2.7 Hyönteiskokeet ...................................................................................................... 15 2.7.1 Näyteputkien valmistus .................................................................................. 15 2.7.2 Toukkien syöttäminen ja näytteiden keräys ................................................... 16 2.8 MetaboKIT työkalun lopullinen testaaminen........................................................ 16 3.Tulokset ........................................................................................................................ 17 3.1 Malliyhdisteiden puhtaus ...................................................................................... 17 3.2 Metaboliitit ............................................................................................................ 19 3.3 pH-mallinnus ......................................................................................................... 20 3.5 MetaboKIT -työkalun lopullinen testaaminen ...................................................... 25 4. Tulosten tarkastelu ...................................................................................................... 32 5. Johtopäätökset ............................................................................................................. 34 6. Viitteet ......................................................................................................................... 35 1 1. Johdanto 1.1 Polyfenolien metabolia hyönteisissä Kasvit tuottavat erilaisia yhdisteitä puolustusyhdisteikseen. Nämä puolustusyhdisteet ovat erikoistuneita metaboliitteja, jotka mahdollistavat kasvin puolustautumisen ulkoisia tekijöitä, kuten hyönteisherbivoreja vastaan. Kasvin puolustusyhdisteinä toimivat esimerkiksi polyfenolit. Erilaisia polyfenoleita ovat hydrolysoituvat tanniinit, kondensoituneet tanniinit, flavonoidit ja kahvihappojohdannaiset. Kasvien polyfenolit voivat muokkautua hyönteisherbivorien metaboliassa monella eri tavalla. Hyönteisen suolessa on erilaisia vaikuttavia tekijöitä, jotka voivat vaikuttaa yhdisteiden muokkaantumiseen, kuten pH ja eri ruuansulatusentsyymit. Muokkaamalla ravinnon yhdisteitä hyönteinen pystyy hyödyntämään tarvittavia yhdisteitä omissa soluissaan ja muokkaamaan haitalliset yhdisteet haitattomiksi ja poistamaan nämä yhdisteet ruuansulatuksestaan. Hyönteisen suolisto koostuu kolmesta osasta. Ruuansulatus alkaa ensimmäisessä osassa eli etusuolessa. Keskisuoli on toinen osa, jossa pääsääntöisesti tapahtuu koko ruuansulatus, ravinnon yhdisteet muokkaantuvat ja ravintoaineet voivat imeytyä hemolymfan puolelle. Kolmas hyönteisen osa on takasuoli, jossa hyönteisen uloste muodostuu ja yhdisteet poistetaan hyönteisen suolesta. Hyönteiset ovat kehittyneet evolutiivisesti, jonka vuoksi osalla hyönteislajeista on erilaisia kykyjä toimia kasvien puolustusyhdisteitä vastaan. Näitä ovat esimerkiksi hyönteisten taipumus välttää tiettyjä kasveja tai kasvinosia, joissa on paljon puolustusyhdisteitä.1 Tai kyky syödä ravinnokseen haitallisiakin puolustusyhdisteitä.2 Lisäksi osa hyönteisistä pystyy eristämään puolustusyhdisteitä kudokseensa, jotta ne välttäisivät yhdisteistä johtuvan myrkytyksen, mutta lisäksi voivat käyttää näitä yhdisteitä hyödykseen esimerkiksi hyönteisen muita vihollisia vastaan.3 Esimerkiksi sahapistiäisen tiedetään varastoivan ravinnon puolustusyhdisteitä hemolymfaan ja käyttävän niitä muurahaisia vastaan.4 Näiden kykyjen lisäksi yleisin tapa, mitä hyönteiset käyttävät kasvipuolustusyhdisteitä vastaan, on kolmivaiheinen prosessi, jossa hyönteinen muokkaa yhdisteet metaboliiteiksi. Ensimmäisessä vaiheessa hyönteinen muokkaa kasvin puolustusyhdisteitä hapetuksen, pelkistyksen ja hydrolyysin avulla. Jos ensimmäinen vaihe ei riitä, voi hyönteinen 2 muokata yhdisteitä vielä toisessa vaiheessa. Toisen vaiheen reaktiot ovat konjugaatioreaktiota esimerkiksi sokeriyksikön kanssa. Kolmas vaihe on kuonaneritys hyönteisen suolesta.5 Näiden reaktioiden lisäksi aiemmissa tutkimuksissa on huomattu, että yhdisteet voivat myös isomerisoitua suolessa.6 Mutta vasta vähän on tutkittu, miten hyönteiset käsittelevät kasvien puolustusyhdisteitä ja mitä eri metaboliitteja hyönteinen voi tuottaa metaboliassaan. Lisäksi monimutkaiset kasvihyönteisvuorovaikutukset eivät ole kovin hyvin tunnettuja ennestään. 1.2 Hyönteisherbivorien ruuansulatuskanavan pH ja polyfenolien hapettuminen Eri hyönteislajeilla ja –lahkoilla metabolia ja siihen liittyvät olosuhteet, kuten suolen pH, ovat erilaisia. Hyönteisen suolen pH voi vaihdella 6.0–11.8 välillä. Korkea pH suolessa on tärkeänä tekijänä useassa metaboliareaktiossa, jotka vaikuttavat organismien protoniaktiivisuuteen.7 Suolen pH:n aiheuttamia reaktioita ovat esimerkiksi yhdisteiden hapettuminen hyönteisen metaboliassa.8 Hapettuminen on tärkeä reaktio hyönteisen suolessa. Polyfenolien hapettumista emäksisessä ympäristössä on tutkittu in vitro ja in vivo, ja tuloksien on huomattu olevan monesti samanlaisia. Suolen pH edistää tiettyjen yhdisteiden auto-oksidaatiota, sekä haitallisten metaboliittien muodostumista.9 Polyfenolien hapetustuotteet voivat aiheuttaa oksidatiivista stressiä hyönteisille.10 Yhdisteiden hapettuminen hapellisessa ympäristössä muodostaa haitallisia ja reaktiivisia happiyhdisteitä, ns. ROS-yhdisteitä (reactive oxygen species). ROS-yhdisteet ovat solukalvolle haitallisia vapaita happiradikaaleja ja niiden on todettu aiheuttavan vaurioita hyönteisen suolen epiteelikudokseen, lipideihin, proteiineihin ja DNA:han.9,11 Hyönteiset voivat suojautua happiradikaaleja vastaan antioksidanttimekanismillaan, sillä ROS- yhdisteet neutralisoituvat, kun antioksidantti luovuttaa elektronin.12 Hyönteisen suolessa on yhdisteitä, jotka toimivat antioksidantteina, mutta myös osa hyönteisen ravinnon yhdisteistä, kuten esimerkiksi C-vitamiini, voi toimia antioksidantteina radikaaleja vastaan.13,14 Hyönteisen suolessa osa yhdisteryhmistä on herkkiä hapettumiselle, kun taas osaan yhdisteistä pH ei vaikuta.10 Tanniinit ovat yhdisteryhmä, jotka helposti auto-oksidoituvat hyönteisen suolessa.9,15 Hydrolysoituvien ja kondensoituneiden tanniinien hapettumista emäksisen pH:n vaikutuksesta on tutkittu in vitro ja in vivo. Osa hydrolysoituvista tanniineista hapettuu pH:n vaikutuksesta hyönteisen metaboliassa.9,10,16 Tämän lisäksi myös tietyt kondensoituneet tanniinit voivat hapettua pH:n vaikutuksesta. Flavonoidien 3 hapettuminen on harvinaisempaa, mutta flavonoidit, joiden rakenteessa on B-renkaassa kolme OH-ryhmää voivat hapettua. Näiden lisäksi kahvihappojohdannaisetkin voivat hapettua hyönteisen suolessa.6 Koska hyönteisen suolen pH voi vaikuttaa moneen eri reaktioon hyönteisen metaboliassa halutaan sitä myös mitata mahdollisimman tarkasti. Tätä varten on kehitetty uusi menetelmä, jonka avulla voidaan selvittää hyönteisen suolen pH:ta kahvihappojohdannaisten avulla. Aikaisemmin hyönteisen suolen pH:ta on mitattu pH- indikaattoripaperilla tai mikroelektrodeilla (pH mittari) suoraan hyönteisestä.9,17 Uusi menetelmä perustuu klorogeenihapon isomerisaatioon. Metodia on testattu tähän mennessä in vitro ja viidellä eri hyönteislajilla. Hyönteisen ulosteesta voidaan mitata klorogeenihapon kolmen eri isomeerin suhdetta, jonka avulla voidaan siten päätellä hyönteisen suolen pH, kun isomeerejä muodostuu tietyssä pH:ssa tietyssä tunnetussa suhteessa toisiinsa.15 1.3 Polyfenolien hapettuminen entsymaattisesti Hyönteisen suolessa yhdisteet voivat hapettua pH:n lisäksi entsyymien vaikutuksesta.18 Entsyymit, jotka voivat hapettaa yhdisteitä hyönteisen suolessa ovat mikrosomaalisia sytokromi P450 mono-oksigenaaseja (CYP-entsyymi).18 Näitä entsyymejä löytyy laajasti mm. nisäkkäistä, hyönteisistä, linnuista, kaloista ja bakteereista. Sytokromi P450 entsyymit sijaitsevat eukaryoottisolun solulimakalvostossa. P450-järjestelmä koostuu kolmesta osasta. CYP-entsyymin lisäksi järjestelmään kuuluu molekulaarinen happi ja elektroneja siirtävä NADPH-sytokromi P450-reduktaasi.19 Kaikki yksityiskohdat sytokromi P450 toiminnasta ei ole täysin selvillä, mutta sitä tiedetään löytyvän useissa eri muodoissa. Sen monimuotoisuuden vuoksi sytokromi P450 pystyy hapettamaan useiden yhdisteiden funktionaalisia ryhmiä, kuten flavonoidien, klorogeenihapon, kumariinien, glukosinolaattien ja lipofiilisten polyfenoliyhdisteiden.18,20,21 Sytokromi P450 esiintyy hyönteisen keskisuolessa. Yleisesti mitään hyönteisen entsyymeistä ei esiinny kuin pienissä määrissä valmiiksi, kunnes hyönteisen suolistoon tulee haitallisia yhdisteitä, milloin entsyymien aktiivisuus lisääntyy.22 Samoin käyttäytyy P450 entsyymi, jonka turhaan irtoaminen tuottaa haitallisia happiyhdisteitä.20 Hyönteinen voi myös aiheuttaa kasvien polyfenolien entsymaattista hapettumista syödessään kasvia, jolloin kasvin polyfenolit esiintyvät valmiiksi hapettuneina suolessa. Kasveissa esiintyy polyfenoli-oksidaasi entsyymiä (PPO), joka aktivoituu kasvin 4 altistuessa ulkoiselle stressitekijälle, kuten hyönteisille tai UV-valolle. Aktivoituessaan PPO entsyymi hapettaa kasvin polyfenoleita ja muodostaa kinoneita (Kuva 1).23 Kuva 1. Polyfenolien hapettumisreaktio. R kuvaa polyfenolien funktionaalista ryhmää. 1.4 Polyfenolien hydrolyysi ja depolymerisaatio Ensimmäisessä vaiheessa hyönteisten metaboliassa hapetuksen lisäksi tapahtuu hydrolyysiä ja depolymerisaatiota. Polyfenolien hydrolyysi ja depolymerisaatio voivat tapahtua hyönteisen suolessa eri yhdisteryhmille. Mitkä yhdisteet hajoavat näiden reaktioiden kautta riippuu tekijöistä, kuten suolen olosuhteista, yhdisteen rakenteesta ja entsymaattisesta aktiivisuudesta.24 Hydrolyysi on hapetusreaktion lisäksi tärkeä haitallisten yhdisteiden detoksifiointimenetelmä hyönteisen suolessa. Haitalliset yhdisteet voivat hydrolysoitua hyönteisen metaboliassa ilman entsyymejä tai entsyymien avulla. Hydrolyyttiset entsyymit vaikuttavat etenkin yhdisteiden esteri- ja amidisidoksiin.19 Yleisemmin hydrolyysi tapahtuu ilman entsyymejä, jolloin hydrolyysiin vaikuttavat tekijät ovat suolen pH, hapetuspotentiaali ja pinta-aktiiviset aineet.16 Hydrolysoivia entsyymejä tiedetään löytyvän myös hyönteisten lisäksi kasveista.25 Nämä hyönteisen metaboliassa hydrolysoivat entsyymit ovat nimeltään karboksyyliesteraaseja. Sen avulla hyönteinen pystyy hydrolysoimaan esimerkiksi haitallisia estereitä vesiliukoisiksi yhdisteiksi, jotka poistuvat soluista nopeammin. Yhdisteryhmien välillä on eroja hydrolyysin suhteen. Osa yhdisteryhmistä ei hydrolysoidu ollenkaan, toiset hydrolysoituvat huonosti ja toiset paremmin. Esimerkiksi tiettyjen yhdisteiden monomeerit hydrolysoituvat helpommin kuin polymeerit.24 Tutkituin hydrolyysireaktio hyönteisen suolessa on hydrolysoituvien tanniinien hydrolyysi. Ne hydrolysoituvat pH:n, sekä mahdollisesti esteraasin vaikutuksesta muodostaen gallus- ja/tai ellagihappoa (Kuva 2).10 Hydrolysoituvien taniinien lisäksi kondensoituneet taniinit voivat hydrolysoitua suolessa. Kondensoituneet taniinit depolymerisoituvat kuitenkin hieman huonommin kuin hydrolysoituvat tanniinit.24 Tanniinien hydrolysoitumista pidetään tärkeänä detoksifiointireaktiona hyönteisen 5 suolessa.16,26 Muissa yhdisteryhmissä, flavonoideissa ja kahvihappojohdannaisissa ei tiedettävästi tapahdu hydrolyysiä. Kuva 2. Polyfenolien hydrolyysireaktio, jossa hydrolysoituva tanniini, tetragalloyyliglukoosi, hajoaa sokeriksi ja gallushapoksi. 1.5 Polyfenolien konjugaatioreaktiot Polyfenolien konjugaatioreaktiot tapahtuvat hyönteisen metabolian toisessa vaiheessa hyönteisen hapetettua tai hydrolysoitua yhdisteet. Hyönteinen konjugoi yhdisteitä lisätäkseen yhdisteiden vesiliukoisuutta ja helpommin poistettavuutta, sekä vähentääkseen niiden haitallisuutta.18,24,27 Lisäksi hyönteinen voi mahdollisesti konjugoida yhdisteitä ja varastoida ne myöhempää käyttöä varten metaboliassa.28 Hyönteisissä voi tapahtua kolmea erilaista konjugaatiota. Tyypin 1 konjugaatioreaktiot vaativat funktionaaliseksi ryhmäksi OH, NH2, COOH tai SH, milloin voi tapahtua glukoosin, sulfaatin tai fosfaatin konjugointi. Tyypin 2 reaktiot vaativat COOH-ryhmän, jotta aminohappo voi konjugoitua rakenteeseen. Lisäksi tyypin 3 reaktiot vaativat halogeenin, alkeenin, NO2-ryhmän, epoksidin, eetterin tai esterin glutationin konjugaatioon.18 Näistä konjugointireaktioista ainoastaan tyypin 1 reaktioiden tiedetään tapahtuvan polyfenoleille. Konjugoidakseen yhdisteitä hyönteisen suolessa on erilaisia konjugoivia entsyymejä. Yleisin hyönteisissä esiintyvä polyfenoleja konjugoiva entsyymi on UDP- glukosyylitransferaasi. Tämän lisäksi osassa hyönteislajeissa tiedetään esiintyvän myös UDP-galaktosyylitransferaasia.29 Näistä UDP-glukosyylitransferaasi liittää polyfenolin rakenteeseen glukoosin ja UDP-galaktosyylitransferaasi galaktoosin. Entsyymit toimivat 6 katalysoiden reaktiota, jossa UDP-glukoosin luovuttama sokeriyksikkö liittyy yleensä rasvaliukoiseen polyfenoliin, jotka muuttuvat näin helpommin poistettaviksi.27 Tutkittaessa hyönteisiä, glykosylaation on huomattu olevan tärkeä konjugaatioreaktio hyönteisen metaboliassa flavonoideja vastaan. Hyönteiset voivat glykosyloida haitallisia rasvaliukoisia flavonoideja liittämällä niihin sokeriyksiön, jolloin niistä tulee vesiliukoisia (Kuva 3).6,30,31 Harvinaisempi galaktoosin liittyminen voi tapahtua myös flavonoideihin.29 Rasvaliukoiset flavonoidiaglykonit hyönteinen detoksifioi glykosylaatiolla metaboliassaan.32 Mutta hyönteinen ei glykosyloi kaikkia flavonoidiaglykoneja. Tutkimuksissa on huomattu, että vain noin 22 % aglykoneista glykosyloituu.6 Hyönteinen pystyy myös rakentamaan flavonolioligoglykosideja metaboliassaan. Näiden uskotaan rakentuvan flavonolimonoglykosideista metaboliassa.33 Flavonoidien lisäksi glykosylaatiota voi tapahtua kumariinihappojohdannaisissa.34 Tanniineissa tai kahvihappojohdannaisissa ei ole havaittu tapahtuvan konjugaatioreaktioita. Kuva 3. Polyfenolien glykosylaatioreaktio. 1.6 Polyfenolien metabolian tutkimiseen käytetyt menetelmät Hyönteisen suolessa tapahtuvat reaktiot muokkaavat ravinnon polyfenoleja monella eri tavalla. Polyfenolien metaboloituessa muodostuu useita erilaisia metaboliitteja. Polyfenolien muodostamia uusia metaboliitteja ei tunneta kovin hyvin ennestään. Suolen metaboliaa ja siellä vaikuttavia tekijöitä voidaan tutkia monin eri tavoin. Polyfenolien metaboliaa tutkiessa voidaan keskittyä suolen olosuhteiden vaikutukseen eli pH- asteeseen ja entsyymeihin. Tai voidaan suoraan tutkia mitä hyönteisen syömille yhdisteille on tapahtunut suolessa. Polyfenolien metaboliaa voidaan tutkia in vitro tai in vivo. In vitro tutkimisella voidaan selvittää esimerkiksi, miten yhdisteet käyttäytyvät eri pH-asteissa, entsyymin vaikutuksesta, tai yhdisteiden aktiivisuuksia. Kuten aiemmin mainittiin, hyönteisen 7 suolen pH:ta on voitu tutkia mittaamalla indikaattoripaperilla tai pH-mittarilla, mutta uusin menetelmä perustuu klorogeenihapon isomerisaatiosuhteen seuraamiseen in vivo. Tämän menetelmän luomiseen on rakennettu malleja, tutkien ensin klorogeenihapon isomerisaatiota eri pH-asteissa in vitro. Samalla tavalla voidaan tutkia polyfenolien käyttäytymistä entsyymien kanssa. Polyfenolien aktiivisuutta voidaan mitata esimerkiksi erilaisilla kuoppalevymittauksilla. Kuoppalevymittauksilla voidaan mitata kokonaisfenolipitoisuutta15,35, oksidatiivista aktiivisuutta10 tai proteiininsitomiskykyä35. Näillä in vitro mittauksilla voidaan ennustaa polyfenolien käyttäytymistä hyönteisen suolessa, jonka jälkeen voidaan tutkia, miten polyfenolit käyttäytyvät in vivo. In vivo mittauksissa usein käytetään hyönteisen isäntäkasvia ja sen polyfenoleja, joita seurataan metaboliassa. Isäntäkasvin polyfenolien metaboliaa voidaan tutkia keräämällä hyönteisen uloste näytteeksi ja/tai itse hyönteinen.6,36 Analysoimalla hyönteinen ja/tai sen uloste isäntäkasvin lisäksi saadaan selville isäntäkasvin polyfenolien metaboliatuotteet. Lisäksi hyönteisen metaboliaa on aiemmin tutkittu käyttämällä 14C- leimattua yhdistettä, jolloin radioaktiivisuutta seuraamalla voidaan tutkia tietyn polyfenolin metaboliaa mm. suolessa.26 1.7 Tutkimuksen tavoitteet Tutkimuksessa käytettiin polyfenolien metabolian tutkimiseen kahdeksaa mallipolyfenoliyhdistettä, joiden metaboliaa tutkittiin ensin in vitro luomalla klorogeenihapon avulla pH-mallinnus uudella menetelmällä15, sekä selvittämällä niiden käyttäytymistä eri pH-asteissa 9.0–11.0 välillä. Lopuksi selvitettiin seitsemän isäntäkasvin ja neljän hyönteislajin avulla polyfenolien todellinen metabolia in vivo käyttämällä näytteinä isäntäkasvia, hyönteisen ulostetta ja hyönteistä. Näiden menetelmien avulla rakennettiin MetaboKIT työkalu, jolla voidaan tutkia ja mallintaa kasvihyönteisvuorovaikutuksia ympäri maailmaa. 2. Materiaalit ja menetelmät 2.1 Kemikaalit Vesi oli puhdistettu Millipore Synergy UV (Merck KGaA, Saksa) vedenpuhdistuslaitteella. Uutettaessa ja Sephadex LH-20 geelikromatografiassa käytettiin asetonia (analyyttinen laatu, VWR, Ranska). Sephadex LH-20:ssa käytettiin 8 myös metanolia (analyyttinen laatu, VWR, Ranska). Vihreä tee oli Pirkan vihreää pussiteetä. Oenotheiini B oli aiemmin tutkimusryhmässä valmistettu puhdasaine. 3 mM HCl-liuos valmistettiin 34 % NORMATOM® vetykloridista (VWR, Belgia). 3 mM HCl- liuokseen tehdyn 8 % asetonitriili-liuos pohjana oli myös preparatiivisessa HPLC:ssä käytetty analyyttisen laadun asetonitriiliä (Sigma-Aldrich, Ranska). Preparatiivisessa HPLC:ssä käytettiin HPLC metanolia (VWR, Ranska). Puskuriliuosten valmistukseen käytettiin vedetöntä Na2CO3:a (VWR, Belgia) ja NaHCO3:a (Merck, Germany). 0,4–0,8 % HCOOH pH-ajoihin valmistettiin AnalaR NORMAPUR 99–100 % haposta (VWR, Ranska). Näytteille käytettiin analyyttisen laadun etanolia (ALTIA Oyj, Suomi). Massaspektrometreillä käytettiin muurahaishappoa (HCOOH) (Sigma-Aldrich, Saksa) ja LC-MS Chromasolv asetonitriilia (ACN) (Sigma-Aldrich, Saksa). 2.2 UPLC-MS/MS menetelmät Tutkimuksessa käytettiin kahta eri massaspektrometrilaitteistoa. Laitteistot olivat Xevo kolmoiskvadrupolimassaspektrometrilaite (Waters Corp., Yhdysvallat), johon oli liitetty Acquity UPLC (Waters Corp., Yhdysvallat), sekä kvadrupoli-Orbitrap massaspektrometri, joka koostui Acquity UPLC (Waters Corp., Yhdysvallat) laitteistosta, johon oli liitetty Q ExactiveTM kvadrupoli-Orbitrap massaspektrometri (Thermo Fisher Scientific GmbH, Germany). Kolonneina mittauksissa käytettiin myös kahta eri kolonnia, lyhyttä ja pitkää. Lyhyenä kolonnina toimi Acquity UPLC BEH Phenyl 1.7 µm, 2.1 x 30 mm kolonni (Waters, Irlanti), sekä pitkänä kolonnina Acquity UPLC BEH Phenyl 1.7 μm, 2.1 × 100 mm (Waters, Irlanti). Lyhyellä kolonnilla eluenttien virtausnopeutena käytettiin 0,65 ml/min ja pitkällä kolonnilla 0,5 ml/min. Eluentteina mittauksissa käytettiin asetonitriiliä (A) ja 0,1 % HCOOH:ta (B). Analyysimenetelmä 1. Menetelmässä käytettiin 100 mm kolonnia ja gradienttiohjelmana: 0–0,5 min 0,1 % A, 0,5–5,0 min 0,1–30 % A (lineaarinen gradientti), 5,0–6,0 min 35–90 % A (lineaarinen gradientti), 6,0–9,5 min kolonnin pesu ja stabilisointi. Analyysimenetelmä 2. Menetelmässä käytettiin 100 mm kolonnia ja gradienttiohjelmana oli: 0,0–3,2 min 0,1 % A, 3,2–3,3 min 0,1–19 % A (lineaarinen gradientti), 3,3–3,8min 19–90 % A (lineaarinen gradientti), 3,8–5,2 min kolonnin pesu ja stabilisointi. 9 Analyysimenetelmä 3. Menetelmässä käytettiin 30 mm kolonnia ja gradienttiohjelmana oli: 0–0,1 min 1 % A, 0,1–3,8 min 1–33 % A (lineaarinen gradientti), 3,8–3,9 min 33–90 % A (lineaarinen gradientti), 3,9–5,0 min kolonnin pesu ja stabilisointi. Malliyhdisteseosten mittaamiseen käytettiin osaluuppi-injektointia (PLNO, partial loop needle overfill), jolla voitiin mitata standardille laimennossarjasuorat jokaiselle mittauspäivälle. Ensimmäinen injektio oli aina standardin laimennossarjan laimein piste, joka injektoitiin PLNO:lla eli UPLC-laitteen näytteenkäsittelijä injektoi 2 µl. Toinen ja kolmas piste saatiin mittaamalla 3 µl ja 4 µl PLNO:lla. Viimeinen piste mitattiin injektoimalla standardiseosta täydellä silmukalla eli 5 µl. 2.3 Puhtaat malliyhdisteet Malliyhdisteet, klorogeenihappo, prosyanidiini B2, akasetiini, kemferidi ja kversetiini-3- O-glukosidi olivat kaupallisesti hankittuja. Lisäksi klorogeenihapon isomeerit, neoklorogeenihappo (3-CQA) ja kryptoklorogeenihappo (4-CQA), olivat myös kaupallisesti hankittuja. Puhtaista malliyhdisteistä pentagalloyyliglukoosi (PGG) ja epigallokatekiinigallaatti (EGCG) puhdistettiin Sephadex LH-20 geelikromatografiapylväällä, sekä preparatiivisella ja semipreparatiivisella HPLC-DAD systeemillä.37 Nämä yhdisteet (Kuva 4) valittiin tutkimukseen, koska jokaisella niistä on jokin ominaisuus, jonka avulla voidaan tutkia tiettyä osa-aluetta hyönteisen polyfenolimetabo- liassa. Klorogeenihapon isomerisaatioasteen avulla voidaan määrittää hyönteisen suolen pH.15 Kverstiiini-3-O-glukosidi on vesiliukoinen ja hyönteisen metaboliassa siihen voi liittyä lisää sokeriyksikköjä, mikä kertoo hyönteisen metaboliassa tapahtuvasta glykosylaatiosta. Akasetiini ja kemferidi ovat rasvaliukoisia yhdisteitä, jotka voivat saada rakenteeseensa sokeriyksikön hyönteisen metaboliassa, jolloin niistä tulee vesiliukoisia. Prosyanidiini B2 on PCPC-dimeeri ja EGCG on flavan-3-oli, johon on liittynyt galloyy- liryhmä. Nämä yhdisteet havainnoivat proantosyanidiinien metaboliaa hyönteisessä. Oenotheiini B ja PGG ovat hydrolysoituvia tanniineja. Näistä oenotheiini B on stabiilimpi 10 ja PGG hydrolysoituu helpommin. Kuva 4. Kahdeksan mallipolyfenoliyhdistettä: (1) klorogeenihappo, (2) akasetiini, (3) kversetiini- 3-O-glukosidi, (4) kemferidi, (5) prosyanidiini B2, (6) oenotheiini B, (7) pentagalloyyliglukoosi, (8) epigallokatekiinigallaatti. 2.3.1 Yhdisteiden puhdistus Sephadex LH-20 geelikromatografialla Vihreää teetä uutettiin 60 g 800 ml:ssa asetoni/vesi (80/20, v/v) liuosta yön yli tasoravistelijassa 4°C:ssa. Uute imusuodatettiin ja ensimmäisestä uutteesta pyöröhaihdutettiin asetoni pois, jonka jälkeen uute imusuodatettiin uudestaan ja kylmäkuivattiin. Vihreää teetä uutettiin samoin vielä neljä kertaa ja kaikki uutteet käsiteltiin samoin. Uutteiden yhdistekoostumukset tarkistettiin UHPLC-MS/MS:llä ja jatkopuhdistuksiin valittiin ensimmäinen uute, joka sisälsi eniten haluttua EGCG:tä. Kuivaa PGG:tä liuotettiin 7,49 g 30 ml 50 % metanolin vesiliuosta. PGG liuos lisättiin Sephadex LH-20 geelikromatografia pylvääseen. Fraktioita kerättiin 300–500 ml seuraavasti: kaksi fraktiota 50 % MeOH:lla ja 65 fraktiota 30 % asetoni. Trigalloyyliglukoosia (triGG), tetragalloyyliglukoosia (tetraGG), PGG:tä ja 11 heksagalloyyliglukoosia (heksaGG) seurattiin ottamalla fraktioista näytteitä ja analysoimalla ne Xevo massaspektrometrilla. Samankaltaiset fraktiot yhdistettiin. Yhdistetyistä fraktioista pyöröhaihdutettiin asetoni, jonka jälkeen fraktiot kylmäkuivattiin. Taulukko 1. TriGG:n, tetraGG:n ja PGG:n punnitustulokset kylmäkuivauksen jälkeen. yhdiste fraktiot massat (mg) kokonaismassat (mg) TriGG 10–11 1,5 1,5 TetraGG 15–17, 18–19 400, 700 1100 PGG 20–23, 29–32, 33–36, 37–44, 45–50, 51–52, 53–57, 58–59, 60–65 1277, 600, 570, 800, 400, 87, 87, 28, 27 3876 Teeuutetta liuotettiin 6,07 g 50 ml vettä. Vihreästä teestä puhdistettiin samalla tavalla EGCG:tä Sephadex LH-20 geelikromatografialla. Fraktioita kerättiin 500 ml seuraavasti: seitsemän fraktiota vedellä, viisi fraktiota 10 % MeOH:lla, kuusi fraktiota 20 % MeOH:lla, viisi fraktiota 30 % MeOH:lla, kuusi fraktiota 40 % MeOH:lla, yksi fraktio 50 % MeOH:lla ja kymmenen fraktiota 70 % MeOH:lla. EGCG:n puhdistusta seurattiin Xevo massaspektrometrillä, jonka perusteella EGCG:tä sisältävät fraktiot olivat 70 % MeOH:lla otetut fraktiot, jotka valittiin jatkopuhdistukseen (Taulukko 2) EGCG fraktioista pyöröhaihdutettiin metanoli ja fraktiot kylmäkuivattiin. Taulukko 2. Jatko puhdistukseen, joka suoritetaan preparatiivisella HPLC:llä, valittujen vihreän teen fraktioiden punnitustulokset. fraktiot 2 3 4 5 6 7 massat (mg) 144,6 121,5 536,0 573,3 66,5 22,7 2.3.2 Yhdisteiden puhdistus preparatiivisella ja semipreparatiivisella HPLC:llä Vihreän teen Sephadex LH-20 -fraktioista jo lähes puhtaat fraktiot, fraktiot 4 ja 5, puhdistettiin preparatiivisella HPLC:llä. HPLC laitteisto koostui Waters 2535 Quaternary Gradient yksiköstä, johon oli liitetty Waters 2998 DAD. Fraktioiden kerääminen tapahtui automaattisella Waters Fraction Collector III kerääjällä 10 ml koeputkiin. Ajossa käytetyt liuokset olivat 14 % metanoli ja 1 % muurahaishapon vesiliuos, sekä virtausnopeus oli 8 ml/min. Erotuskolonni (30 cm x 2,5 cm) oli pakattu LiChroprep RP-18:lla (40–63 μm, 12 Merck KGaA, Darmstadt, Germany). Kerättyjen fraktioiden yhdistekoostumus tarkistettiin Xevo massaspektrometrilla. Puhdistetuista ja kerätyistä fraktioista yhdistettiin fraktiot, jotka olivat yhtä puhtaita. Tämän jälkeen fraktioista pyöröhaihdutettiin metanoli pois ja ne kylmäkuivattiin. Vihreän teen fraktiot 2, 3, 6 ja 7 puhdistettiin semipreparatiivisella HPLC:llä. Laitteisto oli muuten sama kuin preparatiivisessa HPLC:ssä, mutta kolonnina oli Gemini® 10 μm C18 110 Å AXIA™ (150 mm x 212 mm). Gradientteina olivat 0,1 % muurahaishappo ja 14 % asetonitriili. Fraktiot kerättiin 2 ml eppendorf-putkiin. Kerättyjen fraktioiden yhdistekoostumus tarkistettiin Xevo massaspektrometrilla, minkä jälkeen fraktioista haihdutettiin asetonitriili pois Eppendorf-konsentraattorissa (Fisher scientific, USA). Lopuksi yhtä puhtaat fraktiot yhdistettiin ja kylmäkuivattiin. 2.4 MRM -menetelmän luominen UPLC-MS/MS:lle MRM (Multiple Reaction Monitoring) menetelmä luotiin Xevo massaspektrometrille käyttäen analyysimenetelmää 1. Menetelmä luotiin kuudelle malliyhdisteelle ja niiden metaboliiteille. MRM menetelmää ei luotu akasetiinille ja kemferidille, rasvaliukoisille yhdisteille, koska lopullisella menetelmällä tulee pystyä seuraamaan näiden yhdisteiden glykosylaatiota eikä alkuperäisiä yhdisteitä sinällään. Tästä samasta syystä akasetiini ja kemferidi jätettiin pois myös kineettisistä mittauksista. Puhtaille malliyhdisteille luotiin MRM menetelmä käyttämällä näyteliuoksena kahta eri kantaliuosta. Ensimmäinen kantaliuos (liuos A) sisälsi yhdisteet PGG ja kversetiini-3-O-glukosidi, ja toinen (liuos B) koostui oenotheiini B:stä, EGCG:stä, prosyanidiini B2:sta ja klorogeenihaposta. Kantaliuokset valmistettiin niin, että jokaista yhdistettä oli liuoksissa 50 µg/ml. Liuottimina käytettiin 25 % etanolin vesiliuosta (A) ja 10 % etanolin vesiliuosta (B). Näytteet analysoitiin Xevo -massaspektrometrilla menetelmällä, joka detektoi näytteen yhdisteet retentioajan ja molekyyli-ionin massan perusteella eri kartiojännitteillä välillä 10–100 V. Jokaiselle yhdisteelle valittiin sopiva kartiojännite, joka antoi suurimman intensiteetin prekursori-ionille. Seuraavaksi analysoitiin näytteet uudestaan metodilla, joka analysoi tuoteionit. Menetelmä detektoi prekursori-ionit retentioajan ja ionin massan perusteella ja mittasi siitä muodostuvat tuoteionit valitulla kartiojänitteellä eri törmäysenergioille välillä 5–50 V. Sopiva törmäysenergia valittiin kahdelle eri tuoteionille valitsemalla törmäysenergia, joka antoi 13 tuoteionille suurimman intensiteetin. Tuoteioneista suuremman intensiteetin antanut ioni valittiin kvantitatiiviseksi siirtymäksi ja pienemmän intensiteetin antanut kvalitatiiviseksi siirtymäksi. Näiden siirtymien suhde pitää olla aina samalla määritysalueella, jotta tiedetään detektion olevan oikea. Kun jokaiselle prekursori-ionille oli määritetty kartiojännite ja jokaisen prekursori-ionin kahdelle tuoteionille törmäysenergiat, voitiin luoda lopullinen metodi. Malliyhdisteiden metaboliiteille luotiin MRM metodi hapettamalla yhdisteitä pH 10 puskuriliuoksella 55–115 minuutin ajan. Jokaiselle pääyhdisteelle valmistettiin hapetusta varten oma kantaliuos, jossa oli tarpeeksi korkeassa konsentraatiossa pääyhdistettä, jotta sen hajotessa metaboliitteja muodostuu detektointia varten tarpeeksi paljon liuokseen. Kantaliuoksista valmistettiin yhdistepitoisuudeltaan 10 mg/ml. Liuottimina käytettiin 10 % tai 25 % etanolin vesiliuosta riippuen yhdisteestä. Yhdisteitä hapetettiin samalla analysoimalla näytteitä, jotta voitiin seurata yhdisteiden hajoamista. Kun pääyhdiste oli hajonnut ja metaboliitteja muodostunut tarpeeksi, pysäytettiin reaktio 0,6 % HCOOH:lla. Hapetettuja liuoksia käyttämällä saatiin luotua MRM menetelmät muodostuneille metaboliiteille samalla tavalla kuin puhtaille pääyhdisteille. 2.5 Klorogeenihapon isomerisaatioasteen määritys Klorogeenihapon isomerisaatiota tutkittiin myös Xevo massaspektrometrilla käyttäen analyysimenetelmää 2. Klorogeenihapon isomeerien suhdetta mitattiin 11 eri pH:ssa 180 min inkuboinnin ajan. pH-asteet olivat 0.2 asteen välein 9.0–11.0 välillä. Mittauksissa käytettiin kolmea lähtötilannetta. Jokaisessa lähtötilanteessa oli vain yhtä kolmesta isomeerista. Klorogeenihapon isomeerit olivat 4CQA ja 3CQA. Kantaliuokset valmistettiin jokaisesta isomeerista niin, että liuoksessa oli 1 mg/ml yhdisteitä. Yhdisteet liuotettiin ensin 100–200 µl etanolia, jolla varmistettiin yhdisteen liukeneminen kokonaan, jonka jälkeen laimennettiin 10 % etanolin vesiliuoksella oikeaan pitoisuuteen. Kantaliuoksia pipetoitiin kuoppalevylle 20 µl kolmeen kuoppaan, joista saatiin mitattua rinnakkaiset näytteet. Kuoppiin lisättiin 180 µl pH 10 puskuria saman aikaisesti 12- kanavapipetillä. Yhdisteitä hapetettiin tasan 180 min ajan, jonka jälkeen hapetus pysäytettiin 100 µl HCOOH:ta 12-kanavapipetillä. HCOOH:n pitoisuus riippui pH:sta. Reaktion pysäytyksessä käytettiin pH-asteille 9.0–9.4 0,4 % HCOOH:ta, pH-asteille 9.6– 10.2 0,6 % HCOOH:ta ja pH-asteille 10.4–11.0 0,8 % HCOOH:ta. Mittauksissa standardina käytettiin 1 mg/ml kantaliuoksia, joista oli tehty 15-kertaiset laimennokset. 14 2.6 Kineettiset mittaukset Kineettiset mittaukset tehtiin analyysimenetelmällä 3. Xevo massaspektrometrilla ja kvadrupoli-Orbitrap massaspektrometrilla. Kineettisten mittausten näyteliuokset valmistettiin kantaliuoksista, jotka valmistettiin ensin punnitsemalla 2 mg jokaista yhdistettä omaan eppendorf-putkeen. Tämän jälkeen yhdisteet liuotettiin ensin 50–200 µl EtOH:ta ja lopuksi liuotettiin 1000 µl tilavuuteen 10 % EtOH:lla. Näistä liuoksista yhdistettiin PGG, kversetiini-3-O-glukosidi ja klorogeenihappo (A-liuos) suodattamalla (0.2 µm PTFE) ne uuteen 5 ml eppendorf-putkeen. Samoin yhdistettiin EGCG, oenotheiini B ja prosyanidiini B2 (B liuos). Kantaliuoksiin lisättiin vielä 1 ml 10 % etanolin vesiliuosta, jotta saatiin yhdisteiden pitoisuuksiksi 0,5 mg/ml. Kantaliuoksia pipetoitiin kuoppalevylle, jossa kuopan tilavuus oli 700 µl. Yhdelle riville pipetoitiin 20 µl yhtä kantaliuosta kolmeen kuoppaan ja toista kantaliuosta toiselle riville. Pipetoitiin aina rivi kerrallaan 12-kanavapipetillä samanaikaisesti 180 µl pH puskuria kuoppiin juuri ennen UHPLC-MS/MS:lle injektointia. Injektoitiin jokaisesta kolmesta kuopasta viisi kertaa. Pipetoitiin yksi rivi kerrallaan tarkasti samaan aikaan kuin edellinen. Molemmille massaspektrometreille käsiteltiin näytteet samalla tavalla. pH puskureina käytettiin samoja liuoksia kuin klorogeenihapon isomerisaation mittauksissa pH:t 9.0–11.0 välillä 0.2 asteen välein. Standardeina mittauksissa käytettiin näyteputkia, joissa kaikkia kahdeksaa malliyhdistettä oli 25 µg. Näyteputkien yhdisteet liuotettiin ensin 50 µl EtOH:ta ja laimennettiin 500 µl tilavuuteen 10 % EtOH:lla. Standardien pitoisuus oli näin 50 µg/ml. Standardit mitattiin PLNO:lla paitsi vahvimman pitoisuuden piste, joka mitattiin täydellä silmukalla, jolloin tämän pisteen pitoisuus tiedettiin ja sitä voitiin pitää luotettavana. Täydellä silmukalla mitatun pisteen yhdistepitoisuus oli 50 µg/ml. Tämän avulla korjatut pitoisuudet voitiin laskea muillekin pisteille UV -pinta-aloista. Jokaisen pisteen UV -pinta-ala jaettiin vahvimman pitoisuuden pisteen UV -pinta-alalla ja kerrottiin sen pitoisuudella (50 µg/ml). Jokaiselle malliyhditeelle saatiin näin omat standardisuorat jokaisessa pH-asteessa, kun kahden standardisetin korjattujen pitoisuuksien keskiarvot esitettiin integroitujen massapinta-alojen keskiarvojen suhteen. Tietyn malliyhdisteen standardisuoraa käytettiin aina saman malliyhdisteen ja sen metaboliittien näytetuloksien muuttamiseen pitoisuuksiksi. 15 2.7 Hyönteiskokeet 2.7.1 Näyteputkien valmistus Hyönteiskokeita varten valmistettiin näyteputkia, joissa oli tunnettu määrä kahdeksaa malliyhdistettä. Näyteputkiin pipetoitiin valmistettua liuosta, jossa jokaisen yhdisteen pitoisuus oli 40 µg/ml. Liuos valmistettiin ensin liuottamalla erikseen jokaista yhdistettä 2 mg 5 ml asetonia, jonka jälkeen jokaista yhdisteliuosta pipetoitiin 1 ml korkilliseen 10 ml lasipurkkiin. Tämän jälkeen laimennettiin vielä 2 ml asetonia, jotta lopullisen liuoksen yhdistepitoisuudeksi saatiin 40 µg/ ml. Liuosta pipetoitiin 100 µl 463 kpl 0,5 ml Eppendorf-putkiin ja näyteputket konsentroitiin kuivaksi Eppendorf-konsentraattorilla käyttäen 1,5–2 ml Eppendorf-putkia telineenä. Näin saatiin toukkakokeita varten näyteputkia, joissa oli jokaista kahdeksaa malliyhdistettä 4 µg. Valmiita näyteputkia säilytettiin -20°C:ssa. Myöhempiä hyönteiskokeita varten ja standardiliuoksiksi mittauksiin valmistettiin näyteputkia, joissa oli 25 µg malliyhdisteitä. Kahdeksaa malliyhdistettä punnittiin 12,50 mg lasipunnitusruuhiin ja yhdisteet huuhdeltiin punnitusruuhista Pasteur-pipetillä 2–4 ml asetonia 50 ml mittapulloon. Yhdisteet liuotettiin ensin noin 45 ml asetonia. Osa yhdisteistä ovat heikosti liukenevia, joten lämmitettiin mittapulloa lämpimässä vedessä, kunnes saatiin yhdisteet kokonaan liukenemaan. Lämmittämisen jälkeen odotettiin, että liuos on taas huoneenlämpöinen ja pullo voitiin täyttää merkkiin asti. Mittapulloon valmistetussa liuoksessa oli näin 250 µg/ml kahdeksaa malliyhdistettä. Mittapullon sisältö siirrettiin huolellisesti 50 ml korkilliseen lasipulloon, josta liuos voitiin pipetoida 0,5 ml Eppendorf-putkiin. Asetonia pipetoitaessa piti olla tarkka ja nopea, koska liuos haihtui herkästi, joten pipetoitiin 10–12 Eppendorf-putkea kerralla elektronisella pipetillä aina 100 µl yhteen Eppendorf-putkeen. Liuoksen säilytyspurkin kansi pidettiin mahdollisimman paljon kiinni, jotta liuosta ei haihdu turhaan, jolloin putkia voitiin valmistaa sen verran kuin liuosta riitti eli 471 kpl. Eppendorf-putkiin lisättiin 100 µl ultra puhdasta vettä, jonka jälkeen putkista konsentroitiin asetoni pois Eppendorf- konsentraattorilla käyttäen 1,5–2 ml Eppendorf-putkia telineenä 0,5 ml Eppendorf- putkille. Konsentroidut näyteputket jäädytettiin -20°C:ssa, jonka jälkeen ne kylmäkuivattiin kuivaksi. Kuivauksen jälkeen näyteputket säilytettiin -80°C:ssa. 16 2.7.2 Toukkien syöttäminen ja näytteiden keräys Toukat ja niiden isäntäkasvit kerättiin Turun Ruissalosta kesäkuun alussa. Neljää eri toukkalajia kerättiin yhdeksästä isäntäkasvista. Jokaista isäntäkasvia kohden kerättiin vähintään kymmenen toukkaa. Kerätyt toukat olivat perhosten toukkia ja kuuluivat mittarien heimoon (Geometridae). Isäntäkasveja olivat tunturikoivu, pähkinäpensas, keltakoivu, metsävaahtera, tammi, sokerivaahtera ja hevoskastanja. Toukat kerättiin muovirasioihin isäntäkasvin lehtien kanssa, missä ne kuljetettiin laboratorioon. Isäntäkasveista otettiin mukaan runsaslehtiset oksat, joita pidettiin mahdollisimman tuoreina antamalla niille vettä. Laboratoriossa toukat siirrettiin omiin reikäkorkillisiin muovipurkkeihin. Isäntäkasvien lehdistä leikattiin 15 mm halkaisijaltaan olevia lehtikiekkoja neljä kappaletta jokaiselle toukalle. Toukkien annettiin yön yli syödä kontrollilehtiä, jonka jälkeen kerättiin ylimääräinen lehtimateriaali pois. Kontrolliuloste kerättiin talteen vasta seuraavana päivänä, kun toukat olivat olleet yhden yön ilman ravintoa. Kontrolliulosteen keräämisen jälkeen annettiin toukille näytelehti, joka valmistettiin jokaisen toukkalajin isäntäkasvin lehdestä. Lehtikiekon (ø 15 mm) pinnalle maalattiin näyteputken sisältö, joka liuotettiin 50 µl 80 % asetonia. Näyteputket ravisteltiin ja sentrifugoitiin, jonka jälkeen näyteputken sisältö maalattiin lehtikiekon pinnalle tarkasti pipetin kärjellä, jotta liuosta ei valu lehden pinnalta pois. Asetonin annettiin haihtua lehtien pinnalta ennen kuin kiekot syötettiin toukille, mutta varottiin ettei lehti pääse kuivumaan ennen syöttämistä. Toukat saivat syödä yön yli näytelehteä. Seuraavana aamuna annettiin toukille kontrollilehteä ja vasta myöhemmin päivällä kerättiin näyteuloste talteen, jotta saatiin kerättyä kaikki toukan tuottama näyteuloste. Lopuksi kerättiin myös toukat reikäkorkillisiin Eppendorf-putkiin ja säilöttiin syväjäähän. Kaikki näytteet kylmäkuivattiin ennen uuttoa. 2.8 MetaboKIT työkalun lopullinen testaaminen Lopullisessa testauksessa analysoitiin kvadrupoli-Oritrap massaspektrometrillä isäntäkasvit, kontrolli- ja näyteulosteet, sekä toukat. Kylmäkuivatut näytteet punnittiin, jauhettiin ja uutettiin ennen analysointia. Näytteet jauhettiin kuulamyllyllä yhden kuulan kanssa, jonka jälkeen näytteisiin lisätiin 200 µl d5-fenyylialaniini 100 µg/ml sisäistä standardia, sekä 1200 µl 93:7 asetoni/vesi liuosta (v/v). Liuoksien lisäämisen jälkeen kuulat poistettiin näyteputkista niin, että kuulan mukana ei poistunut näytemateriaalia. Näytteitä ravisteltiin Vortex-ravistajalla 5 minuutin ajan ja annettiin maseroitua kylmässä 17 (4°C) yön yli. Näytteet uutettiin seuraavana päivänä kaksi kertaa kolmen tunnin ajan. Ensimmäisen uuton jälkeen näytteet sentrifugoitiin, dekantoitiin uuteen putkeen ja lisättiin 1400 µl asetoni/vesi liuosta (80:20 v/v) näytemateriaaliin. Näytteet ravisteltiin Vortexilla ennen seuraavaa kolmen tunnin uuttoa. Uuton jälkeen näytteet sentrifugoitiin ja dekantoitiin. Dekantointi tehtiin samoihin putkiin kuin aiemmin, joista oli konsentroitu asetoni pois. Lopuksi asetoni konsentroitiin kokonaan pois näytteistä, jonka jälkeen näytteet pakastettiin ja kylmäkuivattiin. Kylmäkuivauksen jälkeen näytteet valmisteltiin analysointia varten. Näytteet liuotettiin ensin 3 mM HCl liuokseen. Liuotintilavuus määräytyi näytteen punnitun massan mukaan. Tilavuudet menivät seuraavasti: <2,5 mg 100 µl, 2,5-4,5 mg 200 µl, 4,5- 6,5 mg 300 µl, 6,5-8,5 mg 400 µl, 8,5-10,5 mg 500 µl, 10,5-12,5 mg 600 µl, 12,5-14,5 mg 700 µl, 14,5-16,5 mg 800 µl, 16,5-19,5 mg 900 µl, >19,5 mg 1000 µl. Liuotuksen jälkeen näytteet ravisteltiin Vortex-ravistelijalla, sentrifugoitiin ja suodatettiin (0,2 PTFE-suodatin). Suodatettuja näytteitä pipetoitiin 25 µl kuoppalevylle ja kuoppiin lisättiin 475 µl 8 % asetonitriiliä (valmistettu 3 mM HCl liuokseen) 12-kanavapipetillä. Kuoppien sisältö sekoitettiin 12-kanavapipetillä ottamalla liuos pipetin kärkeen ja takaisin vähintään kolmesti. Näytteet analysoitiin kvadrupoli-Orbitrap massaspektrometrillä analyysimenetelmällä 3. Standardeina lopullisissa mittauksissa käytettiin 50 µg/ml kahdeksan malliyhdisteen liuosta, joka oli valmistettu samoin kuin kineettisissä mittauksissa. Lopullisten mittausten tulokset käsiteltiin lopulta MZ-mine ohjelmalla, joka käsitteli negatiivisella ionisaatiolla mitatun raakadatan ja löysi valmiiksi kaikki löydetyt ionit. Lisäksi Xcalibur -ohjelmalla integroitiin UV:lta jokapäiväiset standardit. Yhdiste seoksesta, jossa oli kaikkia kahdeksaa malliyhdistettä, integroitiin viiden yhdisteen UV:n antaman piikin pinta-alat, klorogeenihappo käsiteltiin erikseen. Jokaisella yhdisteellä käytettiin yhdisteille parasta UV aallonpituutta. 3.Tulokset 3.1 Malliyhdisteiden puhtaus Malliyhdisteistä puhdistettiin PGG ja EGCG Sephadex LH-20 geelikromatografialla. Karkean puhdistuksen tuloksena saatiin suoraan puhdasta PGG:tä, mutta EGCG vaati 18 vielä lisä puhdistusta HPLC:llä. PGG:n punnitustulokset ovat listattu Taulukkoon 1. Kuva 5. Puhdistetun pentagalloyyliglukoosin UV-kromatogrammi. Lähtoaine (1) ja puhdistettu (2) pentagalloyyliglukoosi. EGCG:tä puhdistettiin preparatiivisella ja semipreparatiivisella HPLC:llä, joista saatiin puhdasta EGCG:tä 161,5 mg. Vielä jatkopuhdistusta tarvitsevaa EGCG:tä jäi 371 mg. HPLC puhdistuksen jälkeen saatiin kuitenkin riittävästi puhdistettuja yhdisteitä MetaboKIT työkalun valmistelua ja käyttöönottoa varten. PGG:n ja EGCG:n puhdistus HPLC:llä esitetty kuvissa 5 ja 6. min -0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 % -0 100 191002 Erika PGGSep50MeOH lähtö * min 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 % -3 97 191002 Erika PGGSep50MeOH lähtö * * * * * * * * * * min 3.50 3.75 4.00 4.25 4.50 4.75 5.00 5.25 5.50 % -20 80 191120 Erika PGGSep30Ac FR55 * 1. 2. 19 Kuva 6. Puhdistetun EGCG:n UV-kromatogrammi. Lähtoaine (1) ja puhdistettu (2) EGCG. 3.2 Metaboliitit Xevo massaspektrometrilla tehtyjen malliyhdisteinkubointien avulla MRM-menetelmää luodessa saatiin esiin malliyhdisteiden metaboliitit. Metaboliittien m/z -arvot ja retentioajat on esitetty Taulukossa 3, sekä UV-kromatogrammit ja massaspektromit Liittessä 1Näiden arvojen avulla luotiin lopullinen MRM-menetelmä mittauksia varten. Taulukko 3. MRM metodin avulla tunnistetut malliyhdisteet ja niiden metaboliitit. pääyhdiste metaboliitti m/z Rt nimi m/z Rt nimi 939,11 2,24 PGG 787,10 1,78 tetraGG 635,09 1,22 triGG 301,00 1,80 ellagihappo 463,09 1,93 kversetiini-3-O- glukosidi - - - 353,09 1,10 CQA 487 1,93 - min -0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 % -1 99 200203 Erika fr22 la * min 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 % -2 98 200203 Erika fr5 la * * * * * * * * * * * * * min 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 % -4 96 200203 Erika fr22 la * * 1. 2. 20 457,08 1,46 EGCG 169,01 713,12 913,15 2,20 1,98 1,39 gallushappo - theasinensin A 577,14 1,33 prosyanidiini B2 289,07 575,12 591,11 865,20 1,02 2,06 1,14 1,65 katekiini prosyanidiini dimeeri - prosyanidiini trimeeri 783,07 1,16 oenothiini B 754,07 1,22 - 3.3 pH-mallinnus Klorogeenihapon ja sen isomeerien isomerisaatioasteen määrityksen tuloksista saatiin tehtyä pH-mallinnus, jonka avulla voidaan mallintaa hyönteisen suolen pH:ta. Mittausten tuloksista integroitiin TargetLynx -ohjelmalla klorogeenihapon isomeerien UV pinta-alat standardeista ja näytteistä. Jokaisesta pH-asteesta saatiin kolme rinnakkaisarvoa, joiden keskiarvon avulla voidaan esittää tulokset kvantitatiivisesti varsinaista pH-mallinnusta varten lopullisten mittausten tuloksiin. Kvantitatiivisessa suorassa esitettiin kuinka isomeerien pitoisuus laskee prosentuaalisesti eri pH-asteissa lähtötilanteesta, jossa aina yhtä isomeeriä on 100 %. Tulokset kvantitatiivisiin suoriin saatiin laskemalla eri pH- asteissa muodostuneiden isomeerien rinnakkaisarvojen keskiarvot UV pinta-aloista. Nämä keskiarvot voitiin jakaa standardien täydellä silmukalla mitatun pisteen UV pinta- alalla, joka on sama kuin lähtötilanne, ja tulokset muutettiin prosenteiksi, jolloin saatiin esitettyä nämä arvot kvantitatiivisessa suorassa pH-asteiden suhteen (Kuva 7). Kuva 7. Klorogeenihapon pH-mallinnuksen kvantitatiiviset suorat. Y-akselilla isomeerien määrä prosenteissa, kun lähtotilanne on 100 % ja x-akselilla pH-asteet. Sininen suora on CQA3, oranssi CQA5 ja harmaa CQA5. 0 20 40 60 9 10 11 CQA5 0 20 40 9 10 11 CQA3 0 20 40 9 10 11 CQA4 21 Aina yhdessä mittauspisteessä muodostuneet kahveoyylikviinihappoisomeerien UV pinta-alat voitiin laskea yhteen, tällä arvolla voitiin jakaa yksittäisten isomeerien UV pinta-alat ja muuttaa nämä arvot prosenteiksi, jolloin saatiin prosenttiosuus jokaiselle isomeerille eri pH-asteissa Näin klorogeenihapon pH-mallinnus voitiin esittää myös kvalitatiivisilla suorilla (Kuva 8–10). 0 10 20 30 40 50 60 70 9 9,2 9,4 9,6 9,8 10 10,2 10,4 10,6 10,8 11 % pH 100% neoklorogeenihappoa (CQA3) lähtötilanteessa CQA3 CQA4 CQA5 0 10 20 30 40 50 9 9,2 9,4 9,6 9,8 10 10,2 10,4 10,6 10,8 11 % pH 100% kryptoklorogeenihappoa (CQA4) lähtötilanteessa CQA3 CQA4 CQA5 Kuva 8. Kahveoyylikviinihappoisomeerien isomeerisuhteiden kehitys pH:n funktiona, kun neoklorogeenihappoa inkuboidaan eri pH-asteissa kolmen tunnin ajan. Kuva 9. pH-mallinnuksen kvalitatiivinen suora, kun inkuboidaan kryptoklorogeenihappoa eri pH-asteissa kolmen tunnin ajan. 22 3.4 Malliyhdisteiden mallinnus pH-asteittain Kineettisten mittausten raakadata saatiin integroitua Xevo massaspektrillä mitattaessa TargetLynx -ohjelmalla. TargetLynx -ohjelmalla integroitiin standardien UV -pinta-alat ja äiti-ionien massapinta-alat, sekä näytteiden MRM:llä tunnistetut malliyhdisteiden massapinta-alat. Yhden mittauspäivän aikana mitattujen standardisuorien keskiarvon avulla saatiin muutettua näytteiden massapinta-alat pitoisuuksiksi (Kuva 11). Kuva 11. Yhden mittauspaivan aikana mitattujen standardisuorien keskiarvo PGG:lle, jonka avulla muutettiin PGG:n massapinta-alat pitoisuuksiksi. Pitoisuudet saatiin käyttämällä standardisuoran yhtälöä, jossa y on pitoisuus ja x on massapinta-ala. Näin saatiin mallinnettua, miten malliyhdisteet käyttäytyvät 11 eri pH- 0 10 20 30 40 50 60 70 80 9 9,2 9,4 9,6 9,8 10 10,2 10,4 10,6 10,8 11 % pH 100% klorogeenihappoa (CQA5) lähtötilanteessa CQA3 CQA4 CQA5 y = 2,E-08x - 4,E-04 R² = 1,E+00 0 10 20 30 40 50 60 0,00E+00 5,00E+08 1,00E+09 1,50E+09 2,00E+09 2,50E+09 P it o is u u s (µ g/ m l) Pinta-ala Kuva 10. pH-mallinnuksen kvalitatiivinen suora, kun inkuboidaan klorogeenihappoa eri pH- asteissa kolmen tunnin ajan. 23 asteessaajansuhteen (Kuva 12, Liite 2), sekä malliyhdisteiden hajoamista metaboliiteiksi ajan suhteen (Kuva 12-15). Kuva 12. Malliyhdisteiden pH-mallinnus, jossa yhdisteiden hajoamista seurataan kolmen tunnin ajan 11 eri pH-asteessa. Tassa kuvattu yhdisteiden hajoaminen kolmessa pH- asteessa, loput pH-aste mallinnukset Liittessa 1. 0 10 20 30 40 50 60 70 0 20 40 60 80 100 120 140 160 P it o is u u s ( µ g/ m l) Aika (min) pH 9.0 m/z 939 m/z 463 m/z 353 m/z 783 m/z 577 m/z 457 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0 20 40 60 80 100 120 140 160 P it o is u u s ( µ g/ m l) Aika (min) pH 10.0 m/z 939 m/z 463 m/z 353 m/z 783 m/z 577 m/z 457 0 10 20 30 40 50 60 0 20 40 60 80 100 120 140 160 P it o is u u s ( µ g/ m l) Aika (min) pH 11.0 m/z 939 m/z 463 m/z 353 m/z 783 m/z 577 m/z 457 24 Orbitrap massaspektrillä mitattujen kineettisten mittausten tulokset käsiteltiin MZ- mine -ohjelmalla, minkä avulla saatiin ohjelman löytämien ionien piikkien massapinta- alat. Lisäksi Xcalibur -ohjelmalla integroitiin UV:lta jokapäiväiset standardit. Standardien UV pinta-alojen avulla korjattiin pitoisuudet oikeiksi samoin kuin aiemmin, jonka jälkeen standardisuorat saatiin jokaiselle pH-asteelle erikseen. Standardisuorien avulla EGCG:n ja sen metaboliittien massapinta-alat voitiin muuntaa pitoisuuksiksi. Tämän jälkeen tulokset voitiin esittää ajan tai pH-asteen suhteen. Esitettiin EGCG:n hajoaminen metaboliiteiksi pH10:ssä ajan suhteen, sekä EGCG:n pitoisuuden lasku ajan suhteen kolmessa eri pH-asteessa (Kuva 16). Kuva 13. PGG:n kineettisen mittauksen tulokset pH:ssa 10. Mitattiin Xevo UPLC-MS/MS:llä PGG:n hajoamista kuuden minuutin välein kolmen tunnin ajan. Kuva 14. Prosyanidiini B2:n kineettisen mittauksen tulokset pH:ssa 10. Mitattiin Xevo UPLC- MS/MS:llä prosyanidiini B2:n hajoamista kuuden minuutin välein kolmen tunnin ajan. 0 10 20 30 40 50 60 0 20 40 60 80 100 120 140 160 P it o is u u s (µ g/ m l) Aika (min) PGG pH 10 m/z 939 m/z 787 m/z 635 m/z 301 0 10 20 30 40 50 60 0 20 40 60 80 100 120 140 160 P it o is u u s (µ g/ m l) Aika (min) Prosyanidiini B2 pH 10 m/z 577 m/z 591 m/z 289 m/z 865 m/z 575 25 Kuva 15. EGCG:n kineettisen mittauksen tulokset pH:ssa 10. Mitattiin Xevo UPLC-MS/MS:llä EGCG:n hajoamista kuuden minuutin välein kolmen tunnin ajan. 3.5 MetaboKIT -työkalun lopullinen testaaminen MZ-mine -ohjelmalla käsiteltiin myös lopullisten mittausten tulokset. Ensimmäisen päivän standardisuorat olivat onnistuneet, mutta muiden päivien standardeja mitattaessa oli tapahtunut virhe ja saadut UV pinta-alat eivät antaneet todellisia tuloksia mitattaessa PLNO:lla, mutta täydellä silmukalla saatiin luotettavampi tulos eli muiden päivien standardisuorista saimme mitattua vain yhden pisteen. Standardien UV pinta-alojen avulla voitiin laskea korjatut pitoisuudet kuten kineettisten mittausten tuloksissakin oli tehty. Suorat, joista vain yksi mittauspiste oli onnistunut, suhteutettiin ensimmäisen päivän onnistuneeseen standardisuoraan laskemalla jokaisen standardisetin vahvimman pitoisuuden massapinta-alan suhde ensimmäisen päivän vahvimman pitoisuuden mittauspisteeseen. Tämän jälkeen loput pisteet epäonnistuneille suorille saatiin kertomalla ensimmäisen päivän onnistuneen 0 10 20 30 40 50 60 0 20 40 60 80 100 120 140 160 P it o is u u s (µ g/ m l) Aika (min) EGCG pH 10 m/z 457 m/z 713 m/z 169 m/z 913 0 10 20 30 40 50 60 0 50 100 150 P it o is u u s (µ g/ m l) Aika (min) EGCG pH9 pH10 pH11 0 20 40 60 0 50 100 150 P it o is u u s (µ g/ m l) Aika (min) pH10 m/z 457 m/z 913 m/z 713 m/z 169 Kuva 16. Kvadrupoli-Orbitrap UPLC-MS/MS:llä mitatut tulokset EGCG:n kineettisistä mittauksista kolmen tunnin ajalta. Mallinnettu miten EGCG käyttäytyy eri pH-asteissa, sekä miten EGCG hajoaa pH:ssa 10 metaboliiteiksi. 26 suoran mittauspisteet jokaiselle suoralle erikseen lasketun suhdeluvun kanssa. Jokaiselle päivälle oli mitattu kaksi standardisuoraa, mittauspäivän alussa ja lopussa, joiden keskiarvosta voitiin piirtää standardisuorat. Epäonnistuneiden standardisuora mittausten suorat piirrettiin ensimmäisen päivän onnistuneen suoran korjattuja pitoisuuksia ja jokaiselle suoralle suhteutettuja massapinta-aloja käyttäen. Lopulta saatiin jokaiselle päivälle omat standardisuorat jokaiselle yhdisteelle (Kuva 17). Standardisuorien avulla voitiin muuttaa MZ-mine massapinta-alat pitoisuuksiksi. Kuva 17. Lopullisten mittausten PPG standardisuora yhdeltä mittauspäivältä, jossa on esitetty pitoisuus massapinta-alan suhteen. Lehtinäytteiden pitoisuuksien ja kineettisten mittausten tulosten (Kuva 18) avulla voitiin ennustaa, mitä yhdisteen pitoisuudelle pitäisi tapahtua. Kineettisistä mittauksista saatiin kuudelle malliyhdisteelle kvantitatiiviset kuvaajat, joista nähtiin miten yhdistepitoisuus laskee prosentuaalisesti pH:n suhteen. Lehtinäytteiden pitoisuus voitiin kertoa jokaisen pH:n prosentuaalisella kertoimella ja saatiin ennuste siitä mitä jokaisen lehti näytteen yhdistepitoisuudelle tapahtuu jokaisessa pH-asteessa. Tätä ennustetta voidaan verrata klorogeenihapon pH-mallinukseen ja selvittää käytäyykö yhdisteet samoin in vitro ja in vivo. Lopullisista mittauksista viidestä malliyhdisteestä vain PGG:lle, EGCG:lle, prosyanidiini B2:lle ja kversetiini-3-O-glukosidille saatiin tulokset (Kuva 19-22). Oenotheiini B:n standardisuorat eivät olleet tarpeeksi luotettavia, jotta näytetulokset olisi saatu muutettua pitoisuuksiksi. Näin ollen ei saatu mallinnettua oenotheiini B:n tuloksia. y = 2E-08x - 0,0004 R² = 1 0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 0,00E+00 5,00E+08 1,00E+09 1,50E+09 2,00E+09 2,50E+09 P it o is u u s (µ g /m l) massa pinta-ala PGG standardisuora 27 Kuva 18. PGG kineettisten mittausten kvantitatiivinen kuvaaja, jossa on PGG:n prosenttiosuus 180 min mittauspisteessä pH-asteen suhteen. Kuva 19. PGG:n pitoisuudet lopullisten mittausten lehti- ja hyönteisnäytteistä. Kuva 20. EGCG:n pitoisuudet lopullisten mittausten lehti- ja hyönteisnäytteistä. 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 5 9 9,2 9,4 9,6 9,8 10 10,2 10,4 10,6 10,8 11 % pH PGG 100% alussa m/z 939 Le h ti 1 N 1 .2 N 1 .6 N 1 .5 N 1 .8 N 1 .1 2 N 1 .1 3 Le h ti 4 N 2 .7 N 2 .1 0 N 2 .1 3 N 2 .8 N 2 .1 N 2 .6 N 2 .9 N 2 .4 N 2 .1 1 N 2 .1 2 N 2 .1 5 N 4 .3 N 4 .4 N 4 .8 N 4 .1 1 N 4 .1 N 4 .6 N 4 .1 4 N 4 .5 N 4 .7 Le h ti 6 N 5 .8 N 5 .1 0 N 5 .9 N 5 .3 N 6 .1 N 6 .1 2 N 6 .5 N 6 .6 N 6 .1 5 N 6 .8 Le h ti 7 N 7 .2 Le h ti 8 N 8 .1 0 N 8 .1 N 8 .4 N 8 .3 Le h ti 9 N 9 .5 N 9 .4 N 9 .1 1 N 9 .3 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Lehti ja hyönteisen ulostenäytteet P it o is u u s (µ g/ m l) PGG tulokset Le h ti 1 N 1 .2 N 1 .6 N 1 .5 N 1 .8 N 1 .1 2 N 1 .1 3 Le h ti 4 N 2 .7 N 2 .1 0 N 2 .1 3 N 2 .8 N 2 .1 N 2 .6 N 2 .9 N 2 .4 N 2 .1 1 N 2 .1 2 N 2 .1 5 N 4 .3 N 4 .4 N 4 .8 N 4 .1 1 N 4 .1 N 4 .6 N 4 .1 4 N 4 .5 N 4 .7 Le h ti 6 N 5 .8 N 5 .1 0 N 5 .9 N 5 .3 N 6 .1 N 6 .1 2 N 6 .5 N 6 .6 N 6 .1 5 N 6 .8 Le h ti 7 N 7 .2 L eh ti 8 N 8 .1 0 N 8 .1 N 8 .4 N 8 .3 Le h ti 9 N 9 .5 N 9 .4 N 9 .1 1 N 9 .3 0 0,005 0,01 0,015 0,02 0,025 0,03 0,035 0,04 Lehti ja hyönteisen ulostenäytteet P it o is u u s (µ g/ m l) EGCG tulokset 28 Kuva 21. Prosyanidiini B2:n pitoisuudet lopullisten mittausten lehti- ja hyönteisnäytteistä. Kuva 22. Kversetiini-3-O-glukosidin pitoisuudet lopullisten mittausten lehti- ja hyönteisnäytteistä. Lopullisista mittauksista klorogeenihapon isomerisaation avulla ennustettiin hyönteisen suolen pH:ta. Klorogeenihapon standardisuorat, pitoisuus näytteissä ja pH:n ennustaminen tehtiin lähes samoin kuin muillekin yhdisteille. Erona oli klorogeenihapon isomeerien pitoisuuksien määritys ja pH:n ennustaminen. Lopullisten mittausten standardiseoksessa oli yhdiste CQA5, mutta ei sen isomeerejä CQA3 ja CQA4. Jotta CQA3 ja CQA4 pitoisuudet voitiin määrittää CQA5:n avulla, määritettiin laimennossarjat kaikille kolmelle isomeerille. Laimennossarjat saatiin käyttämällä kineettisten mittausten pH10:tä 0–180 min ajalta muodostaen kuvaaja UV:n ja massanpinta-alan suhteesta. Kineettisten mittausten pH10 mittauksien standardeina käytettiin klorogeenihapon kolmen isomeerin laimennossarjaa, joka on mitattu PLNO:n avulla. Standardisarjoja oli Le h ti 1 N 1 .2 N 1 .6 N 1 .5 N 1 .8 N 1 .1 2 N 1 .1 3 Le h ti 4 N 2 .7 N 2 .1 0 N 2 .1 3 N 2 .8 N 2 .1 N 2 .6 N 2 .9 N 2 .4 N 2 .1 1 N 2 .1 2 N 2 .1 5 N 4 .3 N 4 .4 N 4 .8 N 4 .1 1 N 4 .1 N 4 .6 N 4 .1 4 N 4 .5 N 4 .7 Le h ti 6 N 5 .8 N 5 .1 0 N 5 .9 N 5 .3 N 6 .1 N 6 .1 2 N 6 .5 N 6 .6 N 6 .1 5 N 6 .8 Le h ti 7 N 7 .2 Le h ti 8 N 8 .1 0 N 8 .1 N 8 .4 N 8 .3 Le h ti 9 N 9 .5 N 9 .4 N 9 .1 1 N 9 .3 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 Lehti ja hyönteisen ulostenäytteet P it o is u u s (µ g/ m l) Prosyanidiini B2 tulokset Le h ti 1 N 1 .2 N 1 .6 N 1 .5 N 1 .8 N 1 .1 2 N 1 .1 3 Le h ti 4 N 2 .7 N 2 .1 0 N 2 .1 3 N 2 .8 N 2 .1 N 2 .6 N 2 .9 N 2 .4 N 2 .1 1 N 2 .1 2 N 2 .1 5 N 4 .3 N 4 .4 N 4 .8 N 4 .1 1 N 4 .1 N 4 .6 N 4 .1 4 N 4 .5 N 4 .7 Le h ti 6 N 5 .8 N 5 .1 0 N 5 .9 N 5 .3 N 6 .1 N 6 .1 2 N 6 .5 N 6 .6 N 6 .1 5 N 6 .8 Le h ti 7 N 7 .2 Le h ti 8 N 8 .1 0 N 8 .1 N 8 .4 N 8 .3 Le h ti 9 N 9 .5 N 9 .4 N 9 .1 1 N 9 .3 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 Lehti ja hyönteisen ulostenäytteet P it o is u u s (µ g/ m l) Kversetiini-3-O-glukosidi tulokset 29 mitattu neljä samana mittauspäivänä. Näistä standardeista integroitiin UV:t aallonpituudella 324,5–325,5 nm ja massapinta-alat jokaiselle kolmelle klorogeenihapon isomeerille. UV pinta-alan avulla laskettiin korjatut pitoisuudet samoin kuin aiemmin, kun tiedettiin vahvimman pitoisuuden olevan 50 µg/ml. Korjattujen pitoisuuksien ja massapinta-alojen keskiarvoista saatiin kineettisten mittausten standardisuorat isomeereille ja näiden suorien yhtälöiden avulla voitiin muuttaa kineettisten mittausten aikapisteiden UV pinta-alat isomeereille pitoisuuksiksi (Kuva 23). Laimennossarjasuorat saatiin jokaiselle CQA-isomeerille, kun esitettiin kineettisten mittausten UV:sta muutetut pitoisuudet massapinta-alojen suhteen (Kuva 24). Laimennossarjasuorista (Kuva 25) saadaan suhde CQA5:lle ja sen isomeereille CQA3:lle ja CQA4:lle. Kuva 23. Kineettisten mitausten standardisuorien keskiarvo CQA5:lle, jonka avulla muutettiin UV pinta-alat pitoisuuksiksi. Klorogeenihappo käsiteltiin samoin kuin muutkin yhdisteet lopullisten mittausten standardisuoria tehdessä. Näin saatiin joka päivälle CQA5:n standardisuorat, joiden yhtälöiden avulla voitiin muuttaa lopullisten mittausten CQA5 MZ-mine tulokset pitoisuuksiksi. CQA3 ja CQA4 tulokset muutettiin pitoisuuksiksi käyttämällä hyväksi laimennossarjan suoria ja CQA5:n jokapäiväisiä standardisuoria. Esimerkiksi CQA3:n yhtälössä, jolla muutettiin massapinta-alat pitoisuuksiksi, oli CQA3:n laimennossarjan yhtälö jaettuna CQA5:n laimennossarjan yhtälöllä ja tämä kerrottuna CQA5:n jokapäiväisellä standardisuoran yhtälöllä. Samanlainen yhtälö muodostettiin CQA4:lle. Kaikki lopullisten mittausten MZ-mine massapinta-ala tulokset muutettiin näiden yhtälöiden avulla pitoisuuksiksi. y = 5E-05x + 1E-14 R² = 1 0 10 20 30 40 50 60 0 200000 400000 600000 800000 1000000 1200000 P it o is u u s (µ g/ m l) Pinta-ala 30 Kuva 24. Kineettisten mittausten UV pinta-alojen avulla saadut pitoisuudet massapinta-alojen suhteen. Kuva 25. Klorogeenihapon isomeerien laimennossarjojen suorat. Pitoisuudet eri pH-asteissa saatiin pH-mallinnuksen avulla. Klorogeenihapon isomeerien kvantitatiivisten suorien suhdeluvuilla kerrottiin lehtinäytteiden pitoisuudet. Näin saatiin kolme ennustetta, joissa jokaisessa on yhden isomeerin kvantitatiivista suoraa käytetty ennustamaan pitoisuuden muutosta eri pH-asteissa. Lopuksi laskettiin yhteen jokaisen ennusteen antamat CQA3, CQA4 ja CQA5 tulokset eri pH-asteissa ja muutettiin nämä tulokset suhdeluvuiksi eli esimerkiksi, missä suhteessa CQA3:a on verrattuna CQA4 ja CQA5:een. Samoin muutettiin näyteulosteiden tuloksien pitoisuudet suhdeluvuiksi. Näitä suhdelukuja vertailemalla voidaan mallintaa hyönteisen suolen pH- aste. Mallinnusta varten vertailtiin malliyhdisteiden ennustettuja pitoisuuksia ja mitattuja pitoisuuksia hyönteisen näyteulosteesta. Klorogeenihapon ennuste ja mitatut y = 5E-18x2 + 3E-09x 0 10 20 30 40 50 60 0,00E+00 5,00E+08 1,00E+09 1,50E+09 2,00E+09 2,50E+09 3,00E+09 P it o is u u s (µ g/ m l) Pinta-ala 0 10 20 30 40 50 60 70 0 1E+09 2E+09 3E+09 4E+09 p it o is u u s (µ g /m l) massa pinta-ala CQA3 suora CQA5 suora CQA4 suora Linear (CQA3 suora) Linear (CQA5 suora) Linear (CQA4 suora) 31 pitoisuudet muutettiin suhdeluvuiksi, joita voitiin vertailla toisiinsa. Näytteiden pH- asteen määritys oli suuntaa antava, jolla saatiin tietää, onko hyönteisen suolen pH-aste matala, keskivahva vai korkea. Matala pH-aste oli välillä 9.0–9.4, keskivahva välillä 9.6– 10.2 ja korkea välillä 10.4–11.0. Taulukko 4. Lopullisten mittausten pH-tulokset. Eri toukka lajien suolen mallinnettu pH-aste CQA:n avulla puulajeittain. puulaji toukkien näytepapanat CQA:n ennustama pH-aste Tunturikoivu N1.2 N1.5 N1.6 N1.8 N1.12 N1.13 korkea korkea korkea korkea korkea korkea Pähkinäpensas N3.8 korkea Keltakoivu N2.1 N2.4 N2.6 N2.7 N2.8 N2.9 N2.10 N2.11 N2.12 N2.13 N4.1 N4.3 N4.4 N4.5 N4.6 N4.7 N4.8 N4.11 N4.14 ei määritettävissä ei määritettävissä ei määritettävissä ei määritettävissä ei määritettävissä ei määritettävissä ei määritettävissä ei määritettävissä ei määritettävissä ei määritettävissä ei määritettävissä ei määritettävissä ei määritettävissä ei määritettävissä ei määritettävissä ei määritettävissä ei määritettävissä ei määritettävissä ei määritettävissä Metsävaahtera N5.3 N5.8 N5.9 N5.10 N6.1 N6.5 N6.6 N6.8 N6.12 N6.15 matala matala matala matala matala matala matala matala matala matala Tammi N7.2 matala Sokerivaahtera N8.1 N8.3 korkea korkea 32 N8.4 N8.10 korkea korkea Hevoskastanja N9.3 N9.4 N9.5 N9.11 keskivahva matala matala matala Tuloksia määrittäessä osalle näytteistä ei pystytty määrittämään pH-astetta, kun ennustettu yhdistepitoisuus ja mitattu -pitoisuus erosivat toisistaan liian suuresti. Myös tulokset, joille määritettiin, pH-aste olivat hieman poikkeavia yhdistepitoisuuksiltaan verrattuna ennustettuihin pitoisuuksiin, kuten voidaan huomata Taulukon 5 ja 6 esimerkistä. Taulukko 5. Klorogeenihapon pH-mallinnuksen ennuste pitoisuudet muutettu suhdeluvuiksi isomeerien välillä tunturikoivun näytteille. matala keskivahva korkea 9 9.2 9.4 9.6 9.8 10 10.2 10.4 10.6 10.8 11 CQA3 11 14 17 22 30 36 37 39 40 39 39 CQA5 71 67 62 53 42 34 31 29 28 29 29 CQA4 18 19 21 24 28 30 32 32 32 32 32 Taulukko 6. Tunturikoivua syöneiden toukkien näyteulosteiden klorogeenihappoyhdistepitoi- suudet muutettuna suhdeluvuiksi. N1.2 N1.5 N1.6 N1.8 N1.12 N1.13 CQA3 43 43 44 43 42 38 CQA5 10 10 11 11 12 10 CQA4 46 46 45 46 46 53 Taulukon 6 tuloksia vertailtiin taulukon 5 ennustettuihin tuloksiin ja valittiin pH- aste, jonka kanssa suhdeluvut olivat lähimpänä toisiaan. 4. Tulosten tarkastelu Tutkimuksen alussa puhdistettiin PGG:tä ja EGCG:tä pylväsgeelikromatografialla tavoitteena puhdistaa yhdisteitä riittävästi MetaboKIT työkalun testausta ja käyttöönottoa varten. Loput malliyhdisteet olivat kaupallisia, paitsi oenotheiini B, jota oli jo aikaisemmin puhdistettu. PGG:n ja EGCG:n puhdistuksessa saatiin tuotettua yhdisteitä useita satoja milligrammoja, joka oli riittävästi tutkimuksen tarpeisiin ja lopulliseen työkalun käyttöön. Yhdisteiden lopullinen puhtaus voitiin nähdä kuvista 5 ja 6, joissa on vertailtu yhdisteiden puhtautta ennen ja jälkeen puhdistuksen. Näistä kuvista voitiin huomata puhdistuksen onnistuneen. 33 Malliyhdisteille luotiin seuraavaksi MRM-menetelmät. Tämän menetelmän luomista varten yhdisteitä inkuboitiin pH10:llä, jolloin saatiin selville myös yhdisteiden metaboliitit. Malliyhdisteiden ja metaboliittien m/z -arvoja ja retentioaikoja (Taulukko 3) käyttämällä luotiin MRM-menetelmä, jota voitiin käyttää muissa mittauksissa hyödyksi. Metaboliitteja löydettiin PGG:lle, EGCG:lle ja prosyanidiini B2:lle, mitkä on tunnistettu taulukossa 3. Tutkimuksen keskeisessä osassa oli pH-mallinnus, joka tehtiin klorogeenihapon isomeerien avulla. pH-mallinnus tehtiin kolmella rinnakkaisnäytteellä jokaiselle isomeerille. Rinnakkaisnäytteille saatiin, jokaisella samat tulokset, jolloin voitiin pitää tuloksia luotettavina. Kuvista 8-10 nähdään isomeerien muodostuminen pH-asteittain toisiinsa suhteutettuna, kuinka pH -aste vaikuttaa yhdisteiden hajoamiseen ja muiden isomeerien muodostumiseen. Kvantitatiivisen mallinnuksen avulla (Kuva 7) voitiin ennustaa hyönteisen suolen pH:ta lopullisen mittauksen tuloksista. Malliyhdisteiden pH-mallinnus tehtiin kineettisten mittausten avulla, jolloin saatiin selville, miten malliyhdisteet käyttäytyvät eri pH-asteissa. Kuvassa 12 nähdään yhdisteiden hajoaminen kolmessa pH-asteessa ja jokaisella yhdisteellä huomataan selkeä ero yhdisteen hajoamisnopeudessa, kun pH kasvaa. pH:ssa 9 hajoaminen on hidasta ja suurin osa yhdisteitä ei kerkeä hajoamaan kokonaan edes kolmen tunnin aikana. pH:ssa 10 yhdisteet hajoavat nopeammin ja huomataan, että osa yhdisteistä, kuten klorogeenihappo ja kversetiini-3-O-glukosidi, kestää paremmin hapettumista kuin muut yhdisteet. pH:ssa 11 malliyhdisteet hajoavat jo huomattavasti nopeammin. EGCG:n huomataan hajoavan poikkeuksellisen nopeasti jokaisessa pH-asteessa verrattuna muihin yhdisteisiin. Malliyhdisteiden PGG, EGCG ja prosyanidiini B2 hajoamista ja niiden metaboliittien muodostumista voitiin seurata myös ajan suhteen eri pH-asteissa (Kuvat 13–15). PGG:n hajoamista seuratessa pH 10:ssä huomataan, että metaboliitteja muodostuu PGG:n hajotessa, mutta ajan kuluessa myös metaboliitit hajoavat. Samoin käyttäytyy prosyanidiini B2, mutta verrattaessa prosyanidiini B2:n hajoamista PGG:n ja EGCG:n hajoamiseen, kestää se huomattavasti pidempään hapettamista. PGG ja EGCG molemmat hajosivat pH:ssa 10 jo 30 min kohdalla lähes kokonaan, kun taas prosyanidiini B2 hajosi kokonaan vasta 90 min kohdalla. pH-mallinnus mittaukset suoritettiin kahdella eri massaspektrometrilla. Tulokset ovat Xevo massaspektrometrilla mitattuja, mutta kvadrupoli-Orbitrap massaspektrometrin tuloksia on esitetty (Kuva 16) vertailun vuoksi. Kuvasta 16 nähdään 34 kvadrupoli-Orbitrap massaspektrometrin mittaamat tulokset EGCG:lle. Kuvaajissa on esitetty EGCG:n hajoaminen kolmessa eri pH-asteessa, sekä metaboliittien muodostuminen. Kun näitä kuvia vertaillaan Xevo massaspektrometrin antamiin tuloksiin (Kuva 12 ja 15), huomataan EGCG:n pitoisuuksien olevan pienimpiä kvadrupoli-Orbitrap massaspektrometrillä mitattaessa, mutta yhdisteet käyttäytyvät samoin eri pH-asteissa ajan suhteen. Lopullisten mittausten tuloksia käsiteltäessä huomattiin mittausten aikana tapahtuneesta virheestä, joka johti siihen, että standardisuoria piti manuaalisesti muokata, koska osat arvoista eivät olleet luotettavia. Vaikka standardisuorat korjattiin, niin oenotheiini B:n suorista ei saatu tuloksia. Muille yhdisteille saatiin pitoisuudet lehti- ja hyönteisenulostenäytteille. Pääsääntöisesti huomattiin hyöteisenulostenäytteen yhdistepitoisuuden olevan alhaisempi kuin lehtinäytteen, mutta voitiin huomaata myös eri malliyhdisteillä paljon poikkeavuutta, jolloin hyönteisenulostenäytteen yhdistepitoisuus oli korkeampi kuin lehdessä. Lopulta hyönteisen suolen pH-aste näytteissä ennustettiin klorogeenihapon avulla Osalle näytteistäpH-astetta ei voitu määrittää pitoisuuksien liian suuren poikkeavuuden vuoksi. pH-aste voitiin määrittää vain arvion matala-keskivahva-korkea avulla, koska pitoisuus erot ennustuksen ja todellisen pitoisuuden välillä olivat liian suuret. 5. Johtopäätökset Tutkimuksen tuloksena saatiin onnistuneesti puhdistettua PGG:tä ja EGCG:tä MetaboKIT työkalun valmistamista ja käyttöönottoa varten. Luotiin MRM-menetelmä malliyhdisteille ja niiden metaboliiteille mittausmenetelmäksi Xevo massaspektrometrille, sekä mittausmenetelmä ja standardiliuos kvadrupoli-Orbitrap massaspektrometrille. Onnistuttiin luomaan klorogeenihapon pH-mallinnus, jota voidaan käyttää hyönteisen suolen pH-asteen ennustamiseen, sekä mallinnettiin malliyhdisteiden käyttäytymistä eri pH-asteissa. Lopuksi testattiin luotu menetelmä hyönteisnäytteillä. Tuloksien avulla voidaan jatkaa MetaboKIT työkalun hiomista ja käyttöä. Lopulliseen MetaboKIT menetelmään voidaan tehdä muutoksia, joiden avulla voidaan saada luotettavampia tuloksia. MetaboKIT työkalua valmistaessa kokeiltiin erilaisia menetelmiä ja tapoja, joiden avulla saataisiin luotettavin tulos toistettavasti. Tutkimuksessa käytettiin hyönteiskokeita 35 tehdessä näyteputkia, joiden yhdistepitoisuus oli 4 µg, joka oli lopulta liian laimea pitoisuus, koska yhdisteet hajoavat hyönteisen suolessa. Lopulliseen MetaboKIT menetelmään hyönteiskokeiden näyteputkien yhdistepitoisuus nostetaan 25 µg, jonka avulla toivottavasti nähdään yhdisteet ja niiden metaboliitit paremmin hyönteisistä. Lisäksi menetelmään muutettiin hyönteiskokeita tehdessä näyteputkien sisällön liuottaminen. Tutkimuksessa näyteputket liuotettiin 100 µl 80 % asetonia, ravisteltiin Vortexilla ja sentrifugoitiin. Lopullisessa menetelmässä näyteputket liuotetaan 100 µl 80 % asetonia ja yhdisteet liuotetaan napauttamalla näyteputkea, kunnes nähdään, että sisältö on liuennut kokonaan. Näin vältetään turhia väli vaiheita ja varmistetaan ettei liuos materiaalia jää putken korkkiin. Tutkimuksen lopullisissa mittauksissa käytettiin standardina malliyhdisteiden seosta. Tämän lisäksi lopulliseen menetelmään lisätään standardiseos, jossa on metaboliitteja, kuten gallushappo, triGG ja tetraGG. Tutkimusta voidaan vielä viedä eteenpäin. Seuraava askel tutkimukselle on selvittää yhdisteiden aktiivisuutta isäntäkasveissa ja hyönteisen suolessa kehittämällä kuoppalevy menetelmä. Lisäksi kehitetään menetelmä rasvaliukoisille yhdisteille ja niiden mittaamiselle. MetaboKIT työkalu on jo osittain otettu käyttöön hyönteiskokeiden puolella. Hyönteiskokeita on voitu aloittaa jo ympäri maailmaa, kuten Teksasissa ja Pohjois- Suomessa. 6. Viitteet 1. Shroff, R., Vergara, F., Muck, A., Svatos, A. & Gershenzon, J. Nonuniform distribution of glucosinolates in Arabidopsis thaliana leaves has important consequences for plant defense. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 6196–6201 (2008). 2. Zhen, Y., Aardema, M. L., Medina, E. M., Schumer, M. & Andolfatto, P. Parallel molecular evolution in an herbivore community. Science (80-. ). 337, 1634–1637 (2012). 3. Petschenka, G. & Agrawal, A. A. Milkweed butterfly resistance to plant toxins is linked to sequestration, not coping with a toxic diet. Proc. R. Soc. B Biol. Sci. 282, (2015). 4. Boevé, J. L. & Müller, C. Defence effectiveness of easy bleeding sawfly larvae towards invertebrate and avian predators. Chemoecology 15, 51–58 (2005). 5. Boeckler, G. A., Paetz, C., Feibicke, P., Gershenzon, J. & Unsicker, S. B. Metabolism of poplar salicinoids by the generalist herbivore Lymantria dispar (Lepidoptera). Insect Biochem. Mol. Biol. 78, 39–49 (2016). 36 6. Salminen, J. P., Lahtinen, M., Lempa, K., Kapari, L., Haukioja, E. & Pihlaja, K. Zeitschrift fur Naturforsch. - Sect. C J. Biosci. 2004. 7. Harrison, J. F. Annu. Rev. Entomol. 2001, 46, 221–250. 8. Johnson, K. S. & Felton, G. W. Arch. Insect Biochem. Physiol. 1996, 32, 85–105. 9. Gross, E. M., Brune, A. & Walenciak, O. J. Insect Physiol. 2008, 54, 462–471. 10. Vihakas, M., Gómez, I., Karonen, M., Tähtinen, P., Sääksjärvi, I. & Salminen, J. P., J. Chem. Ecol. 2015. 11. Joanisse, D. & Storey, K. Journal of Experimental Biology 1996, 199. 12. Lalouette, L., Williams, C. M., Hervant, F., Sinclair, B. J. & Renault, D. Comp. Biochem. Physiol. - A Mol. Integr. Physiol. 2011, 158, 229–234. 13. Barbehenn, R. V., Jones, C. P., Karonen, M. & Salminen, J.-P. J. Chem. Ecol. 2006, 32, 2235–2251. 14. Barbehenn, R. V., Jaros, A., Yip, L., Trans, L., Kanellis, A. K. & Constabel, C. P. J. Chem. Ecol. 2008, 34, 1331–1340. 15. Kim, J., Pälijärvi, M., Karonen, M. & Salminen, J. P. J. Chem. Ecol. 2018. 16. Salminen, J. P. & Lempa, K. Chemoecology 2002, 12, 203–211. 17. Berenbaum, M. Am. Nat. 1980, 115, 138–146. 18. Cumming, J. M., Sinclair, B., Triplehorn C., Aldryhim, Y., Glante, E., Marcos- Gracia, M. A., Edmunds, M., Lounihos, L. P., Frank, J. H., Showler, A. T., Yu, S. J., Capinera, J. L., Heppner J. B., Philogène, B. J. R., Lapointe, S. L., Nayar, J. K., Goette, M. S., Nation, J. L., Negron, J. F., Kondratieff, B. C., Schöning, C., Stewart, K. W. & Hangay, G. Encyclopedia of Entomology 2008, 1187–1201. 19. Koulu, M. & Mervaala, E. Farmakologia ja toksikologia. 10. painos, Medicina Oy, 2012, 89-100. 20. Giraudo, M., Hiliou, F., Fricaux, T., Audant, P., Feyereisen, R. & Le Goff, G. Insect Mol. Biol. 2015, 24, 115–128. 21. Li, X., Baudry, J., Berenbaum, M. R. & Schuler, M. A. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2004, 101, 2939–2944. 22. Zhang, Y. E., Ma, H. J., Feng, D. D., Lai, X. F., Chen, Z. M., Xu, M. Y., Yu, Q. Y. & Zhang, Z. J. Econ. Entomol. 2012, 105, 1034–1042. 23. Bibhuti Bhusan Mishra, B. X. Enzym. Eng. 2016, 05, 1–9. 24. Appel, H. M. & Schultz, J. C. Plant Polyphenols 1992, 609–620. 25. Lü, F. G., Fu, K. Y., Li, Q., Guo, W. C., Ahmat, T. & Li, G. Q. Pestic. Biochem. Physiol. 2015, 122, 86–95. 26. Salminen, J.-P. Austral Entomol. 2018, 57, 255–264. 27. Ahn, S. J., Vogel, H. & Heckel, D. G. Insect Biochem. Mol. Biol. 2012, 42, 133– 147. 28. Vihakas, M., Tähtinen, P., Ossipov, V. & Salminen, J. P. J. Chem. Ecol. 2012, 37 38, 538–546. 29. Hirayama, C., Ono, H., Meng, Y., Shimada, T. & Daimon, T. Phytochemistry 2013, 94, 108–112. 30. Lahtinen, M., Lempa, K., Salminen, J. P. & Pihlaja, K. Phytochem. Anal. 2006, 17, 197–203. 31. Lahtinen, M. et al. Defensive effect of surface flavonoid aglycones of Betula pubescens leaves against first instar Epirrita autumnata larvae. J. Chem. Ecol. 30, 2257–2268 (2004). 32. Lahtinen, M., Salminen, J. P., Kapari, L., Lempa, K., Ossipov, V., Sinkonen, J., Valkama, E., Haukioja, E. & Pihlaja, K. Chemoecology 2005. 33. Vihakas, M. A., Kapari, L. & Salminen, J. P. J. Chem. Ecol. 2010, 36, 864–872. 34. Ahmad, S. A. & Hopkins, T. L. Insect Biochem. Molec. Biol 1993, 23. 35. Segar, S. T., Volf, M., Isua, B., Siso, M., Redmond, C. M., Rosati, M. E., Gewa, B., Molem, K., Dahl, C., Holloway, J. D., Basset, Y., Miller, S. E., Weiblen, G. D., Salminen, J. P. & Novotny, V. Proc. R. Soc. B Biol. Sci. 2017, 284. 36. Geuder, M., Wray, V., Fiedler, K. & Proksch’, P. Journal of Chemical Ecology 1997, 23. 37. Baert, N., Karonen, M. & Salminen, J. P. J. Chromatogr. A 2015 Liite 1. Malliyhdisteiden UV-kromatogrammit ja massaspektrometrit. 38 Klorogeenihappo (CQA5) Oenothiini B Prosyanidiini B2 EGCG 10:09:13 Time -0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 % 0 -0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 A U 0.0 2.0e-1 4.0e-1 6.0e-1 8.0e-1 210209 standardi 1 5ul 24: Diode Array 280 Range: 1.05 2.22 221.2 1.90 202.2 1.05 324.2 0.15 190.2 1.42 211.2 210209 standardi 1 5ul 23: MS2 ES- TIC 1.27e9 1.93 463.0 1.08 353.0 1.07 353.3 0.96 783.30.17 795.8 1.45 457.1 2.24 938.7 4.04 298.9 3.98 282.9 2.31 469.1 2.70 1177.8 3.37 632.8 3.09 217.9 4.15 400.0 nm 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 A U 0.0 1.0e-1 2.0e-1 3.0e-1 4.0e-1 210209 standardi 1 5ul 1261 (1.050) 24: Diode Array 5.219e-1324.2 218.2 192.2 243.2 m/z 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 % 0 100 210209 standardi 1 5ul 417 (1.079) 23: MS2 ES- 4.67e7353.0 190.9 172.8 191.4 351.0 191.9 350.5 307.7214.8 353.5 354.0 707.1367.1 704.9 369.6 773.9 997.8793.1 nm 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 A U 0.0 2.5e-2 5.0e-2 7.5e-2 1.0e-1 1.25e-1 1.5e-1 1.75e-1 210209 standardi 1 5ul 1362 (1.134) 24: Diode Array 2.095e-1219.2 m/z 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 % 0 100 210209 standardi 1 5ul 432 (1.163) 23: MS2 ES- 1.72e7783.2 765.1 191.1 190.7 691.9 353.7192.9 341.5 460.1433.7 614.7523.0 783.7 784.1 784.6 833.0 935.2 933.0 1070.91036.4 1075.2 nm 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 A U 0.0 2.0e-1 4.0e-1 6.0e-1 8.0e-1 210209 standardi 1 5ul 1556 (1.296) 24: Diode Array 1.159199.2 278.2 m/z 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 % 0 100 210209 standardi 1 5ul 458 (1.317) 23: MS2 ES- 2.78e7576.9 425.1 407.3 407.1352.9 288.8 191.3 285.4 425.8 426.3 575.8452.6 577.3 577.9 578.6 579.0 1154.9 629.3 676.6 1056.8 1169.4 39 Kversetiini-3-O-glukosidi PGG Meataboliitit TetraGG nm 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 A U 0.0 2.0e-1 4.0e-1 6.0e-1 8.0e-1 1.0 1.2 210209 standardi 1 5ul 1704 (1.419) 24: Diode Array 1.224211.2 273.2 m/z 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 % 0 100 210209 standardi 1 5ul 483 (1.453) 23: MS2 ES- 5.09e7457.1 168.7 169.2 169.7 305.4 268.8 454.9 457.7 915.2 458.6 520.8 914.6 916.1 968.4 nm 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 A U 0.0 2.0e-1 4.0e-1 6.0e-1 8.0e-1 210209 standardi 1 5ul 2281 (1.900) 24: Diode Array 1.18202.2 255.2 352.2 m/z 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 % 0 100 210209 standardi 1 5ul 582 (1.923) 23: MS2 ES- 1.13e8463.0 461.1 300.7 463.6 464.0 464.5 465.1 928.0 nm 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 A U 0.0 2.0e-1 4.0e-1 6.0e-1 8.0e-1 1.0 1.2 210209 standardi 1 5ul 2669 (2.223) 24: Diode Array 1.494221.2 279.2 m/z 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 % 0 100 210209 standardi 1 5ul 663 (2.250) 23: MS2 ES- 5.70e7939.2 938.6 469.3 468.8 392.9 393.4 469.8 937.2 470.4 936.9 769.3496.5 940.2 940.8 941.0 942.8 1036.7 40 TriGG Ellagihappo 17:39:03 Time -0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 % 1 -0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 A U 0.0 1.0e-1 2.0e-1 3.0e-1 210209 pH9_4 PGG_Qglyk_CQA point3 24: Diode Array 280 Range: 4.861e-1 2.22 218.2 1.05 324.2 0.25 190.2 1.90 202.2 1.75 221.2 1.13 325.2 210209 pH9_4 PGG_Qglyk_CQA point3 23: MS2 ES- TIC 1.03e9 1.92 463.31.08 353.2 0.15 317.2 0.20 317.3 0.31;316.8 0.79 375.3 1.16 353.2 1.77 787.4 1.68;908.3 2.25 939.2 2.26 939.3 2.31 469.2 2.56 1024.2 4.11 351.2 2.86 1169.0 3.38 655.2 3.69 813.2 nm 300 400 500 600 700 800 900 1000 A U 0.0 5.0e-3 1.0e-2 1.5e-2 2.0e-2 2.5e-2 3.0e-2 3.5e-2 4.0e-2 210209 pH9_4 PGG_Qglyk_CQA point3 2104 (1.753) Cm (2094:2138) 24: Diode Array 4.48e-2255.2 368.2 m/z 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 % 0 100 210209 pH9_4 PGG_Qglyk_CQA point3 552 (1.773) Cm (551:559) 23: MS2 ES- 3.61e6786.7300.9 169.4 167.5 299.3 169.8 301.4 314.8 394.0 393.1 317.8 617.0 599.2404.1 452.2 535.4 656.0 772.7 688.7 787.2 787.4 788.0 788.5 789.0 937.5840.0 876.1 1142.1938.3 1048.6 1177.5 m/z 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 % 0 100 210209 pH9_0 PGG_Qglyk_CQA point15 441 (1.217) 23: MS2 ES- 5.16e6635.1 247.0 233.6 179.1 178.9 168.6 634.7 353.7 352.7 351.9 291.2 630.5 514.2 382.6 483.0 465.5 452.9 516.2 578.6 635.5 1041.7635.8 658.2 982.1 708.9 783.6 904.0 1118.3 nm 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 A U 0.0 5.0e-2 1.0e-1 1.5e-1 2.0e-1 2.5e-1 3.0e-1 3.5e-1 210209 pH9_0 PGG_Qglyk_CQA point15 2116 (1.763) 24: Diode Array 4.419e-1253.2 367.2 m/z 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 % 0 100 210209 pH9_0 PGG_Qglyk_CQA point15 559 (1.799) Cm (554:562) 23: MS2 ES- 1.03e7301.3 300.9 298.7 261.1 314.9 317.2 634.7317.8 503.6 400.9 626.9 786.8655.8 699.8 788.6 861.1 1133.11003.0 1195.0 41 Gallushappo EGCG metaboliitti m/z 713 Katekiini Prosyanidiini dimeeri Prosyanidiini B2 metaboliitti m/z 591 Oenothiini B metaboliitti m/z 754 nm 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 A U 0.0 1.0e-1 2.0e-1 3.0e-1 4.0e-1 5.0e-1 6.0e-1 210209 pH9_0 OB_ProB2_EGCG point1 1715 (1.428) 24: Diode Array 7.721e-1206.2 273.2 m/z 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 % 0 100 210209 pH9_4 OB_ProB2_EGCG point14 587 (1.970) 23: MS2 ES- 6.13e6713.1 366.0 347.2 543.4 385.2 421.1 485.1 542.9 685.5 675.7543.9 591.9 606.5 883.0764.9 714.0 739.4 831.3 776.4 882.6 1047.9897.0 910.9 988.4 937.3 938.9 1191.4 1097.3 nm 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 A U 0.0 5.0e-3 1.0e-2 1.5e-2 2.0e-2 210211 pH10_6 OB_ProB2_EGCG point3 1597 (1.330) 24: Diode Array 2.446e-2229.2 273.2 m/z 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 % 0 100 210211 pH10_6 OB_ProB2_EGCG point3 458 (1.344) 23: MS2 ES- 7.02e6289.1 288.9 288.5 239.8 160.5 221.8 424.7 289.4 329.2 410.4 406.9 383.8 691.9 425.9 577.3 480.6 430.3 577.0 576.4 494.4 626.7 577.6 874.0 744.8 835.8 783.4 1140.8 914.9 997.3 915.4 1015.9 1082.3 nm 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 A U 0.0 2.5e-3 5.0e-3 7.5e-3 1.0e-2 1.25e-2 1.5e-2 1.75e-2 2.0e-2 210211 pH10_6 OB_ProB2_EGCG point3 2432 (2.026) 24: Diode Array 2.012e-2233.2 276.2 m/z 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 % 0 100 210211 pH10_6 OB_ProB2_EGCG point3 596 (2.050) 23: MS2 ES- 5.88e6575.0 423.0 422.8 321.4 302.7 190.6 168.9 288.9 392.2 381.2 344.6 530.8 519.6 424.1 515.6 943.0 618.6 884.1 643.1 712.8 810.5 798.8 881.2 843.3 935.9 1111.7 979.4 1041.6 1189.0 nm 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 A U 0.0 5.0e-3 1.0e-2 1.5e-2 2.0e-2 2.5e-2 3.0e-2 3.5e-2 4.0e-2 210211 pH10_6 OB_ProB2_EGCG point3 1340 (1.116) 24: Diode Array 4.222e-2225.2 270.2 m/z 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 % 0 100 210211 pH10_6 OB_ProB2_EGCG point3 424 (1.125) 23: MS2 ES- 3.22e6592.1 395.8 299.9 260.4208.4 193.1 366.1 305.4 575.1 438.8 439.8 493.0 752.8 668.1 644.6 723.9 721.1 759.7 789.8 817.5 1160.1 823.2 885.7 1000.1 933.8 934.7 1187.9 nm 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 A U 0.0 1.0e-2 2.0e-2 3.0e-2 4.0e-2 5.0e-2 210209 pH9_4 OB_ProB2_EGCG point12 1555 (1.295) 24: Diode Array 5.869e-2222.2 272.2 m/z 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 % 0 100 210209 pH9_4 OB_ProB2_EGCG point12 454 (1.305) 23: MS2 ES- 4.48e6834.2 754.3 753.6 665.4 355.3 167.4 317.0229.9 264.0 413.3 399.8 563.7 550.8481.6 519.0 596.3 727.3 670.7 722.9 782.7 785.6 879.8903.1 1058.6935.1 986.7 1127.7 1141.6 1149.1 42 Liite 2. Malliyhdisteiden pH-mallinus kolmen tunnin ajalta 11 eri pH-asteessa. Kolme pH-astetta, 9.0, 10.0 ja 11.0, on esitetty Kuvassa 11. 0 10 20 30 40 50 60 70 0 50 100 150 P it o is u u s (µ g/ m l) Aika (min) pH 9.2 m/z 939 m/z 463 m/z 353 m/z 783 m/z 577 m/z 457 0 10 20 30 40 50 60 70 0 50 100 150 P it o is u u s (µ g/ m l) Aika (min) pH 9.4 m/z 939 m/z 463 m/z 353 m/z 783 m/z 577 m/z 457 43 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 50 100 150 P it o is u u s (µ g/ m l) Aika (min) pH 9.6 m/z 939 m/z 463 m/z 353 m/z 783 m/z 577 m/z 457 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0 50 100 150 P it o is u u s (µ g/ m l) Aika (min) pH 9.8 m/z 939 m/z 463 m/z 353 m/z 783 m/z 577 m/z 457 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 50 100 150 P it o is u u s (µ g/ m l) Aika (min) pH 10.2 m/z 939 m/z 463 m/z 353 m/z 783 m/z 577 m/z 457 44 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0 50 100 150 P it o is u u s (µ g/ m l) Aika (min) pH 10.4 m/z 939 m/z 463 m/z 353 m/z 783 m/z 577 m/z 457 0 10 20 30 40 50 60 70 0 50 100 150 P it o is u u s (µ g/ m l) Aika (min) pH 10.6 m/z 939 m/z 463 m/z 353 m/z 783 m/z 577 m/z 457 0 10 20 30 40 50 60 0 50 100 150 P it o is u u s (µ g/ m l) Aika (min) pH 10.8 m/z 939 m/z 463 m/z 353 m/z 783 m/z 577 m/z 457