Non-obstruktiivisen atsoospermian vaikutus alkiolaatuun Sanni Pinomäki Pro gradu -tutkielma Turun yliopisto Biologian laitos 2.12.2024 Turun yliopiston laatujärjestelmän mukai- sesti tämän julkaisun alkuperäisyys on tar- kastettu Turnitin OriginalityCheck -järjes- telmällä. Turun yliopisto BIOLOGIAN LAITOS Matemaattis-luonnontieteellinen tiedekunta SANNI PINOMÄKI: Non-obstruktiivisen atsoospermian vaikutus alkiolaatuun Pro gradu- tutkielma, 46 s. Eläinfysiologia Joulukuu 2024 Turun yliopiston laatujärjestelmän mukaisesti tämän julkaisun alkuperäisyys on tarkastettu Turnitin OriginalityCheck -järjestelmällä. ___________________________________________________________________________ Tahattomasta lapsettomuudesta kärsii jossain vaiheessa elämäänsä noin 15 % hedelmällisessä iässä olevista pareista. Arviolta 30–40 % lapsettomuutta selittävistä syistä johtuu pelkästään miehestä. Vaikeimmassa miehen hedelmättömyydessä, non-obstruktiivisessa atsoospermiassa (NOA), potilaan siittiötuotanto on vaikeasti häiriintynyt ja se saattaa olla hyvin paikallista. NOA-potilaalta ei yleensä löydetä siittiöitä siemennesteestä. Osalta NOA-potilaita siittiöitä on kuitenkin mahdollista löytää kiveskudoksesta mikrodissektioleikkauksen (MD-TESE) avulla. NOA-potilaiden lapsettomuutta hoidetaan Suomessa pääosin Turun yliopistollisen keskussai- raalan (Tyks) lisääntymislääketieteen yksikössä. Tässä työssä tutkittiin Tyksin NOA-potilaiden siittiöillä aikaansaatujen alkioiden alkiolaatua. Verrokkiryhmänä käytettiin alkioita, jotka oli saatu aikaan obstruktiivista atsoospermiaa (OA) sairastavilta miehiltä, neulabiopsialla (TESA), talteen otetuilla siittiöillä. OA-miesten sperma- togeneesi on normaali, mutta siittiöiden pääsy siemennesteeseen on estynyt. NOA:n taustalla on useita eri diagnooseja. Tutkimuksessa selvitettiin, vaikuttaako NOA-miehen taustadiagnoosi munasolujen hedelmöittymiseen ja alkiolaatuun. Lisäksi tutkittiin, vaikuttaako MD-TESE -me- netelmällä saatujen siittiöiden määrä alkiolaatuun. Vaikeimmissa NOA-tapauksissa saadaan talteen vain yksittäisiä siittiöitä, eikä käytettäviä siittiöitä päästä mikroinjektiossa valitsemaan morfologian perusteella. Vaikka NOA-potilaiden spermatogeneesi on vaikeasti häiriintynyt, munasolujen hedelmöitty- minen ja alkiolaatu eivät eronneet toisistaan NOA-potilaiden ja OA-potilaiden siittiöillä tehty- jen hoitojen välillä. Myöskään NOA-potilaiden eri diagnooseilla ei ollut vaikutusta munasolu- jen hedelmöittymiseen tai alkiolaatuun. Koska NOA-potilaiden spermatogeneesi on vaikeasti häiriintynyt, löydetään MD-TESE:n avulla usein vain yksittäisiä siittiöitä. Näillä tehdyissä, vaa- tivissa ICSI-hoidoissa, munasolujen hedelmöittyminen ja alkiolaatu oli tilastollisesti huonompi kuin niissä hoidoissa, joissa siittiöitä oli niin paljon, että niistä voitiin valita morfologialtaan parhaat siittiöt mikrohedelmöitykseen. Tieto NOA-potilaan siittiöillä aikaansaatujen alkioiden laatuun vaikuttavista syistä, kuten taustadiagnoosista ja käytettävissä olevien siittiöiden määrästä, auttaa ennustamaan hoidon on- nistumisen todennäköisyyttä. Tämä voi auttaa päättämään, hoidetaanko pariskunnan lapsetto- muutta omilla vai luovutetuilla sukusoluilla. Tämän tutkimuksen perusteella millekään yksit- täiselle NOA-potilasryhmälle ei ole syytä suositella ensisijaisesti lahjasiittiöiden käyttöä, jos omia siittiöitä löydetään MD-TESE:n avulla. ___________________________________________________________________________ AVAINSANAT: alkiolaatu, Non-obstruktiivinen atsoospermia, Obstruktiivinen atsoospermia, Klinefelterin syndrooma (47, XXY), Y-kromosomin mikrodeleetio, Idiopaattinen atsoos- permia, miehen vaikea hedelmättömyys, MD-TESE Sisällys 1. JOHDANTO ........................................................................................................................... 1 1.1 Miehen hedelmällisyyden kehittyminen ........................................................................... 2 1.1.1 Kivesten tärkeimmät tehtävät; spermatogeneesi ja testosteronin eritys .................... 2 1.2 Hedelmällisyyden tutkiminen ja häiriöt siittiötuotannossa............................................... 3 1.2.1 Siemennesteanalyysi .................................................................................................. 3 1.2.2 Atsoospermia ............................................................................................................. 4 1.2.2.1 Obstruktiivinen- ja Non-obstruktiivinen atsoospermia........................................... 5 1.3 Atsoospermian syyn selvittäminen ja hoito ...................................................................... 7 1.3.1 Kivesbiopsiamenetelmät ............................................................................................ 8 1.3.2 MD-TESE-ICSI ........................................................................................................ 9 1.4 Alkioiden luokittelu ja valinta ....................................................................................... 10 1.5 Kiveskudoksesta löydettyjen siittiöiden käyttö hedelmöityshoidoissa ......................... 12 1.5.1 Munasolujen hedelmöittyminen ja alkiolaatu OA- ja NOA-potilaiden hoidoissa .. 14 1.6 Tutkimuksen tavoitteet ................................................................................................... 15 2. AINEISTO JA MENETELMÄT ......................................................................................... 17 2.1 Tutkimuksessa käytettävä aineisto ................................................................................. 17 2.2 Siittiöiden keräysmenetelmät ......................................................................................... 17 2.2.1 Kiveksen mikrodissektioleikkaus, MD-TESE ......................................................... 17 2.2.2 Kiveksen neulabiopsia, TESA ................................................................................ 18 2.3 MD-TESE- ja TESA-ICSI ja alkioviljely ....................................................................... 18 2.4 Alkioiden luokittelu tutkimusta varten ........................................................................... 20 2.5 Tilastoanalyysit ............................................................................................................... 21 3. TULOKSET ......................................................................................................................... 22 3.1 Alkiolaatu ja hedelmöittyminen NOA- ja OA-potilaiden ICSI-hoidoissa ..................... 22 3.1.1 Naisten taustatekijät NOA- ja OA-ryhmissä ........................................................... 22 3.1.2 Alkiolaadun ja munasolujen hedelmöittymisen vertailu NOA- ja OA-potilaiden ICSI-hoidoissa .................................................................................................................. 22 3.1.3 Synnytykseen johtaneiden alkioiden laatu ............................................................... 24 3.2 Alkiolaadun vertailu NOA-diagnoosiryhmien välillä .................................................... 24 3.2.1 Diagnoosiryhmien taustamuuttujat .......................................................................... 24 3.2.2 Munasolujen hedelmöittymisen ja alkiolaadun vertailu diagnoosiryhmien välillä.. 25 3.2.3 Synnytykseen johtaneiden alkioiden laatu NOA-diagnoosiryhmien välillä ............ 27 3.3 NOA-potilaan ICSI-hoidon vaativuuden vaikutus munasolujen hedelmöittymiseen ja alkiolaatuun........................................................................................................................... 27 3.3.1 Vaativien ja helppojen ICSI-hoitojen taustatekijät .................................................. 27 3.3.2 Munasolujen hedelmöittymisen ja alkiolaadun vertailu helppojen ja vaativien MD-TESE-ICSI -hoitojen välillä ...................................................................................... 28 3.3.3 Synnytykseen johtaneiden alkioiden laatu vaativissa ja helpoissa MD-TESE-ICSI -hoidoissa ............................................................................................... 29 4. TULOSTEN TARKASTELU .............................................................................................. 30 4.1 Alkiolaatu NOA-potilaiden ICSI-hoidoissa ................................................................... 30 4.2 NOA-potilaan taustadiagnoosin vaikutus alkiolaatuun .................................................. 31 4.3 Siittiöiden valinnan merkitys mikrohedelmöityksessä ................................................... 33 4.4 Johtopäätökset ja tulevaisuus miehen vaikean lapsettomuuden hoidossa ...................... 34 KIITOKSET ............................................................................................................................. 36 LÄHTEET ................................................................................................................................ 37 LYHENTEET AMH, anti-Müllerian hormoni AZF, Y-kromosomin atsoospermiatekijä FSH, follikkelia stimuloiva hormoni GnRH, Gonadotropiinia vapauttava hormoni hCG, istukkagonadotropiini ICSI, intracytoplasmic sperm injection, mikrohedelmöitys LH, Luteinisoiva hormoni MA, Maturation arrest MD-TESE, mikro-TESE, Kiveskudoksen mikrodissektioleikkaus NOA, Non-obstruktiivinen atsoospermia OA, Obstruktiivinen atsoospermia SCO, Sertoli cell-only TESA, kivesbiopsia Tyks, Turun yliopistollinen keskussairaala WHO, World Health Organization 1 1. JOHDANTO Tahattomasta lapsettomuudesta kärsii jossain vaiheessa elämäänsä noin 15 % hedelmällisessä iässä olevista pareista. Arviolta 30–40 % lapsettomuutta selittävistä syistä johtuu pelkästään miehestä (Sharlip ym. 2002). Miesten yleisimmät syyt lapsettomuuteen ovat erilaiset sperma- togeneesin eli siittiötuotannon häiriöt (Tiitinen & Savolainen-Peltonen 2019). Vaikeimmassa miehen hedelmättömyydessä, non-obstruktiivisessa atsoospermiassa (NOA), potilaiden siittiö- tuotanto on vaikeasti häiriintynyt ja siittiötuotanto kiveksessä saattaa olla hyvin paikallista. Näiltä potilailta ei yleensä löydetä siittiöitä siemennesteestä. NOA-potilailta siittiöitä on kui- tenkin mahdollista löytää kiveskudoksesta mikrodissektioleikkauksen (MD-TESE) avulla. MD-TESE-menetelmällä siittiöt kerätään suoraan kiveskudoksesta ja löydetyt siittiöt pakaste- taan myöhempää käyttöä varten tai puolison munasolujen keräys ja hedelmöitys ajoitetaan MD- TESE-päivään. Potilaan puolisolta kerättävät munasolut hedelmöitetään mikroinjektiolla (ICSI) viemällä yksi siittiö munasoluun. Alkionkehitystä seurataan tietyissä aikapisteissä IVF- laboratoriossa. Yksi alkio siirretään kohtuun ja loput hyvälaatuiset alkiot pakastetaan myöhem- pää käyttöä varten. Ennen mikrohedelmöityksen ja MD-TESE-kiveskirurgian kehittämistä NOA-miehillä ei ollut mahdollisuutta biologiseen lapseen. MD-TESE-siittiöillä tehdyt mik- roinjektiohoidot on todettu tehokkaaksi tavaksi hoitaa miehen vaikeaa lapsettomuutta ja näistä hoidoista on syntynyt terveitä lapsia (Klami ym. 2024). Vaikka MD-TESE-siittiöitä on käytetty hedelmöityshoidoissa jo pitkään, on vähän tietoa siitä, miten NOA:an johtaneet taustatekijät vaikuttavat siittiöihin ja niillä aikaan saatujen alkioiden laatuun. NOA-potilaiden lapsettomuutta hoidetaan Suomessa pääosin Turun yliopistollisen keskussai- raalan (Tyks) lisääntymislääketieteen yksikössä. Tämä työ on retrospektiivinen tutkimus Tyksin NOA-potilaiden siittiöillä aikaansaatujen alkioiden alkiolaadusta. Verrokkiryhmänä käytetään alkioita, jotka on saatu aikaan obstruktiivista atsoospermiaa (OA) sairastavilta miehiltä neula- biopsialla (TESA) talteen otetuilla siittiöillä. OA-miesten spermatogeneesi on normaali, mutta siittiöiden pääsy siemennesteeseen on estynyt. NOA:n taustalla on useita eri diagnooseja. Tut- kimuksessa selvitetään, vaikuttaako NOA-miehen taustadiagnoosi munasolujen hedelmöitty- miseen ja alkiolaatuun. Tutkimuksen tavoitteena on myös selvittää, vaikuttaako MD-TESE- menetelmällä saatujen siittiöiden määrä alkiolaatuun, sillä vaikeimmissa NOA-tapauksissa saa- daan talteen vain yksittäisiä siittiöitä, eikä käytettäviä siittiöitä päästä mikroinjektiossa valitse- maan morfologian perusteella. 2 1.1 Miehen hedelmällisyyden kehittyminen Miehen hedelmällisyyden kehittyminen alkaa jo sikiökaudella sukupuolen erilaistumisella. Ge- neettisillä miehillä (46, XY) Y-kromosomin SRY-geeni saa aikaan miehen sukurauhasten eli kivesten kehittymisen ja testosteronia erittävien Leydigin solujen erilaistumisen. Testosteroni stimuloi miehen sukupuolielinten kehitystä. Sikiön kives erittää myös anti-Müllerian hormonia (AMH), joka aiheuttaa Müller-tiehyiden regression ja estää siten kohtua ja munanjohtimia ke- hittymästä. Sukupuolirauhasten toimintaa ohjaa hypotalamus-aivolisäke -akseli. Hypotalamuksen erittä- män gonadotropiinia vapauttavan hormonin (GnRH) sekä aivolisäkkeen etulohkon hormonien, gonadotropiinien; follikkelia stimuloivan hormonin (FSH) ja luteinisoivan hormonin (LH) erit- tyminen alkaa jo sikiöaikana, mutta GnRH-, FSH- ja LH-tasot pysyvät alhaisina murrosikään asti. Murrosiässä GnRH:n pulssittainen erittyminen saa aikaan FSH:n ja LH:n erittymisen ai- volisäkkeen etulohkossa sekä aivolisäkkeen etulohkon GnRH-reseptorien määrän lisääntymi- sen. FSH:n ja LH:n eritys stimuloi kiveksien testosteronin eritystä. GnRH:n pulssittainen eritys on välttämätöntä normaaleille lisääntymistoiminnoille. FSH stimuloi kiveksissä siittiötuotantoa eli spermatogeneesiä sekä Sertolin solujen toimintaa. LH stimuloi kivesten Leydigin soluja syn- tetisoimaan testosteronia. Testosteroni erittyy Leydigin soluista siementiehyissä oleviin Serto- lin soluihin, joissa se vahvistaa FSH:n spermatogeenistä toimintaa. Kiveksen paikallinen testo- steronipitoisuus on välttämätöntä normaalille siittiötuotannolle. Miehen hypotalamus-aivoli- säke-akselia ohjaa negatiivinen palautesäätely. Testosteroni estää hypotalamuksen etulohkon GnRH:n eritystä sekä aivolisäkkeen LH:n eritystä. Sertolin solujen erittämä inhibiini toimii ai- volisäkkeen FSH-erityksen estäjänä. 1.1.1 Kivesten tärkeimmät tehtävät; spermatogeneesi ja testosteronin eritys. Kivekset sijaitsevat kivespussissa, hieman erillään muusta kehosta, jolloin niiden lämpötila on 1–2 °C ruumiinlämpötilan alapuolella. Siittiöiden tuotanto on mahdollista vain ruumiinlämpöä alemmassa lämpötilassa, minkä takia korjaamaton piilokiveksisyys aiheuttaa hedelmättömyy- den. 80 % kiveksestä koostuu tubulusmaisista siementiehyistä. Spermatogeneesi eli siittiötuo- tanto alkaa siementiehyiden itusoluista, jotka ovat kosketuksissa Sertolin soluihin. Sertolin so- lut tukevat kehittyviä siittiöitä tarjoamalla niille ravinteita sekä toimivat viestinvälittäjäsoluina välikudoksen ja kehittyvien siittiöiden välillä. Lisäksi Sertolin solut luovat esteen kivesten ja verenkierron välille (veri-kiveseste) sekä erittävät androgeenia sitovia proteiineja siementiehyi- siin, mikä auttaa pitämään kiveksen paikallista testosteronipitoisuutta korkealla. Loput 20 % 3 aikuisen kiveksestä on sidekudosta, jossa on Leydigin soluja. Leydigin solujen tehtävänä on testosteronin synteesi ja eritys. Sidekudoksessa sijaitsee myös kiveksen veri- ja imusuonisto, joiden välityksellä tapahtuu kiveksen endokriininen, parakriininen ja autokriininen säätely. Tes- tosteronilla on sekä paikallisia (parakriinisiä) vaikutuksia, jotka tukevat spermatogeneesiä ki- vesten Sertolin soluissa, että endokriinisia vaikutuksia muihin kohde-elimiin. Siementiehyiden epiteelissä olevien itusolujen erilaistuminen siittiöiksi kestää noin 10 viikkoa. Varhaisimmat spermatogoniot sijaitsevat siemenepiteelin laidalla ja ne jakautuvat mitoottisesti primaarisiksi spermatosyyteiksi. Kun primaarinen spermatosyytti saavuttaa preleptoteenivai- heen, alkaa meioottinen jakautuminen. Meioosissa on kaksi solunjakautumista, vähennysjakau- tuminen ja tasausjakautuminen. Ennen meioosin ensimmäistä jakautumista, eli vähennysjakau- tumista, tapahtuvat kromosomien pariutuminen ja tekijäinvaihdot, minkä jälkeen primaariset spermatosyytit jakautuvat haploideiksi sekundaarisiksi spermatosyyteiksi. Meioosin toisessa jakautumisessa sekundaariset spermatosyytit jakautuvat kerran, jolloin syntyy spermatidejä eli esisiittiöitä. Spermatidien kehitystä siittiöiksi kutsutaan spermiogeneesiksi. Siinä tuma ja sy- toplasma muokkautuvat, kromatiini pakkautuu tiiviisti ja siittiön pää muodostuu. Lisäksi siitti- ölle muodostuu häntä, joka mahdollistaa liikkumisen. Kypsät siittiöt irtoavat siementiehyistä ja kulkeutuvat lisäkivekseen, joka on siittiöiden ensisijainen varastointipaikka. Matkalla lisäki- vekseen siittiöt kypsyvät biokemiallisesti ja niiden ympärille muodostuu glykoproteiinivaippa. Siittiöt pysyvät elinkelpoisina lisäkiveksessä useita kuukausia. Siittiöitä tuotetaan normaalisti aikuisen miehen kiveksissä noin 150 miljoonaa päivässä. Siittiö jaetaan morfologisesti päähän, keskikappaleeseen sekä häntään. Kromatiini on pakkautunut tii- viisti siittiön päähän ja pään ulkopuolella on akrosomihuppu, jossa on proteolyyttisiä entsyy- mejä. Siittiön kaulaosassa on sentriolien muodostama kappale, johon mikrotubulukset ovat kiinnittyneet. Siittiön keskikappale sisältää mitokondrioita, joiden tuottamalla energialla häntä liikkuu. 1.2 Hedelmällisyyden tutkiminen ja häiriöt siittiöntuotannossa 1.2.1 Siemennesteanalyysi Miehen hedelmällisyyden tutkiminen aloitetaan siemennesteanalyysilla. Siemennesteen laatu määritetään siittiöiden lukumäärän, liikkuvuuden ja siittiöiden morfologian mukaan. WHO (World Health Organization) on julkaissut standardoidun menetelmän siemennesteparametrien arviointiin, mikä sisältää viitearvot normaalille hedelmällisyydelle (Björndahl & Kirkman 4 Brown 2022). Siittiöiden kokonaismäärän tulisi olla ≥ 39 milj./ejakulaatti. Siittiötiheyden pie- nentyessä alle 30–40 milj./ml alkaa hedelmällisyys laskea, vaikkakin täydellinen hedelmättö- myys ilmenee vasta, kun siittiöitä on alle 5 milj./ml (Bonde ym. 1998). Saavuttaakseen normaa- lin hedelmöityskyvyn siittiön morfologian (pää, kaula ja häntä) tulisi olla normaali. Siittiöiden liikkeen normaaliarvona pidetään ≥ 42 % kokonaismäärästä ja eteenpäin liikkuvia siittiöitä tu- lisi olla vähintään 30 % kaikista ejakulaatin siittiöistä. Liikkumattomat siittiöt eivät yleensä ole hedelmöityskykyisiä. Siittiöiden puuttumista kahteen kertaan otetusta siemennesteestä kutsu- taan atsoospermiaksi (Taulukko 1). Taulukko 1. Siemennesteen normaaliarvot (WHO 2022) ja epänormaalisiemenneste Ejakulaatin tilavuus (ml) ≥ 1.4 Siittiötiheys (milj./ml) ≥ 15 Siittiöiden kokonaismäärä (milj./ejakulaatti) ≥ 39 Liikkuvuus (%) ≥ 42 Progressiivinen liikkuvuus (%) ≥ 30 Normaalimuotoiset siittiöt (%) ≥ 4 Normospermia normaali siemenneste Atsoospermia ei siittiöitä siemennesteessä Oligotsoospermia siittiöiden määrä epänormaali Astenotsoospermia siittiöiden liike epänormaali Teratotsoospermia siittiöiden morfologia epänormaali Aspermia ei siemennestettä Oligoastenoteratotsoospermia siittiöiden määrä, liike ja morfologia epänormaali 1.2.2 Atsoospermia Atsoospermiaa havaitaan noin 1 %:lla miehistä. Syyt atsoospermiaan voidaan jakaa kolmeen luokkaan; hypotalamus-aivolisäke -akselin toimintahäiriöihin, primäärisiin spermatogeneesin häiriöihin sekä urogenitaalisten tiehyiden tukkeumiin (Tournaye ym. 2017). Hypogonadotroop- pinen hypogonadismi on hypotalamus-aivolisäke -akselin toimintahäiriö, jolle on tunnus- omaista LH- ja FSH-erityksen puute, joka voi johtua geneettisistä tai ympäristötekijöistä ja/tai liittyä primaariseen aivolisäkkeen vaurioon tai sekundaariseen hypotalamuksen heikentynee- seen GnRH-tuotantoon (Pitteloud ym. 2010). Vähäinen LH:n eritys johtaa alhaiseen testostero- nin tuotantoon ja vaikuttaa spermatogeneesiin vähentäen siittiöiden tuotantoa (Välimäki 2009). Hypogonadotrooppista hypogonadismia sairastavan miehen spermatogeneesi saadaan usein käynnistettyä käyttämällä gonadotropiineja tai gonadotropiinien vapauttajahormonia (Young 5 ym. 2019). Syynä primääriselle kivesperäiselle spermatogeneesin häiriölle voi olla jokin ge- neettinen poikkeavuus, kuten Klinefelterin syndrooma (47, XXY), Y-kromosomin mikrodelee- tio/-deleetiot tai erilaiset sairaudet sekä aikaisemmin saadut solunsalpaaja- tai sädehoidot. Usein syy primääriseen spermatogeneesin puuttumiseen jää kuitenkin tuntemattomaksi (Fedder ym. 2004). Kivesperäiselle spermatogeneesin häiriölle on tyypillistä suurentunut FSH:n ja LH:n määrä seerumissa ja joskus myös seerumin poikkeavan pieni testosteronipitoisuus. Uro- genitaalitiehyiden tukkeumissa siittiöiden kulkeutuminen kiveksistä lisäkivesten kautta sie- mennesteeseen on estynyt sterilisaation, anatomisen poikkeavuuden, infektion tai kiveksiin kohdistuneen trauman vuoksi. Atsoospermiaan johtavat syyt voivat olla sekä sisäisistä että ulkoisista ympäristötekijöistä joh- tuvia tai synnynnäisiä geneettisiä tekijöitä. Sisäisistä ja ulkoisista ympäristötekijöistä johtuvia syitä ovat mm. kivestulehdus, saatu sytostaattihoito, siemenjohtimien tukkeumat sekä keskus- hermoston kasvaimet. (Tournaye ym. 2017). Tunnettuja synnynnäisiä geneettisiä tekijöitä löy- detään sekä primäärisestä ja sekundaarisesta kivesten vajaatoiminnasta, että urogenitaalien tuk- keumista (Krausz ym. 2018). 1.2.2.1 Obstruktiivinen- ja Non-obstruktiivinen atsoospermia Obstruktiiviseksi atsoospermiaksi (OA) kutsutaan tilaa, jossa siittiöiden tuotanto on normaalia, mutta niiden kulkeutuminen siemennesteeseen on estynyt. Non-obstruktiivisessa atsoospermi- assa (NOA) siittiötuotanto on vaikeasti häiriintynyt. NOA on miehen lisääntymisongelmien va- kavin muoto ja se aiheuttaa 10–15 % miesten hedelmättömyydestä (Chiba ym. 2016). NOA-potilaista vain noin 30 %:lta löydetään jokin syy atsoospermiaan. Noin 17 %:a NOA:ista selittyy Klinefelterin oireyhtymällä (47, XXY) sekä Y-kromosomin mikrodeleetioilla (Fedder ym. 2004). Klinefelterin oireyhtymä on kromosomipoikkeavuus, joille on tunnusomaista yksi tai useampi ylimääräinen X-kromosomi. Siihen liittyy tyypillisesti siementiehyiden surkastu- minen, atsoospermia ja hedelmättömyys. Oireyhtymän molekyyliperustaa ei tunneta täysin. Vaikka kaikki Klinefelter-alkion solut olisivat karyotyypiltään 47, XXY, pieni osa esipuberteet- tisten kivesten sukusoluista on diploideja (46, XY). Tämä johtuu todennäköisesti siitä, että yli- määräinen X-kromosomi voi hävitä spermatogonioiden mitoottisten jakautumisten aikana (Oa- tes, 2016). Suurin osa varhaisista sukusoluista Klinefelterin oireyhtymää sairastavien esimur- rosikäisten poikien kiveksissä on karyotyyppiä 47, XXY, eivätkä nämä kantasolut pysty käy- mään läpi meioosia, vaan nykykäsityksen mukaan ne poistuvat elimistöstä apoptoosin avulla 6 pian murrosiän jälkeen (Vialard ym.2012). Vain spermatogoniot, joissa on normaali karyo- tyyppi 46, XY käyvät spermatogeneesin loppuun ja tuottavat haploideja siittiöitä, joita voidaan löytää spermatogeneesisaarekkeista. Y-kromosomin atsoospermiatekijän (AZF) alueen mikrodeleetiot ovat yksi atsoospermiaan joh- tavista tunnetuista geneettisistä tekijöistä (Hopps, 2003). AZF-alueella on kolme lokusta, joita kutsutaan nimellä AZFa, AZFb ja AZFc, joista jokainen alue sisältää geenejä, jotka vastaavat osaltaan spermatogeneesistä (Vogt, 1996). Miehillä, joilla todetaan AZFc-deleetioita, voi siitti- öiden löytymisprosentti kiveksistä olla jopa 70 %, kun taas miehiltä, joilla on täydellinen AZFa- ja AZFb-deleetio, on siittiöiden löytymisen todennäköisyys erittäin huono. Tunnettujen geneettisten syiden lisäksi non-obstruktiivinen atsoospermia voi selittyä sisäisillä tai ulkoisilla ympäristötekijöillä. Tietyt sytostaattihoidot vaikuttavat jakautuviin soluihin sekä siittiöiden kantasoluihin, joiden DNA vaurioituu. Tämä aiheuttaa pysyvän atsoospermian (Ho- well ym. 1999). Osa sytostaateista on kuitenkin vähemmän gonadotoksisia ja johtavat vain ti- lapäiseen siittiöiden määrän vähenemiseen, koska ne vaikuttavat ensisijaisesti erilaistuviin siit- tiöihin eivätkä siittiöiden kantasoluihin (Meistrich 2013). Miehille, joille suunnitellaan syto- staattihoitoja, suositellaan aina siittiöiden pakastusta fertiliteetin säilyttämiseksi ennen syto- staattihoidon aloitusta. Piilokiveksisten miesten laskeutumattomat kivekset ovat altistuneet liian korkealle lämpötilalle, mikä aiheuttaa siittiöiden kypsymishäiriön ja Leydigin sekä Serto- lin solujen surkastumisen (Sangwan ym. 2021). Lisäksi NOA voi olla seuraus erilaisista infek- tioista (Bachir & Jarvi 2014). Noin 70 % NOA:a selittävistä syistä jää kuitenkin tuntematto- miksi (Cioppi ym. 2021). NOA:ssa kivesten vajaatoiminta voi johtaa kolmeen erilaiseen kiveksen histologiseen tilaan, jotka ovat Sertoli cell-only (SCO), Maturation arrest (MA) sekä hypospermatogeneesi (Tour- naye ym. 2017). SCO on näistä kaikkein yleisin. SCO-tila johtuu spermatogeneettisten kanta- solujen tuhoutumisesta, jolloin kiveksestä puuttuvat kaikki spermatogeneesin solut ja siemen- tiehyissä on vain Sertolin soluja. Tarkkaa syytä Sertoli cell-only -syndroomaan ei tiedetä, mutta ainakin Y-kromosomin mikrodeleetio AZFc:n, (Azoospermia factor c), Klinefelterin oireyhty- män ja kiveskohjujen on tunnistettu liittyvän siihen (Stouffs ym. 2016). Maturation arrest on tila, jossa siittiöiden kypsyminen pysähtyy ennenaikaisesti. Pysähtyminen voi tapahtua sperma- togonio- tai spermatosyyttivaiheessa, jolloin tilaa kutsutaan varhaiseksi kypsymispysähty- miseksi (early maturation arrest). Jos siittiötuotanto pysähtyy spermatidivaiheessa, tilaa kutsu- 7 taan myöhäiseksi kypsymispysähdykseksi (late maturation arrest). Varhaisessa kypsymispysäh- dyksessä seerumin FSH pitoisuus on kohonnut ja testosteroni pitoisuus pienentynyt ja näiltä potilailta löydetään yleensä vähemmän kypsiä siittiöitä (Weedin ym. 2011). Hypospermatoge- neesissä esiintyy kaikkia siittiöiden esiasteita, mutta niiden määrä on vähentynyt (Abdullah & Bondagji 2011). 1.3 Atsoospermian syyn selvittäminen ja hoito Vaikeaa miehen hedelmättömyyttä, jossa siittiöt puuttuvat siemennesteestä, pystytään hoita- maan mikrohedelmöityshoidon (ICSI, intracytoplasmic sperm injection) avulla, jos mieheltä löydetään siittiöitä suoraan kiveskudoksesta. Näin myös atsoospermisillä miehillä on mahdol- lisuus biologiseen lapseen. Atsoospermian syyn selvittäminen mahdollisimman tarkasti ennen hoitojen aloittamista on tärkeää. Siittiöiden löytymisen todennäköisyys vaihtelee NOA-miehillä merkittävästi riippuen etiologiasta, kun taas OA:ssa siittiöitä löytyy lähes aina. Atsoos- permiapotilaiden alkututkimuksiin kuuluvat esitietojen selvittäminen, potilaan yleistilan tutki- minen, laboratoriokokeet, kivesten palpaatio ja kaikukuvaus. NOA voidaan alkuselvittelyiden perusteella tunnistaa noin 90 %:n spesifisyydellä (Huang ym. 2018). Anamneesilla kartoitetaan suvussa esiintyviä sairauksia sekä mahdollisia atsoospermiaa aiheut- tavia aikaisempia sairauksia, leikkauksia ja lääkityksiä. Yleistilan tutkimuksessa mitataan paino, pituus, ja huomioidaan ruumiinrakenne sekä karvoitus. Genitaalialueen tutkimuksessa arvioidaan kivesten ja lisäkivesten koko, mahdolliset kiveskyhmyt ja kiveskohjut sekä tutkitaan siemenjohtimet. Lisäksi tutkitaan siitin sekä tarkastetaan virtsaputken suuaukon sijainti. Kivek- set kaikukuvataan kiveskohjujen ja kasvainten poissulkemiseksi. Peruslaboratoriotutkimuksilla pyritään sulkemaan pois yleissairaudet. Hormonimääritysten (LH, FSH, prolaktiini ja testoste- roni) avulla tutkitaan aivolisäkkeen toimintaa ja arvioidaan lääkehoidon hyödyllisyyttä ennen mahdollista kivesbiopsiaa. Lisäksi kromosomitutkimuksella etsitään geneettisiä poikkeavuuk- sia, joita ovat muun muassa Klinefelterin oireyhtymä 47, XXY ja Y-kromosomin mikrodelee- tiot (Klami ym. 2018). Geneettinen seulonta on tärkeää diagnoosin määrittämiseksi, kliinisen päätöksenteon tueksi sekä geneettisen neuvonnan perusteeksi (Krausz & Riera-Escamilla 2018). Hormonihoidolla saadaan yleensä palautettua siittiötuotanto hypogonadotrooppisessa hypogonadismissa. Hormonihoidoista saattaa olla apua myös ennen kivesbiopsiaa, jos testoste- ronipitoisuus on pieni. Tällöin yleensä käytettävät lääkkeet ovat selektiivinen estrogeenimodu- laattori (tamoksifeeni), istukkagonadotropiini (hCG) tai aromataasiestäjä (letrotsoli). Hormoni- hoidon keston tulee olla riittävän pitkä, vähintään 4–6 kuukautta (Klami ym. 2018). 8 1.3.1 Kivesbiopsiamenetelmät Obstruktiivisessa atsoospermiassa siittiöitä onnistutaan löytämään kivesbiopsialla noin 90 %:lla miehistä (Coward & Mills 2017). Perinteisiä neulabiopsiatekniikoita, joilla siittiöitä voi- daan etsiä kiveksistä tai lisäkiveksistä, on useita. Yleisimmät Suomessa käytetyt menetelmät ovat karkeaneulalaitteella tai aspiraatiotekniikalla (TESA) johtopuudutuksessa tehtävät kives- biopsiat. NOA:ssa siittiöitä saattaa olla hyvin paikallisella alueella kiveksessä, joten perintei- sellä neulabiopsialla ei useinkaan löydetä siittiöitä (Bernie ym. 2015). Kivesten mikrodissek- tioleikkauksen (MD-TESE, mikro-TESE) on todettu olevan tehokas ja turvallinen tapa löytää siittiöitä NOA-tapauksissa (Klami ym. 2024). MD-TESE:ssä kives otetaan ihoviillon kautta esiin kivespussista ja tunica albuginea avataan pitkittäin tai poikittain. Leikkausmikroskoopin avulla pyritään tunnistamaan paksuimmat ja lä- pikuultavimmat tubulusrakenteet, jotka saattavat sisältää siittiöitä. Nämä kudospalat kerätään maljalle viljelynesteeseen. Kudospala hienonnetaan ja tutkitaan mikroskoopin avulla 400-ker- taisella suurennoksella (Kuva 1). Jos siittiöitä nähdään solususpensiossa, se pakastetaan neste- typpeen myöhempää ICSI-hoitoa varten. Kiveksestä löydetyt siittiöt ovat yleensä aluksi liikku- mattomia, mutta liike saadaan indusoitua siittiöihin mikrohedelmöityksen yhteydessä. Vaikka siittiö näyttäisi rakenteeltaan hyvinkin poikkeavalta ja epäkypsältä, voi hedelmöittyminen silti onnistua (Tanaka ym. 2015). Kuva 1. MD-TESE- kudospalan näkökenttä 400-kertaisella suurennoksella katsottuna. A. Normaali spermatogeneesi. Maljalla nähdään meioottisia soluja (sininen nuoli) sekä siittiö (oranssi nuoli). B. Sertoli cell-only -syndrooma (SCO). Kuvassa nähdään pelkkää Sertolin solukkoa (keltainen nuoli), ei meiooseja. C. Maturaatio Arrest (MA). Maljalla näh- dään poikkeuksellisen paljon meioottisia soluja (sininen nuoli), ei siittiöitä. 9 MD-TESE -menetelmällä idiopaattisessa atsoospermiassa potilaalta löydetään siittiöitä noin 30–40 %:ssa tapauksista (Achermann ym. 2021). Klinefelter-potilailta (47, XXY) siittiöitä löy- detään noin 50–70 %:ssa tapauksista (Klami ym. 2018). Y-kromosomin mikrodeleetio AZFa ja AZFb merkitsevät poikkeuksellisen huonoa ennustetta siittiöiden löytymiselle kiveskirurgian avulla. Tämän takia näille potilaille ei tehdä MD-TESE-leikkausta. Sitä vastoin suurimmalla osalla (70 %) AZFc-deleetio-potilaista löydetään siittiöitä (Hopps, 2003). Piilokiveksisillä mie- hillä siittiöiden löytymisprosentin on todettu olevan noin 70 (Bernie ym. 2013). MD-TESE- leikkauksen tulos on kuitenkin etukäteen yhä vaikeasti ennustettavissa. Turun yliopistollisessa keskussairaalassa otettiin MD-TESE-menetelmä käyttöön ensimmäisenä Suomessa vuonna 2008 ja nykyään lähes kaikki Suomen MD-TESE:t tehdään Tyksissä. Leikkaus on tehty tähän mennessä 410 potilaalle ja siittiöitä on löydetty 44 %:lla potilaista. 1.3.2 MD-TESE-ICSI Koska kivesbiopsialla saadaan talteen vain vähän siittiöitä, vaatii kivesbiopsiasiittiöiden käyttö aina ICSI-hoidon. In vitro fertilisaatio (IVF) -hoidossa hoidettavan munasarjoihin kasvatetaan hormonihoidon avulla useita munasoluja. Pitkässä hoitomuodossa eli GnRH-agonistihoidossa munarakkuloiden kasvatusta edeltää naisen oman hormonitoiminnan jarrutus, jolloin gona- dotropiinin ja estrogeenin pitoisuudet veressä laskevat. Kun munasarjat ovat lepotilassa, aloi- tetaan munarakkuloiden stimulaatio FSH:lla. Lyhyessä hoitomuodossa, GnRH-antagonistihoi- dossa, munarakkuloiden kasvatus aloitetaan kuukautiskierron alussa FSH:lla. GnRH-anta- gonistilla estetään ennenaikainen LH-eritys ja munasolujen irtoaminen. Molemmissa hoito- muodoissa munasolujen kypsyminen varmistetaan istukkagonadotropiini (hCG) -pistoksella n. 36 tuntia ennen munasolujen keräämistä. Kasvatetut munarakkulat tyhjennetään ultraäänioh- jauksessa, emättimen kautta neulan avulla, koeputkeen. Munasolut etsitään laboratoriossa fol- likkelinesteestä mikroskooppia apuna käyttäen. Mikroinjektiossa siittiö viedään munasoluun ohuella lasikapillaarilla (injektiopipetti) mikroinjektiolaitteiston avulla. Alkioita viljellään la- boratoriossa yleensä 3–5 päivää, minkä jälkeen yksi alkio siirretään kohtuun ja loput pakaste- taan myöhempää käyttöä varten. 10 1.4 Alkioiden luokittelu ja valinta Munasolujen hedelmöittyminen tarkistetaan 16–20 tunnin kuluttua (päivä 1) mikroinjektiosta, jolloin hedelmöittynyt munasolu eli tsygootti on esitumavaiheessa. Normaalisti hedelmöitty- neessä munasolussa on nähtävissä kaksi esitumaa, maternaalinen ja paternaalinen, sekä kaksi poistosolua, jotka ovat peräisin meioosin I ja II jakautumisesta. Tsygoottivaiheessa esitumien määrästä ja sijainnista, tumien koosta sekä poistosolujen sijainnista voidaan päätellä alkion kro- mosomipoikkeavuuksia (Gianaroli ym. 2003). Epänormaalisti hedelmöittyneessä munasolussa esitumia voi olla yksi, jolloin maternaalinen tai paternaalinen esituma on jäänyt muodostumatta tai esitumia voi olla useampia, jolloin poistosolun perintöaines on jäänyt munasoluun tai mu- nasolussa on epänormaali määrä kromosomeja. Jakautumisvaiheen alkiot (päivä 2 ja 3) luokitellaan blastomeerien jakautumisnopeuden, frag- mentaation sekä solusymmetrian perusteella (Veeck, 1999). Lisäksi arvioidaan sytoplasman ra- kennetta sekä tumien lukumäärää. Blastokystivaiheen alkiot (päivä 5–6) luokitellaan niiden laa- jentumisasteen sekä sisäsolumassan ja trofoektodermin solumäärän ja morfologian mukaan (Gardner & Schoolcraft 1999) (Taulukko 2). 24 tunnin kuluttua hedelmöittymisestä alkion tulisi olla 2-soluvaiheessa. 42–44 tunnin kuluttua hedelmöityksestä alkion tulisi olla 4-soluinen, ja 64–66 tunnin kuluttua 8-soluinen. Neljäntenä päivänä hedelmöityksestä alkio on optimaalisessa tilanteessa saavuttanut morulavaiheen, jolloin solujen sidokset tiivistyvät ja solumäärä edelleen kasvaa. Viidentenä päivänä alkion tulisi olla laajentunut blastokysti, jonka sisäsolumassa on tiivis ja sisältää paljon soluja. Trofoektodermin tulisi sisältää paljon soluja (Kuva 2). Useissa laboratorioissa on käytössä Time-lapse -menetelmä, jossa alkionkehitystä voidaan seurata ka- meran avulla koko viljelyn ajan. Menetelmällä pystytään näkemään tarkasti alkionkehityksen vaiheet ja erot alkioiden välillä. Alkion siirto kohtuun sekä alkioiden pakastus nestetyppeen voidaan tehdä päivinä 2–6. Nykyään useimmissa laboratorioissa on siirrytty blastokystivilje- lyyn, jolla voidaan tehostaa alkiovalintaa. 11 Kuva 2. Alkionkehitys tsygootista blastokystiksi. A. Hedelmöittynyt munasolu eli tsygootti, jossa nähdään kaksi esi- tumaa. B. Päivän 2 alkio, jossa nähdään 4 blastomeeriä. C. Päivän 3 alkio, jossa nähdään 8 blastomeeriä. D-E Päivänä 4 alkio tiivistyy morulaksi ja alkaa kavitoitua. F. Päivän 5 blastokysti. Taulukko 2. Blastokystien luokittelu (Gardner & Schoolcraft 1999) 12 Alkiolaadun arviointi on tärkeä osa IVF-hoitoa. Morfologian arviointi, parhaan alkion tunnis- taminen ja sen siirtäminen kohtuun tuoresiirrossa tai pakastusalkionsiirrossa sekä alkioiden pa- kastaminen myöhempää alkionsiirtoa varten lisäävät huomattavasti raskauden todennäköi- syyttä. Lisäksi alkion huolellisella valinnalla pystytään parhaassa tapauksessa välttämään tu- loksettomat alkionsiirrot, jotka kuormittavat potilasta henkisesti sekä vievät tarpeettomasti hoi- tavan yksikön resursseja. Alkion morfologian arvioimiseksi on kehitetty useita malleja, joilla pyritään standardoimaan alkioluokittelua (Pellegrini & Cozzolino 2023). Monimutkaisemmissa järjestelmissä käytetään kaavaa ennustamaan raskauden todennäköisyys alkion ulkonäön ja ke- hityksen perusteella. Yhdysvalloissa kehitetyn alkioluokitusjärjestelmän SARTCORE:n avulla alkiot voidaan jakaa hyviin, keskinkertaisiin ja huonoihin alkioihin. Luokittelun avulla pyritään raskauden todennäköisyyden ennustamisen lisäksi myös parantamaan klinikoiden laadunvar- mistusta. (Racowsky ym. 2010). Usean morfologisen ominaisuuden on todettu vaikuttavan alkion kykyyn tuottaa raskaus. Ras- kauden todennäköisyys kasvaa, jos alkio jakautuu mitoottisesti ensimmäisen kerran 25–27 tun- nin kuluttua hedelmöityksestä (Lundin ym. 2001). Syntyvyysluku nousee, kun kolmepäiväinen alkio on kahdeksansoluinen. Fragmentin lisääntynyt määrä, > 10 % alkion tilavuudesta, sekä solujen epäsymmetrisyys ja monitumaisuus vaikuttavat negatiivisesti syntyvyyteen (Racowsky ym. 2011). Blastokystivaiheen alkion hyvän morfologian, alkion kiinnittymisen kohtuun sekä syntyvyysluvun välillä on osoitettu olevan vahva korrelaatio (Goto ym. 2011). Hyvä- ja huono- laatuisista alkioista alkaneiden raskauksien välillä ei ole osoitettu olevan merkitsevää eroa suh- teessa keskenmenojen todennäköisyyteen (Oron ym. 2014). 1.5 Kiveskudoksesta löydettyjen siittiöiden käyttö hedelmöityshoidoissa Koska useiden siittiöperäisten tekijöiden on osoitettu liittyvän alkiolaatuun, on siittiöiden omi- naisuuksiin alettu kiinnittää erityistä huomiota miehen vaikean hedelmättömyyden hoidossa (Colaco & Sakkas 2018). Kiveskudoksesta kerättyjen siittiöiden sekä ejakulaattisiittiöiden vä- lillä on todettu eroja kromatiinin kypsyyden (Haidl ym. 1994), DNA-vaurioiden esiintyvyyden (Esteves ym. 2017) sekä koodaavien ja ei-koodaavien mikroRNA:iden määrässä (Vojtech ym. 2014). Nämä erot kiveskudos- ja ejakulaattisiittiöiden välillä johtuvat todennäköisesti siitä, että kiveskudoksesta poimitut siittiöt eivät ole käyneet läpi viimeisiä kypsymisprosesseja, jotka ta- pahtuvat lisäkivekseen kuljetuksen aikana. Kiveskudossiittiöillä on raportoitu olevan vähem- män DNA-vaurioita kuin ejakulaattisiittiöillä, mikä voi viitata DNA-vaurioiden määrän lisään- 13 tymiseen lisäkivekseen kuljetuksen aikana (Esteves ym. 2017). Siemensyöksyssä siittiöt joutu- vat kosketuksiin siemenrakkulasta sekä eturauhasesta peräisin olevien nesteiden kanssa. Nämä nesteet sisältävät sekä koodaavia että ei-koodaavia mikroRNA:ita. Niiden sitoutumisella siitti- öön saattaa olla vaikutuksia alkion kehityksessä (Vojtech ym. 2014). Aneuploidia, jossa sukusolussa on väärä määrä kromosomeja, syntyy epäonnistuneen meioot- tisen jakautumisen seurauksena. Aneuploidiat ovat yleisiä naisen munasoluissa ja ne lisääntyvät naisen iän myötä (Magli ym. 2020). Siittiöiden aneuploidioiden määrä on huomattavasti alhai- sempi verrattuna munasolujen aneuploidioihin (Fowler ym. 2019). Hedelmättömillä miehillä aneuploidioiden määrän on osoitettu lisääntyvän sen mukaan, kuinka vaikea hedelmättömyys on (Mougou-Zerelli ym. 2011). Non-obstruktiivisesta atsoospermiasta kärsivien miesten siitti- öissä on havaittu normaalia enemmän aneuploidioita (Gianaroli ym. 2005b; Sun ym. 2008). Kiveskudoksesta kerätyt siittiöt saattavat olla täysin muodostuneita, mutta ne eivät ole saavut- taneet vielä progressiivista liikkuvuutta (Gervasi & Visconti 2017). Ejakulaattisiittiöitä käytet- täessä siittiöiden liikkuvuuden on osoitettu vaikuttavan positiivisesti munasolujen hedelmöitty- miseen ja parempaan alkiolaatuun (Zheng ym. 2016). On kuitenkin osoitettu, että siittiöiden liike ei ole aina välttämätöntä niiden hedelmöittämiskyvylle (Shulman 1999). Kiveskudoksesta kerättyjen siittiöiden liike on yleensä hyvin heikko, sillä siittiö saa liikkuvuuden vasta lisäki- veksiin kulkeutumisen aikana. Kun TESE-ICSI:ssä käytetään teofylliiniä, voidaan siittiöiden liikettä parantaa, ja hedelmöityskykyiset siittiöt voidaan helpommin tunnistaa (Flannigan & Schlegel 2019). Vaikka kiveskudossiittiöillä on osoitettu olevan kyky aktivoida ja hedelmöittää munasolu ICSI- hoidossa (Tournaye ym. 1995), on kuitenkin epäselvää, miten kiveskudossiittiöillä alkunsa saa- neiden alkioiden kehitys eroaa niiden alkioiden kehityksestä, jotka ovat saaneet alkunsa ejaku- laattisiittiöillä. Atsoospermisilla miehillä on havaittu olevan useita kromosomipoikkeavuuksia (Gianaroli ym. 2005). On olemassa näyttöä, että atsoospermia ja kiveskudossiittiöiden käyttö johtaa alhaisempaan munasolujen hedelmöittymiseen, heikentyneeseen alkion kehitykseen ja implantaatioon verrattuna ejakulaattisiittiöihin. Kliinisiin raskaustuloksiin siittiöiden alkuperä ei kuitenkaan välttämättä vaikuta (Desai ym. 2018). 14 1.5.1 Munasolujen hedelmöittyminen ja alkiolaatu OA- ja NOA-potilaiden hoidoissa Obstruktiivisessa atsoospermiassa munasolujen hedelmöittymisen on raportoitu olevan hieman parempi kuin Non-obstruktiivisessa atsoospermiassa (Ghanem ym. 2005). Syntyvien lasten määrässä NOA:n ja OA:n välillä ei ole kuitenkaan havaittu eroa (Bocca ym. 2017). Klamin ym. (2024) tutkimuksessa hedelmöittymisluvut, raskausluvut sekä syntyvien lasten määrä al- kion siirtoa kohti NOA-, OA- ja ejakulaattisittiöillä tehdyissä ICSI-hoidoissa olivat samankal- taiset. Myöskään Non-obstruktiiviseen atsoospermiaan johtavien diagnoosien välillä ei ole osoitettu olevan vaikutusta raskaustuloksiin (Aydin ym. 2015; Klami ym. 2024). Kivesbiopsiasiittiöillä alkunsa saaneiden alkioiden laadusta löytyy vielä niukasti tutkimustie- toa. Van Marion ym. (2021) on havainnut siittiöiden alkuperän vaikuttavan alkion kehitykseen jo ensimmäisen solusyklin aikana. Blastomeerien jakautumisen todettiin olevan epäsynkronista alkioilla, jotka on saatu aikaan kiveskudoksesta löydetyillä siittiöillä. Alkiolaadun, solujen ja- kautumisen sekä blastokystien muodostumisen on osoitettu olevan selvästi huonontunut NOA- ja OA-potilaiden siittiöillä tehdyissä hoidoissa verrattuna alkioihin jotka on saatu aikaan ejaku- laattisiittiöillä tehdyissä hoidoissa (Loutradi ym. 2006; Vernaeve ym. 2003; Göker ym. 2002). Desai ym. (2018) ovat havainneet, että alkioiden kehittyminen morula- ja blastokystivaiheeseen on merkittävästi alentunut NOA-potilaiden hoidoissa verrattuna alkioihin, jotka on saatu OA- potilaiden hoidoissa. Toisaalta myös täysin päinvastaisia tuloksia on havaittu, Zaninovic & Schlegel (2013) havaitsivat alkiokehityksen olevan samanlainen sekä NOA- että OA-potilaiden siittiöillä tehdyissä hoidoissa. Myös Desain ym. (2009) tutkimuksessa NOA- ja OA- potilaiden siittiöillä tehdyissä hoidoissa alkiolaatu ja kliininen raskausluku oli samanlainen, mutta muna- solujen hedelmöittyminen oli huonompaa NOA-ryhmässä. Lisätutkimuksia tarvitaan, jotta saa- daan tarkempaa varmuutta, vaikuttavatko Non-obstruktiivisen atsoospermiaan johtavat syyt ne- gatiivisesti alkiolaatuun. Siittiöiden aneuploidian, poikkeavan kromatiinirakenteen, DNA-fragmentaation, muuttuneen siittiön epigeneettisen profiilin ja Y-kromosomin mikrodeleetioiden on havaittu vaikuttavan ne- gatiivisesti alkion laatuun (Coloco & Sakkas 2018). Toisaalta Park kumppaneineen (2015) ei havainnut eroa hyvälaatuisten alkioiden osuudessa ja munasolujen hedelmöittymisessä NOA:n eri histopatologisten luokkien välillä, mutta viivästynyt alkiokehitys oli kuitenkin osoitettavissa maturaatio-arrest-ryhmässä. 15 Y-kromosomin mikrodeleetio AZFc:n on useassa tutkimuksessa raportoitu ennustavan alhai- sempaa hedelmöittymislukua kuin muiden NOA-potilaiden siittiöillä tehdyissä hoidoissa (Ya- maguchi ym. 2020). Alkioiden lisääntyneen aneuploidian sekä heikentyneen alkionkehityksen on todettu liittyvän AFZc-deleetioon (Mateu ym. 2010). Y-deleetion on todettu huonontavan merkitsevästi kliinisen raskauden ja synnytyksen todennäköisyyttä (Zhang ym. 2021). 1.6 Tutkimuksen tavoitteet Tämä työ on retrospektiivinen tutkimus, jolla pyritään lisäämään tietoa NOA-potilaiden siitti- öillä tehtyjen ICSI-hoitojen alkiolaadusta. Verrokkiryhmänä käytetään alkioita, jotka on saatu aikaan OA-potilailta perinteisellä neulabiopsialla (TESA) talteen otetuilla siittiöillä. Koska MD-TESE:en valikoituvien potilaiden kivesten toiminta on usein vaikeasti häiriintynyt, on mahdollista, että potilaiden eri diagnooseilla on vaikutusta siittiöiden kykyyn tuottaa elinkel- poisia ja raskauden aikaansaavia alkioita. Tutkimuksessa selvitetään, onko eri diagnoosin saa- neiden NOA-potilaiden siittiöillä tehdyissä hoidoissa munasolujen hedelmöittymisessä ja al- kiolaadussa eroavaisuuksia. MD-TESE -menetelmällä on mahdollista löytää siittiöitä myös potilailta, joilta se ei perintei- sellä neulabiopsialla ole mahdollista siittiötuotannon vähäisen määrän ja paikallisuuden takia. Tällöin saadaan usein talteen vain yksittäisiä siittiöitä, eikä hedelmöitykseen käytettäviä siitti- öitä päästä valitsemaan morfologian perusteella. Tässä, ns. vaativassa mikrohedelmöityksessä, käytetään usein kaikki elävät siittiöt. Tutkimuksessa verrataan, onko munasolun hedelmöitty- misessä sekä alkiolaadussa eroa näiden vaativien ja niiden mikrohedelmöitysten välillä, joista siittiöitä löydetään enemmän ja niistä päästään valikoimaan hedelmöitykseen morfologialtaan parhaat yksilöt. Alkionlaadun tiedetään liittyvän vahvasti munasolun ominaisuuksiin (Demko ym. 2016). Kuten muissakin ICSI-hoidoissa, myös kivesbiopsiasiittiöillä tehdyissä hoidossa merkittävin yksittäi- nen hoidon onnistumista ennustava tekijä on naisen ikä (Bocca ym. 2017). Tutkimuksessa ote- taan huomioon NOA- ja OA-potilaan potilaan puolison taustatekijät; ikä, painoindeksi, muna- solujen määrä sekä hoitomuoto (agonisti/antagonisti), jotta näistä tekijöistä johtuvat erot al- kiolaadussa saadaan suljettua pois. 16 Tutkimuskysymykset: 1. Eroavatko NOA- ja OA-potilaiden siittiöillä tehdyissä hoidoissa munasolujen hedelmöitty- minen ja alkiolaatu toisistaan? 2. Miten NOA-potilaan diagnoosi vaikuttaa munasolujen hedelmöittymiseen ja alkiolaatuun? 3. Onko vaativien ja helppojen MD-TESE-ICSI -hoitojen välillä eroa munasolujen hedelmöit- tymisessä ja alkiolaadussa? Koska aikaisempia tutkimuksia on varsin vähän, ja tulokset niissä ovat ristiriitaisia, on vaikea arvioida alkiolaatua NOA- ja OA-potilaiden hoitojen välillä. Hypoteesina pidän kuitenkin, että NOA-potilaan diagnoosien välillä saattaa olla eroa. Lisäksi oletan, että vaativissa MD-TESE- ICSI -hoidoissa munasolujen hedelmöittyminen on huonompaa ja alkiolaatu on heikompi kuin helpoissa MD-TESE-ICSI -hoidoissa, sillä on osoitettu, että kun päästään valitsemaan morfo- logialtaan hyvä siittiö, on munasolujen hedelmöittyminen ja alkiolaatu parempi. Tiedetään, että alkion ulkoiset ominaisuudet ovat yhteydessä niiden kykyyn tuottaa raskaus. Tämän tutkimuksen tavoitteena on lisätä tietoa NOA-potilaan siittiöillä aikaansaatujen alkioi- den laadusta, jotta voidaan jatkossa ennustaa paremmin hoidon onnistumisen todennäköisyyttä. Tutkimuksen toivotaan tuovan myös lisää tietoa hoidon suunnitteluun laboratorion näkökul- masta, jotta hoidon laatua ja tehokkuutta voidaan parantaa. Lisäksi tavoitteena on saada tietoa hoidon onnistumisen todennäköisyydestä hoidossa oleville pareille, joilla lapsettomuus johtuu miehen vaikeasta infertiliteetistä. 17 2. AINEISTO JA MENETELMÄT 2.1 Tutkimuksessa käytettävä aineisto Tutkimusaineistona käytettiin kaikkia alkiotietoja, jotka saatiin NOA- ja OA-potilaille tehdyistä MD-TESE-ICSI- ja TESA-ICSI-hoidoista Tyksissä vuosina 2009–2023. Siittiöitä kerättiin MD-TESE- sekä TESA-menetelmin 2008–2023 välisenä aikana. Potilaat valikoituivat joko MD-TESE:en tai TESA:an alkututkimusten; esitietojen, potilaan yleistilan, laboratoriokokei- den (LH, FSH, testosteroni, karyotyypitys, Y-kromosomin mikrodeleetiot), kivesten koon sekä kivesten ultraäänitutkimuksen perusteella. Jos potilaalta ei löytynyt siittiöitä perinteisellä neu- labiopsialla, hänelle tehtiin MD-TESE. Tarkasteltaessa NOA-potilaiden taustadiagnoosin vai- kutusta alkiolaatuun jaettiin kaikki NOA-potilaat johonkin neljästä ryhmästä; AZFc, Klinefel- ter, Idiopaattinen ja Muut (piilokives, anabolisten steroidien käyttö, aikaisempi sytostaattihoito sekä eräs harvinainen syndrooma) (Taulukko 3). Taulukko 3. OA- ja NOA-potilaiden sekä NOA-diagnoosiryhmien potilas- ja hoitomäärät 2.2 Siittiöiden keräysmenetelmät 2.2.1 Kiveksen mikrodissektioleikkaus, MD-TESE MD-TESE:en valikoituivat NOA-potilaat, joiden atsoospermian taustalla arvioitiin olevan sper- matogeneesin häiriö. Vuosina 2008–2020 leikkaukset tehtiin yleisanestesiassa ja vuodesta 2020 lähtien kaikki miehet leikattiin paikallispuudutuksessa. Kivespussin iho viillettiin keskiviivasta ja tunica albuginea avattiin useimmissa tapauksissa pystysuoraan. Biopsiat poimittiin kohdista, joissa tubulus oli mahdollisimman paksua ja läpikuultavaa ja laitettiin nelikuoppamaljalle vil- jelynesteeseen (G-Gamete™, Vitrolife Sweden AB, Frölunda, Ruotsi). Biopsiapaloja otettiin yleensä 20 kpl molemmista kiveksistä. Tämän jälkeen jokainen biopsiapala siirrettiin omalle Potilaita (n) ICSI-hoitoja (n) OA 49 80 NOA 54 82 NOA-diagnoosiryhmät: AZFc 4 8 Idiopaattinen 22 35 Klinefelter 13 19 Muut 15 20 18 maljalleen ja suspentoitiin neulojen avulla niin, että siementiehyiden sisältö saatiin ulos tu- buluksesta. Kaikki palat tarkastettiin käänteisfaasikontrastimikroskoopilla, 400-kertaisella suu- rennoksella. Yhdestä palasta otettiin noin puolet PAD (patologisanatominen diagnoosi) - näyt- teeksi, joka lähetettiin patologin arvioitavaksi. Näytteet, joista löydettiin siittiöitä, yhdistettiin ja jaettiin vähintään kahdeksaan pakastuserään. Näytteet pakastettiin spermanpakastusolkiin joko glyserolipakastusliuoksella (Glyseroli-viljelyliuos 1:3) tai kaupallisella spermanpakastus- liuoksella (SpermFreeze Solution™, Vitrolife Sweden AB, Frölunda, Ruotsi) valmistajan oh- jeen mukaan. Näytteet varastoitiin nestetyppisäiliöihin. 2.2.2 Kiveksen neulabiopsia, TESA OA-potilaiden neulabiopsiat otettiin paikallispuudutuksessa. Ihoon tehtiin pieni viilto ja biop- siat (n. 6 kpl) otettiin 14G Biopty™ -biopsialävistäjällä (Bard Urological, Covington, GA, USA). Näytepalat laitettiin yksitellen viljelyliuokseen (G-Gamete™, Vitrolife Sweden AB, Frölunda, Ruotsi) viljelymaljalle. Siementiehyiden sisältö suspentoitiin neulojen avulla, minkä jälkeen paloja tarkasteltiin käänteisfaasikontrastimikroskoopin avulla 400-kertaisella suuren- noksella. PAD-näyte otettiin tarvittaessa. Näytepalat käsiteltiin ja pakastettiin kuten MD-TESE- näytteet. 2.3 MD-TESE- ja TESA-ICSI ja alkioviljely Agonisti- tai antagonistihoidon avulla TESA- ja MD-TESE potilaiden puolisoiden munasarjoi- hin kasvatettiin useita samaan aikaan kehittyviä munarakkuloita. Munarakkuloiden kehitystä seurattiin ultraäänellä munasolupunktioajankohdan määrittämiseksi. Potilas pisti hCG-irrotus- pistoksen 36 tuntia ennen munasolukeräystä, minkä tarkoituksena oli kypsyttää ja irrottaa ke- rättävät munasolut. Follikkelit tyhjennettiin koeputkeen transvaginaalisessa ultraääniohjauk- sessa, minkä jälkeen munasolu-kumulus-kompleksit poimittiin follikkelinesteestä viljelymal- joille. Kumulus-solukot poistettiin hyaluronidaasientsyymin (HYASE-10X™, Vitrolife Swe- den AB, Frölunda, Ruotsi) avulla ennen mikrohedelmöitystä. Puolison munasolunkeräyspäivänä sulatettiin yleensä yksi siittiöolki. Näytteeseen lisättiin hi- taasti 3 ml viljelynestettä (G-IVF™ PLUS Vitrolife Sweden AB, Frölunda, Ruotsi), minkä jäl- keen näyte sentrifugoitiin 5 min/650xg. Sakkaan lisättiin noin 100 µl viljelynestettä. Ennen näytteen pipetoimista etsintämaljalle siihen lisättiin 1:10 Theophyllineä (GM501 SpermMo- bil™, Gynemed GmbH & Co., Lensahn, Saksa) siittiöiden liikkeen indusoimiseksi. Solusus- 19 pensiosta tehtiin maljalle useita 25–35 µl pisaroita. Lisäksi maljalle tehtiin PVP (polyvinylpyr- roline) -pisara (PVP, ICSI™, Vitrolife Sweden AB, Frölunda, Ruotsi), johon löydetyt siittiöt kerättiin ja jossa ne immobilisoitiin. Pisarat peitettiin öljyllä (G-Ovoil™, Vitrolife Sweden AB, Frölunda, Ruotsi). Kun solususpensio oli käyty läpi, arvioitiin löydetyt siittiöt ja tarvittaessa sulatettiin toinen olki. Munasolut hedelmöitettiin mikrohedelmöitystekniikalla (Palermo ym. 1992). Hedelmöityksen jälkeen munasolut siirrettiin viljelymaljalle viljelyliuospisaroihin (G- 1™ Plus, Vitrolife Sweden AB, Frölunda, Ruotsi) ja siirrettiin soluviljelykaappiin (+37ᵒC). Munasolujen hedelmöittyminen tarkistettiin 16–20 tunnin kuluttua hedelmöityksestä. Kolman- tena viljelypäivänä alkiot siirrettiin blastokystiviljelyliuokseen (G-2™ Plus, Vitrolife Sweden AB, Frölunda, Ruotsi). Alkioita viljeltiin matalahappi-inkubaattorissa (6 % O₂) 3–6 päivää, minkä jälkeen yksi alkio siirrettiin kohtuun. Loput alkiot pakastettiin tai ne hylättiin, jos niiden laatu todettiin huonoksi. Alkiot luokiteltiin tsykoottivaiheesta aina siihen saakka, kunnes ne siirrettiin kohtuun, pakastettiin nestetyppeen tai hylättiin. Pakastetut alkiot luokiteltiin lopulli- sesti sulatuksen jälkeen ennen siirtoa tai hylkäystä. Varhaisalkiot luokiteltiin blastomeerien ja- kautumisnopeuden ja alkion rakenteellisten piirteiden (fragmentin määrä, blastoreerien keski- näinen kokoero sekä blastomeereissä näkyvien tumien määrä) perusteella. Blastokystivaiheen alkiot luokiteltiin Gardnerin & Schoolcraftin luokittelun mukaisesti. Alkiotiedot kirjattiin solu- tietokaavakkeeseen sekä 2012 lähtien potilastietojärjestelmään. 20 2.4 Alkioiden luokittelu tutkimusta varten Alkiotiedot koottiin solutietokaavakkeista. Alkiot luokiteltiin kolmeen ryhmään; hyviin, kes- kinkertaisiin sekä huonoihin niiden jakautumisnopeuden sekä rakenteellisten piirteiden perus- teella. Luokittelun apuna käytettiin SARTCORE-luokitusta (Taulukko 4). Taulukko 4. Alkioiden SARTCORE-luokittelu alkion iän mukaan. Blastokystivaiheen alkioiden luokittelussa 2–5 tarkoittaa blastokystin laajentumisastetta ja A-C sisä- ja ulkosolumassan määrää ja sisäsolumassan kompaktoitumista. Luokka Jakautumisvaiheen alkio Blastokystivaiheen alkio HYVÄ Päivä 2: 4 blastomeeriä Päivä 3: 8 blastomeeriä fragmentaatio < 10 % alkiosta blasto- meerit samankokoisia ei monitumaisuutta 4AA/4BB, 4AB/4BA 5AA/5BB, 5AB/5BA KESKINKERTAINEN Päivä 2: 2–6 blastomeeriä, Päivä 3: 6–7 tai yli 8 blastomeeriä fragmentaatio 10–25 % alkiosta blastomeerien kokoero enintään 2 ei monitumaisuutta 2AA/2BB, 2AB/2BA 3AA/3BB, 3AB/3BA HUONO Päivä 2: alle 2 blastomeeriä Päivä 3: alle 6 blastomeeriä fragmentaatio > 25 % alkiosta blastomeerien kokoero 3 monitumaisuutta 2-5CC sekä alkiot, joiden jakautuminen py- sähtyi ennen blastokystivaihetta Alkiotietojen lisäksi kerättiin tiedot NOA- sekä OA-potilaiden puolisoiden taustatekijöistä (ikä, painoindeksi, munasolujen määrä sekä hoitomuoto (agonisti/antagonisti) ja pariskunnille teh- tyjen hoitojen määrä). Tarkasteltaessa ICSI:n vaikeusasteen vaikutusta alkiolaatuun, MD- TESE-ICSI:t jaettiin vaativiin ja helppoihin ICSI-hoitoihin. ICSI luokiteltiin vaativaksi, jos näytteestä löydettiin liikkuvia siittiöitä enintään saman verran kuin puolisolta oli saatu muna- soluja ja niistä ei päästy valitsemaan morfologialtaan hyviä siittiöitä. Jos liikkuvia siittiöitä löy- dettiin enemmän kuin puolisolla oli munasoluja ja niistä päästiin valitsemaan morfologiltaan parhaat, luokiteltiin ICSI helpoksi. 21 2.5 Tilastoanalyysit Ennen varsinaista tutkimusaineiston analysointia verrattiin, poikkeavatko NOA- ja OA-potilai- den puolisoiden taustatekijät toisistaan hoidoista saatujen kypsien munasolujen määrän, hoidet- tavan naisen iän, painoindeksin tai hoitomuodon suhteen. Jatkuvien muuttujien normaali- suusoletusta tarkasteltiin Shapiro-Wilk- ja Kolmogorov-Smirnov -testeillä, ja visuaalisesti Q- Q-kuvaajien ja histogrammin avulla. Normaalijakautuneille muuttujille (naisen ikä) ilmoitettiin keskiarvot ja keskihajonnat, ja epäparametrisille muuttujille (munasolumäärä ja painoindeksi) ilmoitettiin mediaanit ja ala- ja yläkvartiilit. Kategoriset muuttujat (hoitomuoto) ilmoitettiin lu- kumäärinä (n), ja tarvittaessa prosenttiosuuksina (%) tai luottamusväleinä (LV). Tutkimuskysymysten 1–3 lähtötilanteen kategoristen muuttujien (NOA/OA-ryhmä, NOA-po- tilaan diagnoosi sekä helppo/vaativa ICSI) vertailu normaalisti jakautuneissa muuttujissa teh- tiin t-testillä, kun taas epäparametrisessa tapauksessa joko Mann-Whitney U-testillä tai Krus- kal-Wallis-testillä. Kun Kruskal-Wallis-testi oli tilastollisesti merkitsevä, tehtiin jatkovertailu Dwass, Steel, Critchlow-Fligner-testin avulla sen selvittämiseksi, mitkä luokat eroavat toisis- taan. Kahden kategorisen muuttujan osuuksia vertailtiin Fisherin tarkalla testillä. Nämä ilmoi- tettiin lukumäärinä (n) ja tarvittaessa prosenttiosuuksina (%) tai luottamusväleinä (LV). NOA- ja OA-potilaiden siittiöiden vaikutusta kypsien munasolujen hedelmöittymiseen ja al- kiolaatuun tarkasteltiin kategoristen mittauksien toistomittausmalleilla, jotka sisälsivät yhden subjekti-spesifinen muuttujan (hoitokerta), tekijöiden välisen muuttujan (NOA tai OA) ja näi- den yhdysvaikutuksen (hoitokerta × ryhmä). Mallit vakioitiin naisen taustatekijöiden (ikä, pai- noindeksi, munasolujen määrä/henkilö, hoitomuoto) suhteen. Malleista pudotettiin pois vuoro- vaikutus (hoitokerta × ryhmä), koska se ei ollut tilastollisesti merkitsevä. Alkiolaadun katego- risessa toistomittausmallissa otettiin huomioon luokkien järjestys (hyvä, keskinkertainen, huono ja ei- hedelmöittynyt) ja kyseinen malli estimoitiin Laplace-menetelmää käyttäen. NOA- potilaiden taustadiagnoosin vaikutusta munasolujen hedelmöittymiseen ja alkiolaatuun sekä vaativien ja helppojen ICSI-hoitojen vaikutusta munasolujen hedelmöittymiseen ja alkiolaa- tuun tarkasteltiin samalla menetelmällä. Testien merkitsevyystasoksi asetettiin 0,05. Analyysit ja kuvaajat tehtiin SAS- (versio 9.4) ja JMP (versio 17 Pro) -ohjelmilla. 22 3. TULOKSET 3.1 Alkiolaatu ja munasolujen hedelmöittyminen NOA- ja OA-potilaiden ICSI-hoi- doissa 3.1.1 Naisten taustatekijät NOA- ja OA-ryhmissä NOA- ja OA-ryhmiä vertailtiin naisen taustatekijöiden; hoidoista saatujen kypsien munasolujen määrän, hoidettavan naisen iän, painoindeksin ja hoitomuodon suhteen (Taulukko 5). Ryhmien välillä ei näiden taustatekijöiden suhteen ollut tilastollisesti merkitsevää eroa. Taulukko 5. Naisen taustatekijät NOA- ja OA-ryhmissä. KAIKKI NOA (N=52) OA (N=49) P-ARVO NAISEN IKÄ keskiarvo (keskihajonta) 32 (4,4) 32 (4,5) 31 (4,3) 0,50 BMI mediaani (Q1, Q3) 25 (22, 29) 26 (22, 28) 26 (22, 28) 0,83 HOITOMUOTO agonisti n 47 23 24 0,69 antagonisti n 54 29 25 MUNASOLUJA/HENKILÖ mediaani (Q1, Q3) 10 (7,15) 9 (7,14) 12 (7,15) 0,31 3.1.2 Alkiolaadun ja munasolujen hedelmöittymisen vertailu NOA- ja OA-potilaiden ICSI-hoidoissa ICSI-hoidoissa olleille naisille tehtiin yhdestä neljään munasolukeräystä (Taulukko 6). Keräys- ten (ICSI-hoitojen) määrällä/potilas ei ollut tilastollisesti merkitsevää vaikutusta munasolujen hedelmöittymiseen (p=0,70), eikä alkiolaatuun (p=0,31). Hoitoja NOA-ryhmässä oli 82 ja OA- ryhmässä 81. Näistä hoidoista saatiin yhteensä 1692 kypsää munasolua. NOA-ryhmässä oli yh- teensä 798 kypsää munasolua, joista hedelmöittyi 496 (62,2 %; 95-LV 58,7 %, 65,5 %). Kyp- sistä munasoluista kehittyi 88 hyvälaatuista alkiota (11 %; 95-LV 9,0 %, 13,4 %), 122 keskin- kertaista alkiota (15,3 %; 95-LV 13,0 %, 18,0 %) ja 286 huonolaatuista alkiota (35,8 %; 95-LV 32,6 %, 39,2 %). Kypsistä munasoluista 37,8 % ei hedelmöittynyt (Kuva 4). OA-ryhmässä oli yhteensä 894 kypsää munasolua, joista hedelmöittyi 576 (64,4 %; 95-LV 61,2 %, 67,5 %). Kyp- sistä munasoluista kehittyi 59 hyvälaatuista alkiota (6,6 %; 95-LV 5,2 %, 8,4 %), 152 keskin- kertaista alkioita (17,0 %; 95-LV 14,7 %, 19,6 %) ja 365 huonolaatuista alkiota (40,8 %; 95-LV 37,7 %, 44,1 %). Kypsistä munasoluista 35,6 % ei hedelmöittynyt (Kuva 4). Ryhmien välillä ei ollut tilastollisesti merkitsevää eroa hedelmöittymisessä (p=0,29) eikä alkionlaadussa (p=0,74). 23 Taulukko 6. Naisten taustatekijät kypsien munasolujen suhteen ryhmässä NOA (N = 798) ja ryhmässä OA (N = 894). KAIKKI (N=1692) NOA (N=798) OA (N=894) NAISEN IKÄ mediaani (Q1, Q3) 32 (29,35) 32 (29,3) 31 (29,35) BMI mediaani (Q1, Q3) 25 (22,30) 24 (22,2) 27 (22,31) HOITOMUOTO agonisti n 700 340 360 antagonisti n 992 458 534 MUNASOLUJA/HENKILÖ mediaani (Q1, Q3) 13 (9,18) 12 (8,18) 14 (10,20) Hoitokerta 1 1109 547 562 2 418 195 223 3–4 165 56 109 Kuva 4. OA- ja NOA-potilaiden alkiolaatu ja hedelmöittyminen. Hoidettavia pareja OA-ryhmässä oli yhteensä 49 ja heille tehtyjä hoitoja 80. NOA-ryhmässä hoidettavia pareja oli 54 ja heille tehtyjä hoitoja 82. 24 3.1.3 Synnytykseen johtaneiden alkioiden laatu Tutkimuksessa tarkasteltiin synnytykseen johtaneiden alkioiden alkiolaatua NOA- ja OA-poti- laiden ICSI-hoidoissa. NOA-potilaiden puolisoilla synnytyksiä oli yhteensä 42 kpl. Synnytyk- seen johtaneista raskauksista 48 % oli saanut alkunsa hyvälaatuisesta alkiosta, 38 % keskinker- taisesta alkiosta ja 14 % huonolaatuisesta alkiosta. OA-potilaiden puolisoilla synnytyksiä oli yhteensä 38 kpl. Synnytykseen johtaneista raskauksista 34 % oli saanut alkunsa hyvälaatuisesta alkiosta, 55 % keskinkertaisesta alkiota ja 11 % huonolaatuisesta alkiosta. Koska alkioiden määrä oli pieni, ei tuloksista voitu luotettavasti tehdä tilastollista analyysiä. 3.2 Alkiolaadun vertailu NOA-diagnoosiryhmien välillä 3.2.1 Diagnoosiryhmien taustamuuttujat NOA-diagnoosiryhmiä vertailtiin naisen taustatekijöiden; hoidoista saatuja kypsien munasolu- jen määrän, hoidettavan naisen iän, painoindeksin sekä hoitomuodon suhteen (Taulukko 7). Diagnoosiryhmien välillä ei ollut tilastollisesti merkitsevää eroa kypsien munasolujen, hoidet- tavan naisen iän eikä hoitomuodon suhteen. Painoindeksissä oli tilastollisesti merkitsevä ero diagnoosiryhmissä (p=0,002). Diagnoosiryhmä Klinefelterin naisten painoindeksi oli tilastolli- sesti suurempi kuin Idiopaattinen-ryhmän naisten painoindeksi (p=0,01) ja AZFc-ryhmän nais- ten painoindeksi (p=0,02). Taulukko 7. Naisen taustatekijöiden vertailu diagnoosiryhmien suhteen. KAIKKI AZFc (N=4) Klinefelter (N=11) Idiopaattinen (N=22) Muut (N=15) P-arvo NAISEN IKÄ mediaani (Q1, Q3) 32 (28, 35) 29 (25, 33) 30 (27, 32) 33 (30, 34) 34 (30, 37) 0,06 BMI mediaani (Q1, Q3) 26 (22, 28) 21,5 (21,22) 31 (27,32) 24 (22, 27) 26 (24, 29) 0,002* HOITO agonisti n 23 2 3 10 8 0,62 antagonisti n 29 2 8 12 7 MUNASOLU/HENKILÖ mediaani (Q1, Q3) 9 (7, 15) 13 (10, 15) 7 (6, 15) 8 (7, 13) 10 (7,16) 0,65 25 3.2.2 Munasolujen hedelmöittymisen ja alkiolaadun vertailu diagnoosiryhmien välillä ICSI-hoidoissa olleille naisille tehtiin yhdestä kolmeen munasolukeräystä (hoitoa) (Taulukko 8). Hoitojen määrällä/potilas ei ollut tilastollisesti merkitsevää vaikutusta munasolujen hedel- möittymiseen (p=0,57), eikä alkiolaatuun (p=0,90). Hoitoja AZFc-ryhmässä oli 8, Klinefelter- ryhmässä 19, Idiopaattinen ryhmässä 34 ja Muut-ryhmässä 20. Näistä hoidoista saatiin yhteensä 1692 kypsää munasolua. AZFc-ryhmässä oli yhteensä 87 kypsää munasolua, joista hedelmöittyi 43 (49,4 %; 95-LV 39,2 %, 59,7 %). Kypsistä munasoluista kehittyi hyvälaatuisia alkioita 4 (4,6 %; 95-LV 1,8 %, 11,2 %), keskinkertaisia alkioita 3 (3,4 %; 95-LV 1,2 %, 9,7 %) ja huo- nolaatuisia alkioita 36 (41,4 %; 95-LV 31,6 %, 51,9 %). 50,6 % kypsistä munasoluista ei hedel- möittynyt tässä ryhmässä (Kuva 5). Klinefelter-ryhmässä oli yhteensä 208 kypsää munasolua, joista hedelmöittyi 127 (61,1 %; 95-LV 54,3 %, 67,4 %). Kypsistä munasoluista kehittyi hyvä- laatuisia alkioita 31 (14,9 %; 95-LV 10,7 %, 20,4 %), keskinkertaisia alkioita 24 (11,5 %; 95- LV 7,9 %, 16,6 %) ja huonolaatuisia alkioita 72 (34,6 %; 95-LV 28,5 %, 41,3 %). 38,9 % kyp- sistä munasoluista ei hedelmöittynyt (Kuva 5). Idiopaattiset-ryhmässä oli yhteensä 341 kypsää munasolua, joista hedelmöittyi 205 (60,1 %; 95-LV 54,8 %, 65,2 %). Hyvälaatuisia alkioita kypsistä munasoluista kehittyi 29 (8,5 %; 95-LV 6,0 %, 11,9 %), keskinkertaisia alkioita 58 (17 %; 95-LV 13,4 %, 21,4 %) ja huonolaatuisia alkioita 118 (34,6 %; 95-LV 29,8 %, 39,8 %). 39,9 % kypsistä munasoluista ei hedelmöittynyt (Kuva 5). Muut-ryhmässä oli yhteensä 194 kypsää munasolua, joista hedelmöittyi 131 (67,5 %; 95-LV 60,7 %, 73,7 %). Hyvälaatuisia alkioita kypsistä munasoluista kehittyi 24 (12,4 %; 95-LV 8,5 %, 17,7 %), keskinkertaisia alkioita 39 (20,1 %; 95-LV 15,1 %, 26,3 %) ja huonolaatuisia alkioita 68 (35,1 %; 95-LV 28,7 %, 42,0 %) 32,5 % kypsistä munasoluista ei hedelmöittynyt (Kuva 5). Diagnoosiryhmien välillä ei ollut tilastollisesti merkitsevää eroa hedelmöittymisessä (p=0,17) eikä alkiolaadussa (p=0,74). 26 Taulukko 8. Naisten taustatekijät kypsien munasolujen suhteen diagnoosiryhmässä. KAIKKI (N=830) AZFc (N=87) Klinefelter (N=208) Idiopaattinen (N=341) Muut (N=194) NAISEN IKÄ mediaani (Q1, Q3) 32 (29, 35) 30 (28, 31) 30 (28, 32) 33 (30, 34) 34 (33, 37) BMI mediaani (Q1, Q3) 23 (22, 27) 21 (20, 22) 27 (23, 31) 23 (21, 27) 26 (24, 27) HOITO agonisti 354 47 30 164 113 antagonisti 476 40 178 177 81 Hoitokerta 1 596 50 163 223 160 2 186 25 41 90 30 3 48 12 4 28 4 MUNASOLUJA/HENKILÖ mediaani (Q1, Q3) 12 (7, 18) 12 (12, 14) 18 (10, 22) 9 (7, 18) 12 (9, 18) Kuva 5. NOA-potilaan diagnoosin vaikutus munasolujen hedelmöittymiseen ja alkiolaatuun. AZFc-ryhmässä potilaita oli yhteensä 4 ja hoitoja 8. Idiopaattinen-ryhmässä potilaita oli 22 ja hoitoja 35, Klinefelter-ryhmässä potilaita oli 13 ja hoitoja 19 ja Muut-ryhmässä potilaita oli 15 ja hoitoja 20. 27 3.2.3 Synnytykseen johtaneiden alkioiden laatu NOA-diagnoosiryhmien välillä Tutkimuksessa tarkasteltiin synnytykseen johtaneiden alkioiden alkiolaatua NOA-diagnoo- siryhmien välillä. Y-deleetio-ryhmässä synnytyksiä oli yhteensä 2 kpl. Synnytykseen johta- neista raskauksista 50 % oli saanut alkunsa hyvälaatuisesta alkiosta ja 50 % keskinkertaisesta alkiosta. Klinefelter-ryhmässä synnytyksiä oli yhteensä 7 kpl. Synnytykseen johtaneista ras- kauksista 29 % oli saanut alkunsa hyvälaatuisesta alkiosta, 57 % keskinkertaisesta alkiosta ja 14 % huonolaatuisesta alkiosta. Idiopaattisten ryhmässä synnytyksiä oli yhteensä 10 kpl. Syn- nytykseen johtaneista raskauksista 50 % oli saanut alkunsa hyvälaatuisesta alkiosta, 40 % kes- kinkertaisesta alkiosta ja 10 % huonolaatuisesta alkiosta. Muut-ryhmässä synnytyksiä oli yh- teensä 12 kpl. Synnytykseen johtaneista raskauksista 75 % oli saanut alkunsa hyvälaatuisesta alkiosta, 8 % keskinkertaisesta alkiosta ja 17 % huonolaatuisesta alkiosta. Koska alkioiden määrä oli pieni, ei tuloksista voitu luotettavasti tehdä tilastollista analyysiä. 3.3 NOA-potilaan ICSI-hoidon vaativuuden vaikutus munasolujen hedelmöittymiseen ja alkiolaatuun 3.3.1 Vaativien ja helppojen ICSI-hoitojen taustatekijät Vaativia ja helppoja NOA-potilaiden ICSI-hoitoja vertailtiin naisen taustatekijöiden; hoidoista saatuja kypsien munasolujen määrän, hoidettavan naisen iän, painoindeksin sekä hoitomuodon suhteen (Taulukko 9). Ryhmien välillä ei näiden taustatekijöiden suhteen ollut tilastollisesti merkitsevää eroa. Taulukko 9. Naisen taustatekijöiden vertailu ICSI-hoitojen suhteen. KAIKKI HELPPO VAATIVA P-ARVO NAISEN IKÄ keskiarvo (keskihajonta) 32 (4,4) 33 (4,1) 31 (4,7) 0,50 BMI mediaani (Q1, Q3) 26 (22, 28) 26 (24, 31) 25 (22, 27) 0,13 HOITOMUOTO agonisti n 23 12 11 1,00 antagonisti n 26 13 13 MUNASOLUJA/HENKILÖ mediaani (Q1, Q3) 9 (7, 15) 9 (7, 16) 8 (7, 12) 0,44 28 3.3.2 Munasolujen hedelmöittymisen ja alkiolaadun vertailu helppojen ja vaativien MD- TESE-ICSI -hoitojen välillä MD-TESE-ICSI -hoidoissa olleille naisille tehtiin yhdestä kolmeen munasolukeräystä (hoitoa) (Taulukko 10). Hoitojen määrällä/potilas ei ollut tilastollisesti merkitsevää vaikutusta munaso- lujen hedelmöittymiseen (p=0,44), eikä alkiolaatuun (p=0,87). Hoitoja Helppo MD-TESE-ICSI -ryhmässä oli 25 ja Vaativa MD-TESE-ICSI -ryhmässä 24. Näistä hoidoista saatiin yhteensä 715 kypsää munasolua. Helpossa MD-TESE-ICSI -ryhmässä kypsiä munasoluja saatiin 352, joista hedelmöittyi 248 (70,5 %; 95-LV 65,5 %, 75,0 %). Hyvälaatuisia alkioita oli 41 (11,6 %; 95-LV 8,7 %, 15,4 %), keskinkertaisia alkioita 74 (21,0 %; 95-LV 17,1 %, 25,6 %) ja huono- laatuisia alkioita 133 (37,8 %; 95-LV 32,9 %, 43,0 %). Kypsistä munasoluista 29,5 % ei hedel- möittynyt (Kuva 6). Vaativa MD-TESE-ICSI -ryhmässä kypsiä munasoluja saatiin 363, joista hedelmöittyi 187 (51,5 %; 95-LV 46,4 %, 56,6 %). Hyvälaatuisia alkioita oli 27 (7,4 %; 95-LV 5,2 %, 10,6 %), keskinkertaisia alkioita 44 (12,1 %; 95-LV 9,2 %, 15,9 %) ja huonolaatuisia alkioita 116 (32,0 %; 95-LV 27,4 %, 36,9 %). Kypsistä munasoluista 48,5 % ei hedelmöittynyt (Kuva 6). Helpossa MD-TESE-ICSI:ssä munasolujen hedelmöittymisprosentti oli korkeampi kuin vaativissa TESE-ICSEissä (helppo vs. vaativa OR 2,844 95-LV 1,574-5,139) (p = 0,0006). Myös alkiolaatu oli helpoissa MD-TESE-ICSEissä parempi (helppo vs. vaativa OR 2,487; 95- LV 1,462-4,231) (p = 0,0008). Taulukko 10. Naisten taustatekijät kypsien munasolujen suhteen ICSI-hoidoissa. KAIKKI (N=715) HELPPO (N=352) VAATIVA (N=363) NAISEN IKÄ mediaani (Q1, Q3) 32 (29,35) 33 (31,37) 31 (28,34) BMI mediaani (Q1, Q3) 23 (22,27) 27 (24,31) 22 (20,27) HOITOMUOTO agonisti (n) 354 143 211 antagonisti (n) 361 209 152 Hoitokerta 1 499 268 231 2 168 73 95 3 48 11 37 MUNASOLUJA/HENKILÖ mediaani (Q1, Q3) 12 (7,18) 12 (8,18) 9 (7,14) 29 Kuva 6 MD-TESE-ICSI:n vaativuuden vaikutus munasolujen hedelmöittymiseen ja alkiolaatuun. Helpoissa ICSI-hoi- doissa hedelmöittyi tilastollisesti enemmän munasoluja (p= 0,0006) ja alkiolaatu oli helpoissa hoidoissa parempi kuin vaativissa (p= 0,0008). Helppoja MD-TESE-ICSEjä oli 39 kpl ja vaativia MD-TESE-ICSEjä 42 kpl. 3.3.3 Synnytykseen johtaneiden alkioiden laatu vaativissa ja helpoissa MD-TESE-ICSI -hoidoissa Tutkimuksessa verrattiin synnytykseen johtaneiden alkioiden alkiolaatua helppojen ja vaativien MD-TESE-ICSI -hoitojen välillä. Helpoissa MD-TESE-ICSI -hoidoissa synnytyksiä oli yh- teensä 22 kpl. Synnytykseen johtaneista raskauksista 50 % oli saanut alkunsa hyvälaatuisesta alkiosta, 36 % keskinkertaisesta alkiosta ja 14 % huonolaatuisesta alkiosta. Vaativista ICSI- hoidoista synnytyksiä oli yhteensä 21 kpl. Synnytykseen johtaneista raskauksista 48 % oli saa- nut alkunsa hyvälaatuisesta alkiosta, 38 % keskinkertaisesta alkiosta ja 14 % huonolaatuisesta alkiosta. Koska alkioiden määrä oli pieni, ei tuloksista voitu luotettavasti tehdä tilastollista ana- lyysiä. 30 4. TULOSTEN TARKASTELU 4.1. Alkiolaatu NOA-potilaiden ICSI-hoidoissa. MD-TESE-siittiöillä toteutettu hedelmöityshoito on tehokas ja turvallinen tapa hoitaa miehen vaikeaa NOA:sta johtuvaa hedelmättömyyttä. Kyseisellä menetelmällä aikaan saaduista alki- oista on tähän mennessä kuitenkin vähän tutkimustietoa ja saatu tieto on ristiriitaista. Työn tar- koituksena oli tutkia, miten atsoospermian taustalla olevat syyt vaikuttavat alkioiden laatuun. Tutkimuksessa oli kaksi ryhmää, NOA-potilaat, joiden spermatogeneesi on vakavasti häiriinty- nyt sekä OA-potilaat, joiden spermatogeneesi on normaali. NOA- ja OA-ryhmien välillä ei havaittu olevan tilastollisesti merkitsevää eroa munasolujen hedelmöittymisessä (hedelmöitty- misprosentti NOA 62,8 % vs. OA 64,4 %) eikä alkiolaadussa (hyvät ja keskinkertaiset alkiot yhteensä NOA 26,3 % vs. OA 23,6 %). Myös Zaninovic & Schlegel (2013) havaitsivat alkioke- hityksen olevan samanlainen sekä NOA- että OA-potilaiden siittiöillä tehdyissä hoidoissa. Tässä tutkimuksessa NOA-ryhmässä alkionlaatu oli jopa hieman parempi kuin OA-ryhmässä, vaikka tilastollista merkitsevyyttä ei havaittu. Aikaisemmissa tutkimuksissa on kuitenkin to- dettu myös päinvastaisia tuloksia. Solujen tiivistymisen morulaksi sekä blastokystien muodos- tumisen ja laajentumisen on todettu merkittävästi alentuneen NOA-potilaiden hoidoista saa- duissa alkioissa verrattuna OA-potilaiden hoidoista saatuihin alkiohin (Desai ym. 2018). Yalcin ym. (2017) totesivat munasolujen hedelmöittymisen ja raskausluvun olevan alhaisempi NOA- potilaiden siittiöillä tehdyissä hoidoissa verrattuna OA-potilaiden siittiöillä tehtyihin hoitoihin. Hedelmöittymisprosentti ja implantaatioaste olivat merkitsevästi alhaisemmat NOA-potilaiden hoidoissa kuin OA-potilaiden hoidoissa, mutta elävänä syntyvyys oli molemmissa ryhmissä sama (Vahidi ym. 2021; Nicopoullos, 2004). Tämän tutkimuksen tulokset tukevat Zaninivicin ja Schlegelin (2013) havaintoja NOA- ja OA-potilaiden siittiöillä aikaan saatujen alkioiden ke- hityksestä, mutta ovat ristiriitaiset Desain (2018) ja Yalcinin (2017) havaintojen kanssa. Tässä tutkimuksessa tarkasteltiin myös synnytykseen johtaneiden alkioiden alkiolaatua NOA- ja OA-ryhmien välillä. Koska alkioiden määrä oli pieni, ei tuloksista voitu luotettavasti tehdä tilastollista analyysiä. Näyttää siltä, että synnytykseen johtaneissa alkionsiirroissa alkiolaatu oli samankaltainen molemmissa ryhmissä ja suurin osa synnytykseen johtaneista alkioista oli laa- dultaan hyviä tai keskinkertaisia. Samasta aineistosta tehdyssä tutkimuksessa kliininen raskaus- luku ei eronnut merkitsevästi NOA- ja OA-ryhmien välillä (Klami, 2024). Vastaavaan tulokseen päätyivät myös Yalcin ym. (2017) sekä Nicopoullos ym. (2004). Varhaista siittiövaikutusta al- kiolaatuun on mahdollista arvioida tsygoottimorfologialla ja varhaisalkion blastomeerien ja- 31 kautumisnopeudella (Bashiri ym. 2021). Varhaisalkionkehitystä tutkittiin seuraamalla blasto- meerien jakautumisnopeutta, fragmentoitumista, solusymmetriaa ja tumastatusta. Näiden tiede- tään korreloivan alkion myöhempään kehitykseen sekä aneuploidiaan. Alkioiden morfokineet- tistä kehitystä seuraamalla voidaan arvioida kunkin alkion kehityspotentiaalia ja valita hyvä alkio alkionsiirtoon. Loput alkiot, joiden ennustetaan tuottavan raskaus, pakastetaan myöhem- pää käyttöä varten. Näin hoidoista saadaan mahdollisimman tehokkaita, mikä on tärkeää sekä potilaalle että hoitavalle yksikölle. Morfokineettinen alkionkehityksen seuraaminen on usein ainoa vaihtoehto alkiolaadun tutkimiseen, sillä tarkempaa alkiodiagnostiikkaa PGT-A:ta (Preimplantation testing for aneuploidy), jolla pyritään seulomaan aneuploidiaa alkiosta ote- tuista soluista, tehdään julkisessa terveydenhoidossa vain, jos tiedetään, että vanhemmat ovat vaikean periytyvän sairauden kantajia tai tätä on syytä epäillä. Havaintojemme perusteella voi- daan todeta, että morfologisesti hyvän ja tietyllä nopeudella kehittyvän NOA-potilaan alkion kyky tuottaa normaali raskaus ei näyttäisi eroavan perinteisellä ICSI-menetelmällä aikaan saa- dusta alkiosta. Tämän tutkimuksen perusteella NOA-potilaille ei ole ensisijaisesti syytä suosi- tella lahjasiittiöhoitoa, jos omia siittiöitä löydetään MD-TESE-menetelmällä. 4.2 NOA-potilaan taustadiagnoosin vaikutus alkiolaatuun Tutkimushypoteesini oli, että NOA-potilaan taustadiagnoosilla saattaa olla vaikutusta munaso- lun hedelmöittymiseen ja alkiolaatuun. Tutkimuksessa ei kuitenkaan havaittu diagnoosiryh- mien välillä tilastollisesti merkitsevää eroa munasolujen hedelmöittymisessä eikä alkiolaa- dussa. Vaikka diagnoosien välillä ei tilastollisesti nähdä merkitsevyyttä alkiolaadussa, oli Y- deleetio AZFc ryhmän munasolujen hedelmöittyminen sekä alkiolaatu selvästi huonompi kuin muissa ryhmissä (hedelmöittymisprosentti 49 % ja hyvien sekä keskinkertaisten alkioiden määrä 8 %). Se, että tulos ei ollut tilastollisesti merkitsevä, saattaa selittyä sillä, että Y-deleetio- potilaita oli vähän. Aikaisemmissa tutkimuksissa Y-kromosomin mikrodeleetio AZFc:n on ra- portoitu ennustavan alhaisempaa hedelmöityslukua kuin muilla NOA-potilailla (Yamaguchi ym. 2020). Alkioiden lisääntyneen aneuploidian sekä merkitsevästi heikentyneen alkion kehit- tymisen blastokystiksi on todettu liittyvän AZFc-deleetioon (Mateu ym. 2010). Y-deleetion tie- detään vaikuttavan haitallisesti ICSI-tulokseen ja sen on todettu huonontavan kliinisen raskau- den ja elävänä syntyvyyden todennäköisyyttä (Zhang ym. 2021). Johtopäätöksenä voidaan to- deta, että vaikka hoidon ennuste Y-deleetiopotilailla on huonompi, huolellisesti toteutettu hoito voi silti johtaa synnytykseen. Tässä potilasryhmässä potilasneuvonnan tärkeys korostuu. Hoi- 32 dettavaa paria olisi valmisteltava tiedolla, että hoito ei välttämättä johda toivottuun lopputulok- seen, jolloin hoidettava voisi varautua lahjasiittiöiden käyttöön. Myös tieto Y-deleetion periy- tymisestä poikalapselle voi auttaa hoitoa saavaa paria tekemään päätöksen lahjasiittiöiden käy- töstä, vaikka omia siittiöitä olisikin käytettävissä. Deleetion periytyminen olisi estettävissä al- kion sukupuolen valinnalla, mutta ainakaan toistaiseksi Y-deleetion periytymistä ei ole Suo- messa hyväksytty sukupuolen valinnan kriteeriksi. Klinefelter-potilailta löydetään siittiöitä MD-TESE-menetelmällä noin 50–70 %:ssa tapauksista (Klami ym. 2018). Tämän tutkimuksen aineistossa Klinefelter-ryhmässä munasolujen hedel- möittymisprosentti oli 61. Aikaisemmissa tutkimuksissa munasolujen hedelmöittymisprosentti on ollut samanlainen (Schiff ym. 2005; Madureira ym 2014). Tässä ryhmässä 26 % kypsistä munasoluista kehittyi hyviksi tai keskinkertaisiksi alkioiksi. Noin 70 % NOA-potilaista jää il- man syytä atsoospermialle. Koska näiden potilaiden atsoospermian syitä ei tunneta, voivat ne olla hyvinkin erilaisia. Idiopaattisilta NOA-potilailta löydetään MD-TESE -menetelmällä siit- tiöitä vain noin 30–40 %:ssa tapauksista, eli kaikkein vähiten NOA:n ryhmistä (Achermann ym. 2021; Chen ym. 2019). Munasolujen hedelmöittyminen ja alkiolaatu oli tässä ryhmässä samankaltainen kuin Klinefelter-ryhmässä. Muut-ryhmässä (piilokives, anabolisten steroidien käyttö, aikaisempi sytostaattihoito sekä eräs harvinainen syndrooma) munasolujen hedelmöittyminen ja alkiolaatu oli hieman parempi kuin Klinefelter- ja idiopaattinen-ryhmissä (hyviä ja keskinkertaisia alkioita yhteensä 32 %), mutta vailla tilastollista merkitsevyyttä. Tulos on samankaltainen kuin aikaisemmissa tutkimuksissa, joissa piilokiveksisillä on todettu hieman parempi alkiolaatu kuin idiopaattisessa NOA:ssa (Is- hikawa ym. 2022). Solusalpaajahoitojen jälkeen munasolujen hedelmöittymisen ja alkiokehi- tyksen on raportoitu olevan parempi kuin idiopaattisessa NOA:ssa (Ishikawa ym. 2018). Tutkimuksessa tarkasteltiin myös, minkä laatuiset alkiot johtivat synnytykseen ja oliko alkioi- den laatu synnytykseen johtaneissa raskauksissa erilainen NOA-potilaan taustadiagnoosista riippuen. AZFc-ryhmässä alkioita saatiin yhteensä 43. Kaksi näistä alkioista (1 hyvälaatuinen ja 1 keskinkertainen) johti synnytykseen. Klinefelter-ryhmässä alkioita saatiin yhteensä 127. Seitsemän (2 hyvälaatuista, 4 keskinkertaista ja 1 huonolaatuinen) alkiota johti synnytykseen. Idiopaattinen-ryhmässä alkioiden määrä oli 184 ja näistä alkioista 10 (5 hyvälaatuista, 4 kes- kinkertaista ja 1 huonolaatuinen) johti synnytykseen. Muut-ryhmässä alkioita oli 142, joista synnytykseen johti 12 (9 hyvälaatuista, 1 keskinkertaista ja 2 huonolaatuista) alkiota. Koska 33 synnytykseen johtaneiden alkioiden määrä oli pieni, ei tuloksista voitu luotettavasti tehdä tilas- tollista analyysiä. Kaikista ryhmistä kuitenkin saatiin aikaan alkioita, jotka tuottivat toivotun synnytyksen. Suurin osa synnytykseen johtaneista alkioista kaikissa diagnoosiryhmissä oli hy- viä tai keskinkertaisia. Alkioiden laadusta tehtyjen havaintojen perusteella voidaan päätellä, että hyvälaatuisen alkion kyky tuottaa raskaus on hyvä taustadiagnoosista riippumatta. 4.3 Siittiöiden valinnan merkitys mikrohedelmöityksessä MD-TESE-menetelmällä on mahdollista löytää siittiöitä potilailta, joiden siittiötuotanto on va- kavasti häiriintynyt. Tällöin talteen saadaan vain yksittäisiä, usein morfologialtaan hyvin huo- noja siittiöitä, eikä hedelmöitykseen käytettäviä siittiöitä päästä valitsemaan. Siittiöiden valinta perinteisessä ICSI:ssä perustuu siittiöiden liikkuvuuteen sekä morfologisesti hyvän siittiön va- lintaan (Verheyen ym. 2017). Tässä tutkimuksessa havaittiin, että kun päästiin valitsemaan mor- fologialtaan hyvä siittiö, oli munasolujen hedelmöittyminen sekä alkiolaatu parempi. Myös Aboukhshaba ym. (2022) havaitsivat, että parempaan munasolujen hedelmöittymiseen ja klii- niseen raskauslukuun johti mikroinjektio, jossa siittiöllä oli normaali akrosomiosa. Epänor- maali akrosomi ei kuitenkaan poissulkenut hedelmöittymistä tai kliinistä raskautta. Epänormaa- lilla pään, kaulan tai hännän morfologialla ei ollut merkitsevää vaikutusta hedelmöittymiseen tai kliiniseen raskauteen. Lyhythäntäisellä siittiöllä injektointiin liittyi kuitenkin huonompi he- delmöittyminen kuin normaalihäntäisellä siittiöllä tehtyyn injektioon (Aboukhshaba ym. 2022). Tutkimuksessa tarkasteltiin myös synnytykseen johtaneiden alkioiden alkiolaatua helppojen ja vaativien ICSI-hoitojen välillä. Koska alkioiden määrä oli pieni, ei tuloksista voitu luotettavasti tehdä tilastollista analyysiä. Vaikka vaativa ja helppo ICSI-ryhmien välillä oli tilastollisesti mer- kitsevä ero munasolujen hedelmöittymisessä ja alkiolaadussa, näyttää siltä, että synnytykseen johtaneissa alkionsiirroissa alkiolaatu oli samankaltainen molemmissa ryhmissä ja molemmissa ryhmissä oli saman verran synnytyksiä. Non-obstruktiivisesta atsoospermiasta kärsivien mies- ten siittiöissä on havaittu normaalia enemmän aneuploidioita (Gianaroli ym. 2005b; Sun ym. 2008). Vaikka vaativassa mikrohedelmöityksessä ei siittiöitä päästä valitsemaan morfologian perusteella, oli tutkimuksessa terveiden syntyneiden lasten määrä silti samankaltainen. Tämä havainto ei tue aikaisempia havaintoja morfologian yhteydestä aneuploidiaan ja sen merkityk- sestä siittiön kykyyn tuottaa elinkelpoinen alkio. 34 4.4 Johtopäätökset ja tulevaisuus miehen vaikean lapsettomuuden hoidossa Miesten hedelmättömyys on maailmanlaajuinen terveysongelma, jolla on merkittäviä kustan- nus- sekä psykologisia vaikutuksia (Vander Borght & Wyns 2018). Useat tutkimukset ovat osoittaneet miesten hedelmällisyyden heikkenemistä länsimaissa. Iän, elintapojen ja ympäris- tötekijöiden on osoitettu vaikuttavan siittiötuotantoon. Miehen huonontuneen yleisen tervey- dentilan on osoitettu heikentävän miehen lisääntymisterveyttä; siittiömäärä ja testosteronitaso on usein alentunut ja follikkelia stimuloivan hormonin pitoisuus on kohonnut (Ventimiglia ym. 2015). Siemennesteen tilavuuden, siittiöiden liikkuvuuden ja siittiömorfologian on todettu huo- nonevan miehen ikääntyessä. Myös siittiöiden DNA-fragmentaation on osoitettu lisääntyvän (Evenson ym. 2020). Siittiöiden määrän on kuitenkin osoitettu pysyvän melko samana ikään- tymisestä huolimatta (Johnson ym. 2015). Lisäksi erilaisten ympäristötekijöiden tiedetään ole- van syynä heikentyneeseen spermanlaatuun joko suoraan tai epigeneettisten mekanismien kautta (Skakkebaek ym. 2016). Spermatogeneesiin on todettu vaikuttavan vähintään 2000 geeniä. Sukupuolikromosomien poikkeavuuksilla on suuri merkitys vakavissa spermatogeneesin vaurioissa. Autosomeissa ole- vat geenimutaatiot liittyvät pääasiassa hypogonadismiin, teratozoospermiaan tai astenozoos- permiaan, synnynnäiseen obstruktiiviseen atsoospermiaan sekä suvussa esiintyviin kvantitatii- visiin spermatogeneesin häiriöihin. Vaikka hedelmättömyyden syitä on tutkittu paljon, silti noin 40 % hedelmättömyyden syistä on vielä tuntemattomia (Krausz & Riera-Escamilla 2018). Koko genomin tutkimukset ovat lupaavimpia keinoja löytää geneettistä tietoa miehen vaikeasta lap- settomuudesta, jotta voidaan välttää turhia kirurgisia ja lääketieteellisiä hoitoja. Suurin osa, noin 70 %, NOA:n syistä on tuntemattomia, ja on olemassa riski siirtää geneettisiä poikkeavuuksia jälkeläisille. Tämän takia geneettisten tekijöiden löytyminen olisi tärkeää. Vaikka kiveskudos- siittiöillä tehdyistä hedelmöityshoidoista syntyneet lapset ovat yhtä terveitä kuin muista koe- putkihoidoista syntyneet lapset, tarvitaan näiden lasten pitkäaikaisseurantaa. Tämän tutkimuksen tulosten perusteella voidaan todeta, että munasolujen hedelmöittyminen ja alkiolaatu eivät eroa toisistaan NOA- ja OA-ryhmissä, vaikka NOA-potilaiden spermatogeneesi on usein vaikeasti häiriintynyt. Myöskään NOA-potilaan diagnoosilla ei ole vaikutusta muna- solujen hedelmöittymiseen tai alkiolaatuun, joten millekään yksittäiselle ryhmälle ei ole syytä suositella ensisijaisesti lahjasiittiöiden käyttöä, jos omia siittiöitä löydetään MD-TESE:n avulla. Koska NOA-potilaiden spermatogeneesi on vaikeasti häiriintynyt, löydetään MD- TESE:n avulla usein vain muutamia siittiöitä hedelmöitykseen. Noin puolet tutkimusaineiston 35 MD-TESE-ICSI -hoidoista oli näitä, niin sanottuja vaativia ICSI-hoitoja. Näissä vaativissa hoi- doissa munasolujen hedelmöittyminen ja alkiolaatu oli tilastollisesti huonompi kuin niissä hoi- doissa, joissa siittiöitä oli niin paljon, että niistä voitiin valita morfologialtaan parhaat siittiöt mikrohedelmöitykseen. Vaikeaa miehen hedelmättömyyttä hoitamaan tarvitaan kokeneita and- rologeja ja embryologeja. Suomen kokoisessa maassa kyseisten hoitojen keskittämistä yhteen klinikkaan tulisi harkita. Lapsettomuus aiheuttaa potilaille huomattavaa psyykkistä ja sosiaa- lista kuormitusta ja taloudellisen taakan sekä potilaille että terveydenhuoltojärjestelmälle. Var- hainen diagnoosi ja asianmukainen hoito ovat tärkeitä hoidettaessa miehen vaikeaa lapsetto- muutta. Hoitotuloksiin vaikuttavien tekijöiden ymmärtäminen auttaa ennustamaan hoidon on- nistumisen todennäköisyyttä sekä auttaa neuvomaan potilaita paremmin. 36 KIITOKSET Kiitän kaikkia Pro gradu -työni ohjaajia, Turun yliopiston eläinfysiologian professoria, Katja Anttilaa, Tyksin lisääntymislääketieteen yksikön erikoislääkäreitä, LT Rauni Klamia ja LT, Dos. Antti Perheentupaa sekä IVF-biologi, FT Harri Mankosta. Kiitos Katja lempeistä neuvoista ja avusta. Kiitos Rauni ja Antti gradu-aiheen suunnittelusta ja lääketieteellisistä neuvoista sekä opiskeluinspiraatiosta. Teidän kanssanne on aina ilo tehdä töitä. Iso kiitos biostatistikko, FM Jenni Palanderille. Olit korvaamaton apu tilasto-osion suunnittelussa ja toteuttamisessa. Haluan kiittää myös omia rakkaita tyttäriäni Oliviaa, Linneaa ja Elleniä. Olette jaksaneet pitää huolta itsestänne, omista koulutöistänne ja välillä äidistännekin tämän prosessin aikana. Ja lopuksi aivan erityiset kiitokset Harrille mentoroinnista, tuesta, kannustuksesta ja kannattelusta. Ne aut- toivat minua jaksamaan ja ylläpitämään innostusta opintoihini työn ja muun arjen keskellä. 37 LÄHTEET Abdullah L, & Bondagji N. (2011). Histopathological patterns of testicular biopsy in male in- fertility: A retrospective study from a tertiary care center in the western part of Saudi Arabia. Urology Annals, 3(1), 19-23. Aboukhshaba A, Punjani N, Doukakis S, Zaninovic N, Palermo G & Schlegel P.N. (2022). Tes- ticular sperm characteristics in men with nonobstructive azoospermia and their impact on in- tracytoplasmic sperm injection outcome. Fertility and Sterility, 117(3), 522–527. Achermann A.P.P, Pereira T.A, & Esteves S.C. (2021). Microdissection testicular sperm extrac- tion (micro-TESE) in men with infertility due to nonobstructive azoospermia: summary of cur- rent literature. International Urology and Nephrology, 53(11), 2193–2210. Aydin T, Sofikerim M, Yucel B, Karadag M & Tokat F. (2015). Effects of testicular histopathol- ogy on sperm retrieval rates and ICSI results in non-obstructive azoospermia. Journal of Ob- stetrics and Gynaecology, 35(8), 829–831. Bachir B.G & Jarvi K. (2014). Infectious, Inflammatory, and Immunologic Conditions Result- ing in Male Infertility. Urologic Clinics of North America, 41(1), 67–81. Bashiri Z, Amidi F, Amiri I, Zandieh Z, Maki C.B, Mohammadi F, Amiri S, & Koruji M. (2021). Male Factors: the Role of Sperm in Preimplantation Embryo Quality. Reproductive Sciences, 28(7), 1788–1811. Bernie A.M, Mata D.A, Ramasamy R & Schlegel P.N. (2015). Comparison of microdissection testicular sperm extraction, conventional testicular sperm extraction, and testicular sperm aspi- ration for nonobstructive azoospermia: a systematic review and meta-analysis. Fertility and Sterility, 104(5), 1099–1103. Bernie A.M, Ramasamy R, & Schlegel P.N. (2013). Predictive factors of successful microdis- section testicular sperm extraction. Basic and Clinical Andrology, 23(1), 5. Björndahl L & Kirkman Brown J. (2022). The sixth edition of the WHO Laboratory Manual for the Examination and Processing of Human Semen: ensuring quality and standardization in basic examination of human ejaculates. Fertility and Sterility, 117(2), 246–251. 38 Bocca S, Moussavi V, Brugh V, Morshedi M, Stadtmauer L, & Oehninger S. (2017). ICSI out- comes in men undergoing TESE for azoospermia and impact of maternal age. Andrologia, 49(2), e12617. Bonde J.P.E, Ernst E, Jensen T.K, Hjollund N.H.I, Kolstad H, Scheike T, Giwercman A, Skakkebæk N.E, Henriksen T.B & Olsen J. (1998). Relation between semen quality and fertil- ity: a population-based study of 430 first-pregnancy planners. The Lancet, 352(9135), 1172– 1177. Chen X, Ma Y, Zou S, Wang S, Qiu J, Xiao Q, Zhou L & Ping P. (2019). Comparison and outcomes of nonobstructive azoospermia patients with different etiology undergoing Micro- TESE and ICSI treatments. Translational Andrology and Urology, 8(4), 366–373. Chiba K, Enatsu N, & Fujisawa M. (2016). Management of non‐obstructive azoospermia. Re- productive Medicine and Biology, 15(3), 165–173. Cioppi F, Rosta V, & Krausz C. (2021). Genetics of azoospermia. In International Journal of Molecular Sciences 22(6) 3264. Colaco S & Sakkas D. (2018). Paternal factors contributing to embryo quality. Journal of As- sisted Reproduction and Genetics, 35(11), 1953–1968. Coward R.M & Mills J.N. (2017). A step-by-step guide to office-based sperm retrieval for ob- structive azoospermia. Translational Andrology and Urology, 6(4), 730–744. Demko Z.P, Simon A.L, McCoy R.C, Petrov D.A, & Rabinowitz M. (2016). Effects of maternal age on euploidy rates in a large cohort of embryos analyzed with 24-chromosome single-nucle- otide polymorphism–based preimplantation genetic screening. Fertility and Sterility, 105(5), 1307–1313. Desai N, AbdelHafez F, Sabanegh E, & Goldfarb J. (2009). Paternal effect on genomic activa- tion, clinical pregnancy and live birth rate after ICSI with cryopreserved epididymal versus testicular spermatozoa. Reproductive Biology and Endocrinology, 7(1), 142. Desai N, Gill P, Tadros N.N, Goldberg J.M, Sabanegh E & Falcone T. (2018). Azoospermia and embryo morphokinetics: testicular sperm-derived embryos exhibit delays in early cell cycle events and increased arrest prior to compaction. Journal of Assisted Reproduction and Genetics, 35(7), 1339–1348. 39 Esteves S.C, Roque M, Bradley C.K, & Garrido N. (2017). Reproductive outcomes of testicular versus ejaculated sperm for intracytoplasmic sperm injection among men with high levels of DNA fragmentation in semen: systematic review and meta-analysis. Fertility and Sterility, 108(3), 456–467. Evenson D.P, Djira G, Kasperson K & Christianson J. (2020). Relationships between the age of 25,445 men attending infertility clinics and sperm chromatin structure assay (SCSA®) de- fined sperm DNA and chromatin integrity. Fertility and Sterility, 114(2), 311–320. Fedder J, Crüger D, Oestergaard B & Bruun Petersen G. (2004). Etiology of azoospermia in 100 consecutive nonvasectomized men. Fertility and Sterility, 82(5), 1463–1465. Flannigan R.K & Schlegel P.N. (2019). Microdissection testicular sperm extraction: preopera- tive patient optimization, surgical technique, and tissue processing. Fertility and Sterility, 111(3), 420–426. Fowler K.E, Mandawala A.A & Griffin D.K. (2019). The role of chromosome segregation and nuclear organisation in human subfertility. Biochemical Society Transactions, 47(1), 425–432. Gardner D.K & Schoolcraft W.B. (1999). Culture and transfer of human blastocysts. Current Opinion in Obstetrics and Gynaecology, 11(3), 307–311. Gervasi M.G & Visconti P.E. (2017). Molecular changes and signaling events occurring in sper- matozoa during epididymal maturation. Andrology, 5(2), 204–218. Ghanem M, Bakr N.I, Elgayaar, M, el Mongy S, Fathy & Ibrahim A.A. (2005). Comparison of the outcome of intracytoplasmic sperm injection in obstructive and non‐obstructive azoo- spermia in the first cycle: a report of case series and meta‐analysis. International Journal of Andrology, 28(1), 16–21. Gianaroli L, Magli M.C, Cavallini G, Crippa A, Nadalini M, Bernardini L, Menchini Fabris G. F, Voliani S & Ferraretti A.P. (2005). Frequency of aneuploidy in sperm from patients with extremely severe male factor infertility. Human Reproduction, 20(8), 2140–2152. Gianaroli L, Magli M.C, Ferraretti A.P, Fortini D & Grieco N. (2003). Pronuclear morphology and chromosomal abnormalities as scoring criteria for embryo selection. Fertility and Sterility, 80(2), 341–349. 40 Goto S, Kadowaki T, Tanaka S, Hashimoto H, Kokeguchi S & Shiotani M. (2011). Prediction of pregnancy rate by blastocyst morphological score and age, based on 1,488 single frozen- thawed blastocyst transfer cycles. Fertility and Sterility, 95(3), 948–952. Göker E.N.T, Sendag F, Levi R, Sendag H & Tavmergen E. (2002). Comparison of the ICSI outcome of ejaculated sperm with normal, abnormal parameters and testicular sperm. European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology, 104(2), 129–136. Haidl G, Badura B & Schill W. (1994). Function of Human Epididymal Spermatozoa. Journal of Andrology, 15(S6), 23-27. Hopps C.V. (2003). Detection of sperm in men with Y chromosome microdeletions of the AZFa, AZFb and AZFc regions. Human Reproduction, 18(8), 1660–1665. Howell S.J, Radford J.A, Ryder W.D.J & Shalet S.M. (1999). Testicular Function After Cyto- toxic Chemotherapy: Evidence of Leydig Cell Insufficiency. Journal of Clinical Oncology, 17(5), 1493–1493. Huang I-S, Huang W.J & Lin A.T. (2018). Distinguishing non-obstructive azoospermia from obstructive azoospermia in Taiwanese patients by hormone profile and testis size. Journal of the Chinese Medical Association, 81(6), 531–535. Ishikawa T, Mizuta S, Yamaguchi K, Takaya Y, Matsubayashi H, Takeuchi T & Kitaya K. (2018). The assessment of testicular sperm extraction (TESE) and intracytoplasmic sperm in- jection (ICSI) in couples of post chemotherapy non-obstructive azoospermia (NOA). Fertility and Sterility, 110(4), e299. Ishikawa T, Yamaguchi K, Ohara Y, Doshida M, Matsubayashi H & Takeuchi T. (2022). Clinical outcomes of mikrodissection testicular sperm extraction (mikro TESE) and intracytoplasmic sperm injection (ICSI) in non-obstructive azoospermia (NOA) with the history of cryptorchid- ism. Fertility and Sterility, 118(4), e90–e91. Johnson S.L, Dunleavy J, Gemmell N.J & Nakagawa S. (2015). Consistent age-dependent de- clines in human semen quality: A systematic review and meta-analysis. Ageing Research Re- views, 19, 22–33. Klami R, Mankonen H & Perheentupa A. (2018). Successful microdissection testicular sperm extraction for men with non-obstructive azoospermia. Reproductive Biology, 18(2), 137–142. 41 Klami R, Tomás C, Mankonen H & Perheentupa A. (2024). ICSI outcome after microdissection testicular sperm extraction, testicular sperm aspiration and ejaculated sperm. Reproductive Bio- logy, 24(1), artikkeli: 100825. Klami R, Mankonen H, & Perheentupa A. (2018). Siittiöitä suoraan kiveksistä? Duodecim, 2018;134, 1897-1903 Krausz C, Cioppi F & Riera-Escamilla A. (2018). Testing for genetic contributions to infertility: potential clinical impact. Expert Review of Molecular Diagnostics, 18(4), 331–346. Krausz C & Riera-Escamilla A. (2018). Genetics of male infertility. Nature Reviews Urology, 15(6), 369–384. Loutradi K.E, Tarlatzis B.C, Goulis D.G, Zepiridis L, Pagou T, Chatziioannou E, Grimbizis G.F, Papadimas I & Bontis I. (2006). The effects of sperm quality on embryo development after intracytoplasmic sperm injection. Journal of Assisted Reproduction and Genetics, 23(2), 69– 74. Lundin K, Bergh C & Hardarson T. (2001). Early embryo cleavage is a strong indicator of embryo quality in human IVF. Human Reproduction, 16(12), 2652–2657. Madureira C, Cunha M, Sousa M, Neto A. P, Pinho M. J, Viana P, Gonçalves A, Silva J, Teixeira da Silva J, Oliveira C, Ferraz L, Dória S, Carvalho F & Barros A. (2014). Treatment by testicular sperm extraction and intracytoplasmic sperm injection of 65 azoospermic patients with non‐ mosaic Klinefelter syndrome with birth of 17 healthy children. Andrology, 2(4), 623–631. Magli M.C, Crippa A, Benincasa M, Terzuoli G, Azzena S, Maresca L, Albanese C, Colombo F, Ferraretti A.P & Gianaroli L. (2020). Sperm chromosome abnormalities in patients with nor- mal karyotype and in translocation carriers: clinical relevance for assisted reproductive tech- nology. Reproductive BioMedicine Online, 41(6), 1055–1069. Mateu E, Rodrigo L, Martínez M.C, Peinado V, Milán M, Gil-Salom M, Martínez-Jabaloyas J.M, Remohí J, Pellicer A & Rubio, C. (2010). Aneuploidies in embryos and spermatozoa from patients with Y chromosome microdeletions. Fertility and Sterility, 94(7), 2874–2877. Meistrich M.L. (2013). Effects of chemotherapy and radiotherapy on spermatogenesis in hu- mans. Fertility and Sterility, 100(5), 1180–1186. 42 Mougou-Zerelli S, Brahem S, Kammoun M, Jerbi M, Elghezal H, Ajina M & Saad A. (2011). Detection of aneuploidy rate for chromosomes X, Y and 8 by fluorescence in-situ hybridization in spermatozoa from patients with severe non-obstructive oligozoospermia. Journal of Assisted Reproduction and Genetics, 28(10), 971–977. Nicopoullos J.D.M. (2004). The results of 154 ICSI cycles using surgically retrieved sperm from azoospermic men. Human Reproduction, 19(3), 579–585. Oates R. (2016). Adolescent Klinefelter syndrome: is there an advantage to testis tissue har- vesting or not? F1000Research, 5, Artikkeli:1595. Oron G, Son W-Y, Buckett W, Tulandi T & Holzer H. (2014). The association between embryo quality and perinatal outcome of singletons born after single embryo transfers: a pilot study. Human Reproduction, 29(7), 1444–1451. Palermo G. (1992). Pregnancies after intracytoplasmic injection of single spermatozoon into an oocyte. The Lancet, 340(8810), 17–18. Park Y-S, Lee S-H, Lim C.K, Cho J.W, Yang K.M & Seo J.T. (2015). Effect of testicular sper- matozoa on embryo quality and pregnancy in patients with non-obstructive azoospermia. Sys- tems Biology in Reproductive Medicine, 61(5), 300–306. Pellegrini L & Cozzolino M. (2023). Embryo quality evaluation and cryopreservation. In Man- agement of Infertility (pp. 309–316). Pitteloud N, Durrani S, Raivio T & Sykiotis G.P. (2010). Complex Genetics in Idiopathic Hy- pogonadotropic Hypogonadism (pp. 142–153). Racowsky C, Stern J.E, Gibbons W.E, Behr B, Pomeroy K.O & Biggers J.D. (2011). National collection of embryo morphology data into Society for Assisted Reproductive Technology Clinic Outcomes Reporting System: associations among day 3 cell number, fragmentation and blastomere asymmetry, and live birth rate. Fertility and Sterility, 95(6), 1985–1989. Racowsky C, Vernon M, Mayer J, Ball G.D, Behr B, Pomeroy K.O, Wininger D, Gibbons W, Conaghan J & Stern J.E. (2010). Standardization of grading embryo morphology. Journal of Assisted Reproduction and Genetics, 27(8), 437–439. 43 Sangwan J.S, Petit C, Rose R. sainte, Frapsauce C, Dijols L, Rigot J.M & Guérif F. (2021). Non-obstructive idiopathic azoospermia vs azoospermia with antecedents of cryptorchidism: ways and probabilities of becoming parents. Basic and Clinical Andrology, 31(1), 30. Schiff J. D, Palermo G. D, Veeck L. L, Goldstein M, Rosenwaks Z & Schlegel P. N. (2005). Success of Testicular Sperm Injection and Intracytoplasmic Sperm Injection in Men with Kline- felter Syndrome. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 90(11), 6263–6267. Sharlip I.D, Jarow J.P, Belker A.M, Lipshultz L.I, Sigman M, Thomas A.J, Schlegel P.N, How- ards S.S, Nehra A, Damewood M.D, Overstreet J.W & Sadovsky R. (2002). Best practice pol- icies for male infertility. Fertility and Sterility, 77(5), 873–882. Shulman A. (1999). In-vitro fertilization treatment for severe male factor: the fertilization po- tential of immotile spermatozoa obtained by testicular extraction. Human Reproduction, 14(3), 749–752. Skakkebaek N.E, Rajpert-De Meyts E, Buck Louis G.M, Toppari J, Andersson A-M, Eisenberg M.L, Jensen T.K, Jørgensen N, Swan S.H, Sapra K.J, Ziebe S, Priskorn L & Juul A. (2016). Male Reproductive Disorders and Fertility Trends: Influences of Environment and Genetic Sus- ceptibility. Physiological Reviews, 96(1), 55–97. Stouffs K, Gheldof A, Tournaye H, Vandermaelen D, Bonduelle M, Lissens W, & Seneca S. (2016). Sertoli Cell-Only Syndrome: Behind the Genetic Scenes. BioMed Research Interna- tional, 2016, 1–7. Sun F, Mikhaail-Philips M, Oliver-Bonet M, Ko E, Rademaker A, Turek P & Martin R.H. (2008). Reduced meiotic recombination on the XY bivalent is correlated with an increased in- cidence of sex chromosome aneuploidy in men with non-obstructive azoospermia. Molecular Human Reproduction, 14(7), 399–404. Tanaka A, Nagayoshi M, Takemoto Y, Tanaka I, Kusunoki H, Watanabe S, Kuroda K, Takeda S, Ito M & Yanagimachi R. (2015). Fourteen babies born after round spermatid injection into human oocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences, 112(47), 14629–14634. Tiitinen A & Savolainen-Peltonen H. (2019). Lapsettomuus. Naistentaudit ja synnytykset, Dua- decim Tournaye H, Camus M, Goossens A, Liu J, Nagy P, Silber S, van Steirteghem A.C & Devroey P. (1995). Recent concepts in the management of infertility because of non-obstructive azoo- spermia. Human Reproduction, 10(suppl 1), 115–119. 44 Tournaye H, Krausz C & Oates R.D. (2017). Novel concepts in the aetiology of male reproduc- tive impairment. The Lancet Diabetes & Endocrinology, 5(7), 544–553. Vahidi S, Narimani N, Abouei S, Sadeghi A, Lorian K & Rahavian A. (2021). Comparison of intracytoplasmic sperm injection outcomes in azoospermic men who underwent testicular sperm extraction vs. microdissection testicular sperm extraction: A cross-sectional study. Inter- national Journal of Reproductive BioMedicine (IJRM), 837–844. van Marion E.S, Speksnijder J.P, Hoek J, Boellaard W.P.A, Dinkelman-Smit M, Chavli E.A, Steegers-Theunissen R.P.M, Laven J.S.E & Baart E.B. (2021). Time-lapse imaging of human embryos fertilized with testicular sperm reveals an impact on the first embryonic cell cycle. Biology of Reproduction, 104(6), 1218–1227. Vander Borght M & Wyns C. (2018). Fertility and infertility: Definition and epidemiology. Clinical Biochemistry, 62, 2–10. Veeck L.L. (1999). An Atlas of Human Gametes and Conceptuses (L. L. Veeck, Ed.). CRC Press. Ventimiglia E, Capogrosso P, Boeri L, Serino A, Colicchia M, Ippolito S, Scano R, Papaleo E, Damiano R, Montorsi F & Salonia A. (2015). Infertility as a proxy of general male health: re- sults of a cross-sectional survey. Fertility and Sterility, 104(1), 48–55. Verheyen G, Popovic-Todorovic B & Tournaye H. (2017). Processing and selection of surgi- cally-retrieved sperm for ICSI: a review. Basic and Clinical Andrology, 27(1), 6. Vernaeve V, Tournaye H, Osmanagaoglu K, Verheyen G, van Steirteghem A & Devroey P. (2003). Intracytoplasmic sperm injection with testicular spermatozoa is less successful in men with nonobstructive azoospermia than in men with obstructive azoospermia. Fertility and Ste- rility, 79(3), 529–533. Vialard F, Bailly M, Bouazzi H, Albert M, Pont J.C, Mendes V, Bergere M, Gomes D.M, de Mazancourt P & Selva J. (2012). The High Frequency of Sperm Aneuploidy in Klinefelter Pa- tients and in Nonobstructive Azoospermia Is Due to Meiotic Errors in Euploid Spermatocytes. Journal of Andrology, 33(6), 1352–1359. Vogt P. (1996). Human Y chromosome azoospermia factors (AZF) mapped to different subre- gions in Yq11. Human Molecular Genetics, 5(7), 933–943. 45 Vojtech L, Woo S, Hughes S, Levy C, Ballweber L, Sauteraud R.P, Strobl J, Westerberg K, Gottardo R, Tewari M & Hladik F. (2014). Exosomes in human semen carry a distinctive rep- ertoire of small non-coding RNAs with potential regulatory functions. Nucleic Acids Research, 42(11), 7290–7304. Weedin J.W, Bennett R.C, Fenig D.M, Lamb D.J & Lipshultz L.I. (2011). Early Versus Late Maturation Arrest: Reproductive Outcomes of Testicular Failure. Journal of Urology, 186(2), 621–626. World Health Organization. (2021). WHO laboratory manual for the examination and pro- cessing of human semen Sixth edition (6th ed.). Välimäki, M. (2009). Hypogonadismi. Endokrinologia (p. 632). Duadecim. Yalcin I, Berker B, Sukur Y.E, Kahraman K & Ates C. (2017). Comparison of intracytoplasmic sperm injection with testicular spermatozoa success in infertile men with obstructive and non- obstructive azoospermia; a retrospective analysis. Human Fertility, 20(3), 186–191. Yamaguchi K, Ishikawa T, Mizuta S, Takeuchi T, Matsubayashi H, Kokeguchi S, Habara T, Ichioka K, Ohashi M, Okamoto S, Kawamura T, Kanto S, Taniguchi H, Tawara F, Hara T, Hibi H, Masuda H, Matsuyama T & Yoshida H. (2020). Clinical outcomes of microdissection testic- ular sperm extraction and intracytoplasmic sperm injection in Japanese men with Y chromo- some microdeletions. Reproductive Medicine and Biology, 19(2), 158–163. Young J, Xu C, Papadakis G.E, Acierno J.S, Maione L, Hietamäki J, Raivio T & Pitteloud N. (2019). Clinical Management of Congenital Hypogonadotropic Hypogonadism. Endocrine Re- views, 40(2), 669–710. Zaninović N & Schlegel P.N. (2013). MicroTESE and Embryo Development. In Atlas on the Human Testis (pp. 7–21). Springer London. Zhang H-L, Zhao L-M, Mao J-M, Liu D-F, Tang W-H, Lin H-C, Zhang L, Lian Y, Hong K & Jiang H. (2021). Sperm retrieval rates and clinical outcomes for patients with different causes of azoospermia who undergo microdissection testicular sperm extraction-intracytoplasmic sperm injection. Asian Journal of Andrology, 23(1), 59–63. Zhang L, Mao J, Li M, Lian Y, Lin S, Chen L, Yan L, Qiao J & Liu P. (2021). Poor intracyto- plasmic sperm injection outcome in infertile males with azoospermia factor c microdeletions. Fertility and Sterility, 116(1), 96–104. 46 Zheng J, Lu Y, Qu X, Wang P, Zhao L, Gao M, Shi H & Jin X. (2016). Decreased Sperm Motility Retarded ICSI Fertilization Rate in Severe Oligozoospermia but Good-Quality Embryo Trans- fer Had Achieved the Prospective Clinical Outcomes. PLOS ONE, 11(9), artikkeli: e0163524.