Saponiiniseoksen hyödyntäminen pesuaineissa Pro Gradu -tutkielma Turun Yliopisto Kemian laitos Luonnonyhdisteiden kemia Maria Hokkanen Marraskuu 2020 TURUN YLIOPISTO Kemian laitos MARIA HOKKANEN: Saponiiniseoksen hyödyntäminen pesuaineissa Pro gradu –tutkielma, 46 s. Marraskuu 2020 Turun yliopiston laatujärjestelmän mukaisesti tämän julkaisun alkuperäisyys on tarkastettu Turnitin Originality Check -järjestelmällä. Saponiinit ovat glykosidisia yhdisteitä, jotka koostuvat aglykonista ja niihin liittyneistä sokereista. Aglykonit voivat olla triterpeenejä, steroideja tai steroidialkaloideja. Riippuen siitä, onko aglykoniin liittynyt yksi, kaksi vai kolme sokeriketjua, niitä kutsutaan mono-, bi- tai tridesmosidisaponiineiksi. Nimi saponiini tulee latinan kielen sanasta sapo, joka tarkoittaa saippuaa. Saponiineja sisältäviä kasveja onkin käytetty saippuoina jo satojen vuosien ajan. Saponiinit ovat rakenteeltaan hyvin erilaisia, minkä vuoksi niillä on lukuisia biologisia, fysikaalisia ja kemiallisia ominaisuuksia. Amfifiilisen rakenteensa vuoksi saponiinit ovat pinta-aktiivisia aineita. Tällaisilla yhdisteillä on vaahdonmuodostus-, emulsionmuodostus- ja pesuaineominaisuuksia. Saponiinit muodostavat misellejä vesiliuoksissa, kun niiden konsentraatio ylittää kriittisen misellinmuodostuskonsentraation. Tässä työssä selvitettiin mahdollisuutta hyödyntää kotimaisten kasvien sisältämiä saponiineja pesuaineissa. Kirjallisuuteen pohjautuen tutkittaviksi kasveiksi valittiin kaura (Avena sativa), sokerijuurikas (Beta vulgaris) ja rohtosuopayrtti (Saponaria officinalis). Saponiinien uuttumista tutkittiin eri uuttoliuottimilla, jonka jälkeen valittiin sopivin. Raakauutteita puhdistettiin pylväskromatografisesti ja preparatiivisella korkean erotuskyvyn nestekromatografialla (HPLC). Saponiinit karakterisoitiin analysoimalla näytteet korkean resoluution ultrakorkean erotuskyvyn nestekromato- grafia-diodirividetektori-sähkösumutusionisaatio-Orbitrap-massaspektrometrilla. Mo- lekyyli-ionien tarkkoja massoja ja niistä määritettyjä molekyylikaavoja verrattiin kirjallisuudesta löytyneisiin karakterisoituihin saponiineihin. Työn eri vaiheissa saatuja näytteitä testattiin Kiillolla. Uuttotestien perusteella saponiineja tunnistettiin rohtosuopayrtistä ja sokerijuurikkaasta, jotka valittiin suuremman mittakaavan uuttoon. Raakauutteet eivät kuitenkaan pärjänneet hyvin pyykinpesutesteissä. Pylväskromatografisesti rohtosuopayrtin raakauutteesta saatiin eroteltua epäpuhtauksia jonkin verran, mutta sokerijuurikkaan raakauutteesta ei. Preparatiivisella HPLC:llä rohtosuopayrtin pylväsfraktiosta saatiin melkein puhdas saponiiniseos, mutta saanto oli alhainen. Vaahtoavuus- ja pintajännitystesteissä parhaimmat tulokset saatiin puhdistetulla saponiiniseoksella, vaikka sen pitoisuus oli alhaisin. Fraktioidun raakauutteen vaahtoavuus- ja pintajännitystestien tuloksia sekä raakauutteen tehottomuutta pesutesteissä selittävät todennäköisesti sen alhainen saponiinipitoisuus. Vaikka näytteet sisältävät saponiineja, joilla oletetaan olevan pesevä vaikutus, ne sisältävät paljon myös muita yhdisteitä, jotka häiritsevät pesureaktioita. Asiasanat: kromatografia, massaspektrometria, saponiini Sisällysluettelo 1. Johdanto… ...................................................................................................................... 1 2. Materiaalit ja menetelmät ............................................................................................. 15 2.1 Materiaalit ............................................................................................................. 15 2.1.1 Kasvimateriaalit .......................................................................................... 15 2.1.2 Reagenssit ................................................................................................... 16 2.2 Menetelmät ............................................................................................................ 16 2.2.1 Uutot ........................................................................................................... 16 2.2.2 Pylväskromatografia ................................................................................... 17 2.2.3 Preparatiivinen HPLC ................................................................................. 18 2.2.4 UPLC-DAD–ESI-Orbitrap-MS-analyysi ................................................... 19 2.2.5 Pesutestit ..................................................................................................... 20 3. Tulokset . ..................................................................................................................... 21 3.1 Uuttoliuottimen vaikutus saponiinien uuttumiseen ............................................... 21 3.2 Rohtosuopayrtin ja sokerijuurikkaan pylväskromatografinen fraktioiminen ........ 25 3.3 Rohtosuopayrtin fraktioidun raakauutteen preparatiivinen HPLC-puhdistus ....... 28 3.4 Vaahdonmuodostus-, pintajännitys- ja pyykinpesutestit ....................................... 30 3.5 Saponiinien tunnistaminen .................................................................................... 31 4. Johtopäätökset .............................................................................................................. 43 Lyhenteet API apiose apioosi ARA arabinose arabinoosi CMC critical micelle concentration kriittinen misellikonsentraatio DAD diode array detector diodirividetektori DDMP 2,3-dihydro-2,5 dihydroxy-6-mehtyl-4H-pyran-4-one 2,3-dihydro-2,5-dihydroksi-6-metyyli-4H-pyran-4oni EIC extracted ion chromatogram suodatetun ionin kromatogrammi ESI electrospray ionization sähkösumutusionisaatio FUK fucose fukoosi GAL galactose galaktoosi GLUK glucose glukoosi GLUKHA glucuronic acid glukuronihappo HPLC high-performance liquid chromatography korkean erotuskyvyn nestekromatografia IPP isopentenyl pyrophosphate isopentenyylipyrofosfaatti KSYL xylose ksyloosi KVIN quinovose kvinovoosi LC liquid chromatography nestekromatografia MS mass spectrometry massaspektrometria RAM rhamnose ramnoosi UDP uridine-5’-diphosphate uridiini-5’-difosfaatti UPLC ultra performance liquid chromatography ultrakorkean erotuskyvyn nestekromatografia UV ultraviolet ultravioletti 1 1. Johdanto Saponiinit ovat glykosideja, jotka koostuvat aglykonista ja sokeriosasta. Aglykonia kutsutaan myös geniiniksi tai sapogeniiniksi. Pooliton aglykoni ja pooliset sokerit tekevät saponiineista hyvin amfifiilisiä. Saponiinit jaetaan kolmeen eri luokkaan aglykonin pe- rusteella: triterpeeni-, steroidi-, sekä steroidialkaloidisaponiineihin. Saponiineja esiintyy erityisesti putkilokasveissa, mutta niitä on löydetty myös merieläimistä. Nimi saponiini tulee latinan kielen sanasta sapo, joka tarkoittaa saippuaa. Saponiineja sisältäviä kasveja onkin käytetty saippuoina jo satojen vuosien ajan. Useat kasvit on myös nimetty tämän käyttötarkoituksen mukaan, kuten esimerkiksi rohtosuopayrtti (Saponaria officinalis) ja kiinansaippuamarja (Sapindus mukurossi). Erityisesti Lähi-Idässä ja Aasiassa saponiini- pitoisia kasveja on käytetty myös kansanparannuksessa. (Hostettmann and Marston, 1995) Saponiinit jaetaan tyypillisesti kahteen luokkaan niiden sokeriketjujen perusteella. Monodesmosidisissa saponiineissa on yksi sokeriketju liittyneenä aglykonin C-3-hiileen eetterisidoksella. Bidesmosidisissa saponiineissa on kaksi sokeriketjua. Toinen niistä on liittynyt C-3-hiileen eetterisidoksella, ja toinen on liittynyt C-28-hiileen esterisidoksella tai C-26-hiileen eetterisidoksella (Hostettmann and Marston, 1995). Näiden lisäksi on löydetty saponiineja, joissa aglykoniin on liittynyt kolme sokeriketjua eli ne ovat trides- mosidisia (Oleszek et al., 1992). Yleisimmät saponiineissa esiintyvät sokerit ovat D- glukoosi, D-galaktoosi, D-glukuronihappo, D-galakturonihappo, L-ramnoosi, L-arabi- noosi, D-ksyloosi ja D-fukoosi. Sokerit voivat olla myös asyloituja ja ne voivat esiintyä pyranoosi- tai furanoosimuodossa. Sokeriketjut voivat olla lineaarisia tai haarautuneita. (Hostettmann and Marston, 1995) Triterpeenisaponiiniien aglykoni koostuu 30 hiilestä ja se on joko tetra- tai pentasykli- nen. Pentasykliset triterpeenit ovat 𝛽-amyriinien (olean-12-eenipohjaisia), α-amyriinien tai lupeolin johdannaisia (kuva 1). Karakterisoiduista triterpeenisaponiineista yli puolet ovat β-amyriinijohdannaisia, joista yleisin aglykoni on oleanolihappo. Triterpeenisapo- geniineille tärkeitä rakenteita ovat C-12:sta tyydyttymättömyys, C-23:n, C-28:n tai C- 30:n metyyliryhmien funktionalisointi, sekä C-2:n, C-7:n, C-11:sta, C-15:sta, C-16:sta ja C-19:sta polyhydroksylointi. Tetrasykliset triterpeenit ovat dammareenien johdannaisia. Tunnetuista triterpeenisaponiineista suurin osa on bidesmosidisia ja sokeriketjut ovat liittyneet C-3- ja C-28-hiiliin. (Hostettmann and Marston, 1995) 2 Kuva 1. Triterpeenisapogeniinien pääryhmät. Steroidisaponiinien aglykoneissa on 27 hiiltä ja useimmat niistä ovat spirostaani- tai fu- rostaanipohjaisia (kuva 2). Spirostaanissa on E- ja F-renkaiden muodostama ketospiroke- taaliryhmä. Niistä muodostuvat saponiinit ovat monodesmosidisia ja sokeriketju on liit- tynyt aglykonin C-3-hiileen. Furostaanissa F-rengas on auennut ja saponiineissa sokeri- ketjut ovat liittyneet aglykonin C-3- ja C-26-hiiliin ja ne luokitellaan bidesmosidisiksi (Hostettmann and Marston, 1995). Furostaanityyppisten steroidisaponiinien C-26-hiileen liittyneen sokerimolekyylin poistaminen johtaa kuitenkin F-renkaan spontaaniin sulkeu- tumiseen, jolloin muodostuu vastaava spirostaanityyppinen saponiini. Furostaanityyppi- siä saponiineja pidetäänkin vastaavien spirostaanityyppisten saponiinien ”kantasaponii- neina” (Kalinowska et al., 2005). Kuva 2. Yleisimmät steroidisapogeniinit. Steroidialkaloidisaponiinien aglykoneissa on 27 hiiliatomia ja yksi typpiatomi. Ne ovat joko spirosolaani- tai solanidaanipohjaisia (kuva 3). Spirosolaanisapogeniineissa typpi on sekundäärisessä asemassa ja ne ovat spirostaanien atsa-analogeja. Solanidaanisapogenii- Spirostaani Furostaani 3 neissa typpi on tertiäärisessä asemassa. Steroidialkaloidisaponiinit ovat monodesmosidi- siä ja sokeriketju on liittynyt aglykonin C-3-hiileen (Hostettmann and Marston, 1995). Steroidialkaloidiglykosidien luokitteleminen saponiineiksi ei kuitenkaan ole yksimielistä. Aglykonin sisältämän typen takia ne voidaan myös luokitella erilliseksi yhdisteryhmäksi (Vincken et al., 2007). Kuva 3. Steroidialkaloidisapogeniinit. Luonnossa esiintyvien terpenoidien prekursorina pidetään yleisesti isopentenyylipyro- fosfaattia (IPP) ja saponiinien biosynteesi alkaa skvaleenin syntetisoimisella IPP:stä. Sen jälkeen skvaleeniepoksidaasi katalysoi skvaleenin hapettumista skvaleeni-2,3-epoksidaa- siksi (Kalinowska et al., 2005). Tämä toimii sekä triterpeeni- ja steroidisapogeniinien prekursorina. Triterpeenit muodostuvat skvaleeni-2,3-epoksidaasista tuoli-tuoli-tuoli- syklisaation kautta. Eri entsyymit katalysoivat tetrasyklisen karboniumionin järjestymistä joko tetra- tai pentasyklisiksi triterpeeneiksi. Steroidisapogeniinit muodostuvat skvalee- ni-2,3-epoksidaasista tuoli-vene-tuoli-syklisaation kautta, jossa siitä muodostuu joko syk- loartenolia (kasveissa) tai lanosterolia (eläimissä ja sienissä) eri entsyymien katalysoima- na (Haralampidis et al., 2002). Nämä muuntuvat sen jälkeen kolesteroliksi, josta muo- dostuu steroideja. Steroidialkaloidit muodostuvat typpiatomin liittämisellä steroideihin (Hostettmann and Marston, 1995). Sapogeniinien biosynteesireitti on esitetty kuvassa 4. Syklisaatioreaktioiden, uudelleenjärjestymisen ja hajoamisreaktioiden takia sapoge- niinit ovat rakenteeltaan hyvin erilaisia. Lisäksi muut modifikaatiot, kuten oksidaatio- ja glykosylaatioreaktiot lisäävät niiden monimuotoisuutta. Aglykoneihin on liittynyt eri määrä erityyppisiä substituentteja, kuten hydroksyyli-, karbonyyli-, metyyli- ja karbok- syyliryhmiä. Lisäksi kaksoissidosten määrä ja paikka vaihtelevat. Yhteistä kaikille agly- koneille on kuitenkin C-3-hiileen liittynyt hydroksyyliryhmä. (Vincken et al., 2007) Spirosolaani Solanidaani 4 Kuva 4. Triterpeenien ja steroidien biosynteesi. Mukailtu kirjasta Hostettmann ja Marston, 1995. Saponiinien sokeriketjujen on yleisesti ajateltu muodostuvan niin, että ensin aglykoniin liitetään yksi sokeri. Tästä muodostuvaan tuotteeseen lisätään seuraava sokeri ja niitä lii- tetään yksi kerrallaan, kunnes yhdiste on valmis. Sokerien liittäminen tapahtuu erilaisten 5 transferaasientsyymien katalysoimana. Steroidi- ja steroidialkaloidisaponiinien glykosy- lointia on tutkittu huomattavasti enemmän kuin triterpeenisaponiinien glykosylointia (Haralampidis et al., 2002). Triterpeenisaponiineille spesifisiä entsyymejä on raportoitu vain muutamia, kun taas steroidisaponiineille spesifisiä entsyymejä on karakterisoitu lu- kuisia (Kalinowska et al., 2005). Tarhakehäkukasta (Calendula officinalis) tunnistettujen saponiinien muodostumista on tutkittu [14C] -merkkiainetutkimuksilla. Tutkimuksessa löydettiin glukuronosyylitransfe- raasi, joka katalysoi 3-O-β-D-glukuronipyranosidin (saponiini F) muodostumista oleano- lihaposta ja uridiinidifosfaatti-glukuronihaposta (UDP) (Wojciechowski, 1975). Entsyy- min havaittiin olevan spesifinen oleanolihapolle, sillä reaktiota ei tapahtunut käytettäessä vastaavia oleaniiniryhmän aglykoneja substraatteina. Tämän jälkeen 3-O-β-D-glukuroni- pyranosidista muodostui joko saponiini D galaktoosin liittyessä C-28-hiileen tai saponiini D2 C-3-sokeriketjun pidentyessä glukoosin liittymisellä. Saponiini D:n sokeriketjuja pi- dentämällä muodostui ensin saponiini B ja siitä saponiini A. Saponiini D2:sta muodostui saponiini C ja siitä saponiini A. Tarhakekäkukan saponiinien muodostuminen on esitetty kuvassa 5. Tarhakehäkukasta löydettiin myös spesifinen glukosyylitransferaasi, sillä sen akseptoriksi ei käynyt olenaolihappo ja saponiini F:n karboksyyliryhmän glukosylointi oli paljon nopeampi reaktio kuin saponiinien D tai B karboksyyliryhmien glukosylointi. (Wojciechowski, 1975) Soijapavuista tunnistettujen saponiinien muodostumista on tutkittu entsyymitutkimuk- silla (Kurosawa et al., 2002). Soijapapujen saponiinit jaetaan neljään ryhmään aglykonin perusteella: soijasapogenolit A, B, E, sekä 2,3-dihydro-2,5-dihydroksi-6-metyyli-4H- pyran-4oni (DDMP) (kuva 6). Soijapapujen saponiinit ovat erilaisia myös sokeriketjuil- taan. Kaikille soijapavuista karakterisoiduille saponiineille on kuitenkin yhteistä C-3- hiileen liittynyt glukuronihappo. Tutkimuksessa löydettiin entsyymi, joka katalysoi glu- kuronihapon liittymistä soijasapogenoli A:han, B:hen ja E:hen UDP-glukuronihapon toi- miessa sokeridonorina. Soijasapogenoli B:n havaittiin olevan paras akseptori tutkitulle entsyymille. Reaktiota ei tapahtunut, kun substraattina käytettiin muita oleaniinityyppisiä triterpeenejä tai flavonoideja. Entsyymin aktiivisuus oli alhainen, kun sokeridonorina käytettiin UDP-glukoosia tai UDP-galaktoosia. Tulosten perusteella entsyymi katalysoi spesifisesti glukuronihapon liittymistä soijasapogenoleihin. (Kurosawa et al., 2002) 6 Kuva 5. Kesätarhakukasta tunnistetut saponiinit A-F sekä niiden biosynteesi. Gluk = Glu- koosi, GlukHa = Glukuronihappo, Ksyl = Ksyloosi, Gal = Galaktoosi, UDP = Uridiinidi- fosfaatti. Mukailtu artikkelista Kalinowska et al. 2005. Steroidisaponiinien muodostuminen ei ole aivan yhtä yksiselitteistä kuin triterpeenisaponiinien. Steroidisapogeniinit muodostuvat kolesterolista peräkkäisillä hapetusreaktioilla (furostaanit) ja myöhemmin sterolisivuryhmän syklisaatiolla spiroke- taalirenkaaksi (spirostaanit). On kuitenkin esitetty, että C-26-hiilen glukosylointi tapahtuisi jo aikaisessa vaiheessa, jolloin F-renkaan muodostuminen estyisi. Bidesmosi- diset furostaanityyppiset steroidisaponiinit muodostuisivat siten furostaani-26-β-D-glu- kosidin C-3-hydroksyylin glykosylaatiolla. Vastaavat spirostaanityyppiset saponiinit muodostuisivat sen jälkeen C-26-hydroksyyliin liittyneen glukoosin entsymaattisella poistamisella, mikä johtaisi spontaaniin F-renkaan syklisaatioon. (Kalinowska et al., 2005) On myös mahdollista, että synteesi tapahtuu päinvastaisesti. Tällöin spiroketaalirengas syklisoituisi heti kolesterolin hapetusreaktioiden jälkeen (Kalinowska et al., 2005). Tämän jälkeen muodostuneen spirostaanisapogeniinin C-3-hydroksyyli glykosyloituisi, 7 Kuva 6. Triterpeenisaponiinien rakenteita. Api = Apioosi, Ara = Arabinoosi, Fuk = Fu- koosi, Gal = Galaktoosi, GlukHa = Glukuronihappo, Ksyl = Ksyloosi ja Ram = Ramnoosi ja DDMP = 2,3-dihydro-2,5-dihydroksi-6-metyyli-4H-pyran-4oni. Soijasapogenolit ja saponiinit: Kurasowa et al., 2002; Suopapuu-saponiini: Yang et al., 2013. jolloin muodostuisi monodesmosidinen spirostaanisaponiini. Tämän F-renkaan aukeami- nen ja sen C-26-hydroksyylin glykosylointi johtaisi vastaavan furostaanisaponiinin muo- dostumiseen. Entsymaattiset tutkimukset steroidisaponiinien glykosylaatiosta tukevat jäl- kimmäistä synteesireittiä. Furostaanityyppisiä steroidisaponiineja syntetisoivista kasveis- ta on löydetty spesifisiä glukosyylitransferaaseja, jotka katalysoivat spirostaanisapogenii- 8 nien glukosylaatiota. Voidaan siis olettaa, että furostaanityyppiset steroidisaponiinit muo- dostuvat spirostaanityyppisistä. (Kalinowska et al., 2005) Steroidisaponiinien mahdolli- set biosynteesireitit on esitetty kuvassa 7. Kuva 7. Steroidisaponiinien furostaani- ja spirostaanityyppien mahdolliset biosynteesi- reitit kolesterolin hapetusreaktioiden jälkeen. Gluk = Glukoosi. Mukailtu artikkelista Kalinowska et al. 2005. Furostaanisaponiinit ovat biologisesti inaktiivisia ja toimivat todennäköisesti steroidi- saponiinien varastomuotona. Kun kasvi joutuu puolustamaan itseään, furostaanisaponii- nit muuttuvat entsyymien katalysoimana spirostaanisaponiineiksi, jotka ovat hyvin myr- kyllisiä. Entsyymejä, jotka katalysoivat C-26-hydroksyylin glukoosin irtoamista, kutsu- taan glykosyylihydrolaaseksi tai glykosidaaseiksi (Kalinowska et al., 2005; Osbourn, 1996). Juuri tälle reaktiolle spesifejä glykosyylihydrolaaseja on löydetty saponiineja sisältävistä kasveista, kuten kaurasta (Avena sativa) (Gus-Mayer et al., 1994), jamssista (Dioscorera caucasica) (Gurielidze et al., 2004) ja kostuskasvista (Costus speciosus) (Inoue and Ebizuka, 1996; Inoue et al., 1996). 9 Kauran saponiinit avenakosidi A ja B (kuva 8) sijaitsevat vakuolissa (Kesselmeier and Urban, 1983), kun taas β-glukosidaasi avenokosidaasi sijaitsee kloroplastissa (Nisius, 1988). Mekaaninen rasite tai patogeenin hyökkäys kasviin aiheuttaa solukon hajoamisen ja saponiinien ja entsyymien jaottelu eri soluelimiin hajoaa. Tällöin entsyymi ja saponiinit pääsevät vuorovaikukseen toistensa kanssa. Avenakosidaasi katalysoi C-26- hiilessä olevan glukoosin irtoamista avenakosidi A:sta ja B:stä, jolloin muodostuvat mo- nodesmosidiset 26-desgluko-avenakosidi A ja B. Muodostuneet saponiinit ovat sienille myrkyllisiä (Osbourn, 1996). Avenakosidaasi on eristetty ja puhdistettu pimeässä kasva- tetuista kauran taimista ja sen on havaittu olevan spesifinen β-sokereille (Gus-Mayer et al., 1994). Kuva 8. Steroidisaponiinien rakenteita. Gluk = Glukoosi ja Ram = Ramnoosi. Lähde: Kalinowska et al., 2005. Jamssin lehdillä tehdyt värjäystutkimukset osoittavat, että furostaanityyppiset saponii- nit sijaitsevat kasvin epidermissä, kun taas niille spesifinen β-glukosidaasi sijaitsee mesofyllissä (Gurielidze et al., 2004). Entsyymi ja sille sopivat substraatit on siis jaoteltu 10 eri osiin jamssin lehdissä. Tutkimuksissa kostuskasvin (Costus speciosus) juurakoista on löydetty furostaanityppisille saponiineille spesifinen β-glukosidaasi (Inoue and Ebizuka, 1996; Inoue et al., 1996). Entsyymin aktiivisuutta testattiin kahdella steroidisaponiinilla, protograsilliinilla ja protodiossiinilla (kuva 8), sekä kolmella kaupallisella β-glukosidilla (Inoue and Ebizuka, 1996). Molemmat steroidisaponiinit olivat hyviä substraatteja, mutta toiset β-glukosidit eivät. Havaittiin myös, että spirostaanityyppinen steroidisaponiini diosgeniini inhiboi entsyymiä voimakkaasti. Tulosten perusteella tutkittu β-glukosidaasi on hyvin spesifinen entsyymi, joka tunnistaa sekä spirostaani- että furostaaniyhdisteitä ja katalysoi furostaaniglykosidien C-26-glukoosin irroittamista. Kaikki kasvit sisältävät steroliglykosyylitransferaaseja, joita tarvitaan steroidiglykosi- dien muodostumisessa (Haralampidis et al., 2002). Näiden lisäksi saponiineja sisältävistä kasveista on löydetty glykosyylitransferaaseja, jotka ovat spesifejä steroidisaponiinien muodostumiselle. Näiden entsyymien toiminta tukee näkemystä, että spirostaanisaponii- nit ovat furostaanisaponiinien biologisia prekursoreita. Tulosten perusteella voidaan myös havaita korrelaatiota kasvin tuottamien sapogeniinien ja entsyymien välillä. (Kalinowska et al., 2005) Kaurasta (Avena sativa) karakterisoitujen saponiinien avenakosidi A:n ja B:n aglykoni on pseudospirostanoli nuatigeniini ja niiden rakenteissa on haarautuneet sokeriketjut, jotka ovat liittyneet C-3-hiileen (Kalinowska et al., 2005). Steroidisaponiinien muodos- tumista kaurassa on tutkittu [14C] -merkkiainetutkimuksilla (Kalinowska and Wojciechowski, 1986; Kalinowska and Wojciechowski, 1987). Tutkimuksissa löydettiin spesifinen entsyymi, joka katalysoi glukoosin liittymistä nuatigeniiniin, jolloin muodostui nuatigeniini-3-O-β-D-glukopyranosidi. Entsyymin ei havaittu glukosyloivan nuatigeniinin C-26-hiilen hydroksyyliryhmää. Osittain puhdistetulla entsyymillä tehdyt testit osoittivat, että UDP-glukoosi toimi parhaana sokeridonorina nuatigeniinin glukosy- laatiossa (Kalinowska and Wojciechowski, 1988). Entsyymin havaittiin glukosyloivan myös muita 3-β-OH-steroidisapogeniineja, sekä joitain steroidialkaloideja. Aktiivisuutta ei kuitenkaan havaittu testatuilla 3-α-OH-steroideilla. Voidaan siis olettaa, että substraa- tin β-konfiguraatio on tärkeä entsyymin aktiivisuuden kannalta. Kahden eri parsalajikkeen (Asparagus officinalis, Asparagus plumosus) glykosyyli- transferaaseja on tutkittu [14C] -merkkiainetutkimuksilla (Paczkowski and Wojciechowski, 1988; Paczkowski et al., 1990). Molemmista kasveista on löydetty kaksi eri glykosyylitransferaasia: toinen katalysoi sitosterolin glykosylaatiota ja toinen 11 steroidisapogeniinien glykosylaatiota. Parsasta (Asparagus officinalis) löydetyn glyko- syylitransferaasin havaittiin katalysoivan parhaiten sarsasapogeniinin ja smilageniiin gly- kosylaatiota (Paczkowski and Wojciechowski, 1988). Sarsasapogeniini ja sen 25- epimeeri smilageniini ovat molemmat 5-β-H-yhdisteitä (kuva 9). Muut testatut aglykonit eivät olleet yhtä hyviä substraatteja. Olennaista entsyymin toiminnalle ovat ei-planaari- nen rakenne ja mahdollisesti myös heterosyklinen rengassysteemi. (Paczkowski and Wojciechowski, 1988). Unelmasta (Asparagus plumosus) löydetyn glykosyylitransferaa- sin havaittiin katalysoivan parhaiten yamogeniinin ja sen 25-epimeerin, diosgeniinin, gly- kosylaatiota (kuva 9) (Paczkowski et al., 1990). Muita hyviä substraatteja olivat isonua- tigeniini ja tigogeniini. Entsyymin toimimisen kannalta olennaista lienee planaarinen rakenne. Lisäksi tutkittiin, katalysoiko löydetty entsyymi bidesmosidisten saponiinien muodostumisesta. Havaittiin, että entsyymi ei katalysoinut yamogeniini-26-monogluko- sidin glykosylaatiota yamogeniini-3,26-diglukosidiksi. Tulokset tukevat näkemystä, jon- ka mukaan spirostaanisaponiinit muodostuvat ennen furostaanisaponiineja. (Paczkowski et al., 1990) Steroidialkaloidisaponiineille spesifisiä glykosyylitransferaaseja on löydetty muun muassa perunasta (Solanum tuberosum) ja tomaatin lehdistä (Lycopersicon esculentum) (Zimowski, 1994). Perunasta eristettiin ja puhdistettiin entsyymi, joka katalysoi solanidiinin (kuva 9) glukosylaatiota UDP-glukoosin läsnä ollessa. Entsyymin havaittiin katalysoivan myös tomatidiinin ja solasodiinin (kuva 9) glukosylaatiota. Reaktiota ei tapahtunut, kun substraatteina käytettiin 3-OH-steroideja, joilta puuttui rengastyppi. Testattuja yhdisteitä olivat muun muassa kolesteroli ja diosgeniini. Glykosylaatiota ei tapahtunut UDP-galaktoosin läsnä ollessa, mutta sen ei havaittu myöskään inhiboivan reaktiota. Tulosten perusteella eristetty entsyymi on hyvin spesifinen steroidialkaloideille (Stapleton et al., 1991). Tomaatin lehdistä eristettiin ja puhdistettiin entsyymi, joka katalysoi tomatidiinijohdannaisen, 3β-D-monogalaktopyranosidin, muodostumista UDP- galaktoosin läsnä ollessa. Tomatidiinin lisäksi entsyymi pystyi katalysoimaan solasodiinin glykosylaatiota, mutta solanidiini tai kolesteroli eivät käyneet substraateiksi. Kyseinen enstyymi on tomatidiinille spesifinen galaktosyylitransferaasi (Zimowski, 1994). Saponiineilla on lukuisia biologisia, fysikaalisia ja kemiallisia ominaisuuksia, johtuen niiden erilaisista ja monimuotoisista rakenteista. Biologisia ominaisuuksia ovat esi- merkiksi antibakteriaaliset, antiviraaliset, ja antikarsinogeeniset ominaisuudet. Saponiinit 12 ovat tyypillisesti maultaan kitkeriä ja ärsyttävät kurkkua ja niitä on pyritty poistamaan ruoka-aineista. (Oleszek and Hamed, 2010) Kuva 9. Steroidisapogeniinien ja steroidialkaloidisapogeniinien rakenteita. Lähde: Kalinowska et al., 2005. Amfifiilisen rakenteensa vuoksi saponiinit ovat pinta-aktiivisia aineita. Tällaisilla yhdisteillä on vaahdonmuodostus-, emulsionmuodostus- ja pesuaineominaisuuksia (Oleszek and Hamed, 2010). Pinta-aktiivisina aineina saponiinit muodostavat misellejä vesiliuoksissa, kun niiden konsentraatio ylittää kriittisen misellinmuodostuskonsentraa- 13 tion (Oakenfull, 1986). Saponiineja sisältävien kasvien raakauutteiden vaahdonmuodos- tus vaihtelee suuresti (Góral and Wojciechowski, 2020). Lisäksi on suurta eroa siinä, miten kirjallisuudessa saponiinien esiintyminen raportoidaan; joidenkin kasvien on vain mainittu sisältävän saponiineja, kun taas toisista kasveista saponiineja on karakterisoitu tarkasti. Testattaessa 45:n eri potentiaalisesti paljon saponiineja sisältävien kasvien raa- kauutteiden vaahdonmuodostusta ja pintajännitystä niiden välillä on havaittu merkittäviä eroja (Góral and Wojciechowski, 2020). Tutkimuksessa vaahdon korkeus mitattiin ajanhetkellä 0 ja sen jälkeen 10 minuutin ajan. Korkein vaahto hetkellä 0 min oli havait- tavissa seuraavilla uutteilla: kaunokaisen kukat (Bellis perennis), rohtosuopayrtin juuret (Saponaria officinalis), kultapiiskun yrtit (Solidago virgaurea) ja kvinoan siemenet (Chenopodium quinoa) (Góral and Wojciechowski, 2020). Vain kolmella näytteellä vaahdot pysyivät muuttumattomina 10 minuutin ajan. Nämä olivat rohtosuopayrtti, he- voskastanjan siemenet (Aesculus hippocastanum) ja kvinoa. Pintajännitystestissä kauran siementen (Avena sativa) uute alensi pintajännitystä eniten. Toiseksi ja kolmanneksi parhaat tulokset saatiin rohtosuopayrtin ja kvinoan uutteilla. (Góral and Wojciechowski, 2020) Saponiinien kyky muodostaa stabiileja vaahtoja riippuu myös niiden rakenteesta (Boettcher and Drusch, 2016). Kuuden eri saponiiniseoksen vaahdonmuodostustestissä havaittiin selviä eroja. Tutkimuksessa vertailtiin suopapuun kuoresta (Quillaja saponaria), harsokasvista, kamellian siemenistä (Camellia oleifera), hevoskastanjoista (Aesculus hippocastanum), lakritsikasvista (Glycyrrhiza glabra) ja okarennokin hedel- mistä (Tribulus terrestris), eristettyjä saponiiniseoksia. Näistä kaksi ensimmäistä sisältävät bidesmosidisiä triterpeenisaponiineja, kolme seuraavaa monodesmosidisiä tri- terpeenisaponiineja ja viimeinen steroidisaponiineja. Lakritsikasvin saponiinien sokerien lukumäärä on selvästi muita triterpeenisaponiineja alhaisempi. Voimakkain vaahdon- muodostus, sekä sen pysyvyys havaittiin suopapuun, harsokasvin, kamellian ja hevoskas- tanjoiden saponiineilla (Boettcher and Drusch, 2016). Lakritsikasvilla konsentraation kaksinkertaistaminen tuotti yhtä hyviä tuloksia. Okarennokin saponiinit eivät muodosta- neet vaahtoa. Tulosten perusteella saponiinien vaahdonmuodostukseen vaikuttavat niin aglykonin rakenne kuin siihen liittyneiden sokerien määrä. Triterpeenisaponiinit muodos- tavat pysyviä vaahtoja vesiliuoksissa, mutta steroidisaponiinit eivät. Sokeriketjujen määrällä ei ole suurta vaikutusta vaahdonmuodostukseen. Liittyneiden sokerien lukumää- rä vaikuttaa kuitenkin saponiinien liukoisuuteen ja siten vaahtoavuuteen. (Boettcher and Drusch, 2016) 14 Kasvin raakauutteen muodostamaan vaahtoon vaikuttavat myös kasvin osa ja kasvukauden vaihe (Góral et al., 2018). Rohtosuopayrtin raakauutteen vaahdonmuodos- tusta testattiin keräämällä sitä kasvukauden eri vaiheissa ja erottelemalla siitä juuret, lehdet, varret ja kukat. Puolet kasvimateriaaleista kuivattiin ennen uuttoa ja toinen puolet uutettiin sellaisenaan. Tuoreiden kasvimateriaalien uutteista paras vaahdonmuodostus havaittiin kukilla (Góral et al., 2018). Juuriuutteen vaahdonmuodostus oli selvästi huonoin kukinta-aikana kesäkuussa. Heinäkuussa selvästi huonoin vaahdonmuodostus havaittiin varsiuutteella. Tuoreiden kasviuutteiden vaahdonpysyvyys oli kuitenkin yleisesti heikko, poikkeuksena kukkien uute, jonka vaahto pysyi muuttumattomana tarkastelun ajan. Kuivattujen kasvimateriaalien uutteiden vaahdonmuodostuksessa ei havaittu suuria eroja kasvukauden eri vaiheissa. Vaahdonpysyvyydessä juurien uute poikkesi selvästi muista ollen paras toukokuussa ja kesäkuussa kerätyistä materiaaleista. Heinäkuun näytteistä paras vaahdonpysyvyys havaittiin kukkien uutteella. Tulosten perusteella voidaan olettaa, että rohtosuopayrtin sisältämien saponiinien pitoisuus vaihtelee eri kasvin osien välillä ja kasvukauden aikana. (Góral et al., 2018) Suopapuun (Quillaja saponaria) sisältämät ”suopapuu-saponiinit” muodostavat stabiileja emulsioita öljyn ja veden seoksissa. Ne pystyvät alentamaan pintajännitystä öljyn ja veden rajapinnalla ja muodostamaan nanokokoisia öljytippoja (Bai et al., 2016). Emulsioita pidetään kineettisesti stabiileina, kun öljytipat ovat tarpeeksi pieniä ja faasit eivät enää erotu toisistaan. Suopapuu-saponiinien muodostamia emulsioita stabiloi elektrostaattinen repulsio (Yang et al., 2013). Elektrostaattista repulsiota mitataan zeta- potentiaalilla, joka quillaja-saponiineilla on negatiivinen. Aglykonin sisältämä karbok- syyliryhmä lienee syynä negatiiviseen arvoon. Suopapuu-saponiinien muodostamien emulsioiden stabiilisuus riippuu voimakkaasti pH:sta ja ionisesta voimasta (Yang et al., 2013). Happamissa olosuhteissa karboksyyliryhmät protonoituvat, jolloin elektrostaatti- nen repulsio ei pysty pitämään tippoja erillään, mikä johtaa aggregaatioon. Kun ionista voimaa kasvatetaan (>300 mM NaCl), varaukselliset ryhmät vuorovaikuttavat ionien kanssa ja elektrostaattinen repulsio vähenee. Tämän takia emulsio muuttuu hiutalemai- seksi. (Yang et al., 2013) Rohtosuopayrtin, suopapuun ja soijapapujen saponiinit muodostavat misellejä vesi- liuoksissa (Oakenfull, 1986). Misellien kokoon vaikuttaa saponiinien rakenne. Rohtosuo- payrtin ja soijapapujen saponiinit muodostavat dimeerisiä misellejä, kun taas suopapuun saponiinit muodostavat isoja 50 molekyylin aggregaatteja. Saponiinit muodostavat misel- lejä myös sappihappojen kanssa ja myös niiden rakenne riippuu saponiinien rakenteesta. 15 Rohtosuopayrtin ja suopapuun saponiinit mudostavat säikeisiä rakenteita aglykonien pinoutuessa lomittain sappihappojen anionien kanssa. Soijapapujen saponiinit muodosta- vat löysiä rakenteita, jotka läpäisevät paljon vettä (Oakenfull, 1986). Saponiinien misel- lienmuodostukseen vaikuttaa myös lämpötila, pH ja suolan konsentraatio. Suopapuu-sa- poniinien (kuva 7) kriittiseksi misellikonsentraatioksi (CMC) on määritetty 0,5–0,8 g/L normaalilämpötilassa. Lämpötilan tai pH:n nostaminen nostaa myös cmc:ta, mutta suolan konsentraation nostaminen laskee cmc:tä. Misellien koko kasvaa voimakkaasti lämpöti- lan kasvaessa. PH:n tai suolan konsentraatio ei vaikuta misellien kokoon (Mitra and Dungan, 1997). Tämä työ tehtiin yhteistyössä Kiillon kanssa ja tarkoituksena oli selvittää kotimaisten saponiineja sisältävien kasvien käytettävyyttä pyykinpesuaineissa. Nykypäivänä kuluttajat vaikuttavat olevan yhä tietoisempia käyttämistään tuotteista ja niiden sisältämistä yhdisteistä. He haluavat ostaa tuotteita, jotka sisältävät luonnollisia raaka- aineita, kun taas luokittelemattomat pesukemikaalit eivät innosta tekemään ostopäätöstä. Lisäksi kestävä kehitys ja uusiutuvien raaka-aineiden käyttö ovat monelle kuluttajalle tärkeitä arvoja. Työssä selvittiin kirjallisuuteen pohjautuen, mitä kotimaisia kasveja voisi hyödyntää saponiinien lähteinä. Tämän jälkeen luotiin menetelmää saponiinien eristämiseksi ja puhdistamiseksi. Työn aikana eri vaiheissa saaduista näytteistä tehtiin vaahtoavuus-, pintajännitys- ja pesuainetestejä. 2. Materiaalit ja menetelmät 2.1 Materiaalit 2.1.1 Kasvimateriaalit Kirjallisuuden perusteella saponiinien lähteiksi valittiin kaura (Önning et al., 1993), rohtosuopayrtti (Hostettmann and Marston, 1995) ja sokerijuurikas (Mikołajczyk-Bator et al., 2016). Kauraa ostettiin yksityiseltä tuottajalta. Siitä eroteltiin juuret, varret, ohuet varret ja jyvät. Rohtosuopayrttiä kerättiin Turusta. Siitä eroteltiin juuret, varret ja lehdet. Sokerijuurikkaat sekä niistä sokerien erottelussa muodostunut leike saatiin Sucros oy:ltä. Juurikkaista eroteltiin juuret. Kaikki kasvimateriaalit pakastettiin ja kylmäkuivattiin. Ne jauhettiin tehosekoittimella ja hienompaa jauhetta jauhettiin kuulamyllyllä noin 1,5 ml:n verran. 16 2.1.2 Reagenssit Kasvien uutoissa käytettiin analyyttistä metanolia (VWR Chemicals, Fontenay-sous- Bois, Ranska) ja A-laatuista etanolia (Altia Oyj, Rajamäki, Suomi). Neste-nesteuutoissa käytettiin dietyylieetteriä (Sigma-Aldrich, Israel) ja butanolia (Fischer Scientific, Loughborough, U.K). Pylväskromatografiassa käytettiin eluentteina kloroformia (VWR Chemicals, Fontenay-sous-Bois, Ranska) ja analyyttistä metanolia (VWR Chemicals, Fontenay-sous-Bois, Ranska). Preparatiivisessa korkean erotuskyvyn nestekromatogra- fiassa (HPLC) käytettiin HPLC-laatuista metanolia (Honeywell, Charlotte, USA) ja 1 % muurahaishappoa (VWR Chemicals, Fontenay-sous-Bois, Ranska). Ultrakorkean erotus- kyvyn nestekromatografia-diodirividetektori-massaspektrometrilla tehdyissä analyyseissä (UPLC-DAD-MS) eluentteina käytettiin LC-MS-laatuista asetonitriiliä (Honeywell, Charlotte, USA) ja 0,1 % LC-MS-laatuista muurahaishappoa. Vesi puhdistettiin Millipore Synergy -vedenpuhdistajalla (Merck KGaA, Darmstadt, Saksa). 2.2 Menetelmät 2.2.1 Uutot Saponiinien uuttumista valituista kasveista testattiin metanolin ja etanolin vesiliuoksilla (2:8, 1:1, 8:2, 1:0, v/v) parhaimman uuttoliuottimen löytämiseksi. Kasvimateriaaleina käytettiin kauran ja rohtosuopayrtin kuulamyllyllä jauhettuja osia. Jokaisesta eri uutto- liuottimen ja kasvimateriaalin yhdistelmästä tehtiin kaksi vertailunäytettä. Kasvimate- riaaleja punnittiin 10 mg:aa eppendorf-putkiin, joihin lisättiin 1,0 ml:aa uuttoliuotinta. Näytteitä maseroitiin uuttoliuottimessa yön yli, jonka jälkeen niitä ravisteltiin tasoravis- telijassa (280 rpm) kolme tuntia. Uuttoliuotin dekantoitiin ja uuttojäännökseen lisättiin 1,0 ml:aa uuttoliuotinta. Näytteitä ravisteltiin ja uuttoliuotin dekantoitiin, kuten edellä. Uutteista haihdutettiin orgaaninen faasi ja ne kylmäkuivattiin. Kuivatut uutteet liuotettiin 1,0 ml:aan vettä ja ne analysoitiin UPLC-DAD-MS:llä (kohta 2.2.4). Sokerijuurikkaan juurien ja leikkeen uuttoa testattiin metanolin vesiliuoksella (2:8, v/v), kuten edellä. Uutteista haihdutettiin orgaaninen faasi ja ne kylmäkuivattiin. Kuivatut uutteet liuotettiin 1,0 ml:aan vettä ja ne analysoitiin UPLC-DAD-MS:llä (kohta 2.2.4). 17 Uuttoliuottimien testauksen jälkeen kasvimateriaalit uutettiin valitulla uuttoliuottimel- la. Rohtosuopayrtin uuttoa varten sen eri osat yhdistettiin. Kasvimateriaalia maseroitiin etanolin vesiliuoksessa (2:8, v/v) viikko, jonka jälkeen sitä ravisteltiin tasoravistelijassa (280 rpm) vuorokausi. Uuttoliuos dekantoitiin ja uuttojäännökseen lisättiin etanolin vesiliuosta (2:8, v/v). Uutto toistettiin viisi kertaa. Uutteista haihdutettiin orgaaninen faasi, ne kylmäkuivattiin ja punnittiin. Rohtosuopayrtin uutteet yhdistettiin, uudelleen liuotettiin veteen ja kylmäkuivattiin. Sokerijuurikkaan leikettä maseroitiin etanolin vesi- liuoksessa (2:8, v/v) neljä viikkoa. Uutto tehtiin, kuten edellä ja se toistettiin 13 kertaa. Uutteista haihdutettiin orgaaninen faasi, ne kylmäkuivattiin ja punnittiin. Sokerijuurik- kaan uutteet yhdistettiin, uudelleen liuotettiin veteen ja kylmäkuivattiin. Raakauutteiden puhdistamista neste-nesteuutolla testattiin käyttämällä rohtosuopayr- tin raakauutetta. Ensin testattiin rasvanpoistoa dietyylieetterillä. Raakauutetta punnittiin 3 × 1 mg eppendorf-putkiin. Niihin lisättiin 0,5 ml:aa vettä ja 0,5 ml:aa dietyylieetteriä. Näytteitä ravisteltiin ja eetterifaasi pipetoitiin pois. Vesifaasit analysoitiin UPLC-DAD- MS:llä (kohta 2.2.4). Seuraavaksi testattiin neste-nesteuuttoa butanolilla. Raakauutetta punnittiin 3 × 1 mg eppendorf-putkiin. Niihin lisättiin 0,5 ml:aa vettä ja 0,5 ml:aa buta- nolia. Uuttoa testattiin myös jo eetterillä uutetulla materiaalilla. Eetteriuuttojen vesifaa- seihin lisättiin 0,5 ml:aa butanolia. Näytteitä ravisteltiin ja butanolifaasi pipetoitiin pois. Vesifaasit analysoitiin UPLC-DAD-MS:llä (kohta 2.2.4). 2.2.2 Pylväskromatografia Pylväskromatografiassa stationäärifaasina käytettiin silikageeliä (Silikageeli kolonnikro- matografiaa varten, 60, Sigma-Aldrich, Sveitsi). Silikageeli valmistettiin turvottamalla jauhetta kloroformin ja metanolin liuoksessa (8:2, v/v). Geeli applikoitiin lasipylvääseen (40 × 4 cm) ja sitä tasapainotettiin kloroformin ja metanolin liuoksella (80:20, v/v). Pyl- vään läpi pumpattiin eri eluentteja 5 ml/min -virtauksella Perkin Elmer series 200 LC- pumpulla. Kerättyjen fraktioiden tilavuus oli 500 ml:aa. Rohtosuopayrtin raakauutetta punnittiin 9,00 g:aa ja se liuotettiin veteen. Liuos appli- koitiin lasipylväässä olevan silikageelin päälle. Fraktioinnissa käytetyt eluentit on esitetty taulukossa 1. Fraktiot analysoitiin UPLC-DAD-MS:llä (kohta 2.2.4). Rohtosuopayrttiuut- teen fraktiointi toistettiin kolme kertaa. Ensimmäisen fraktioinnin tulosten perusteella 18 protokollaa muutettiin ja fraktiointien 2–4 eluentit on esitetty taulukossa 2. Fraktioinneis- sa 2–4 käytettiin 9,00 g:aa raakauutetta liuotettuna veteen. Toisen fraktioinnin fraktiot analysoitiin UPLC-DAD-MS:llä. Sokerijuurikkaan raakauutetta punnittiin 7,00 g:aa ja se liuotettiin veteen. Uute ei kui- tenkaan liuennut kokonaan, vaan jäi sameaksi. Fraktiointi suoritettiin, kuten edellä (taulukko 2). Fraktiot analysoitiin UPLC-DAD-MS:llä. Fraktioista haihdutettiin orgaani- nen faasi. Valitut fraktiot yhdistettiin ja kylmäkuivattiin. Taulukko 1. Rohtosuopayrttiuutteen ensimmäisessä fraktioinnissa käytetyt eluentit ja niiden tilavuudet. fraktion nro eluentit v:v 1 CHCl3/MeOH/H2O 80:20:0 2 CHCl3/MeOH/H2O 79:26:1 3 CHCl3/MeOH/H2O 78:32:2 4 CHCl3/MeOH/H2O 77:38:3 5 CHCl3/MeOH/H2O 76:44:4 6 CHCl3/MeOH/H2O 75:50:5 7 CHCl3/MeOH/H2O 40:50:5 8 CHCl3/MeOH/H2O 0:50:5 9 CHCl3/MeOH/H2O 0:25:5 10 CHCl3/MeOH/H2O 0:0:1 Taulukko 2. Rohtosuopayrttiuutteen fraktioinneissa 2–4 sekä sokerijuurikasuutteen fraktioinnissa 1 käytetyt eluentit ja niiden tilavuudet. fraktion nro eluentit v:v 1 CHCl3/MeOH/H2O 40:50:5 2 CHCl3/MeOH/H2O 0:50:5 3 CHCl3/MeOH/H2O 0:25:5 4 CHCl3/MeOH/H2O 0:0:1 2.2.3 Preparatiivinen HPLC Rohtosuopayrtin pylväskromatografisesti puhdistettua fraktiota puhdistettiin preparatii- visella HPLC-menetelmällä. Laitteisto koostui pumpusta (Waters Delta 600 LC), injek- torista (Waters 600 controller), kolonnista, diodirividetektorista (Waters 2998 PDA) ja fraktionkerääjästä (Waters Fraction Collector Ⅲ). Käytetty kolonni oli 327 × 33 mm, käsin täytetty CiChroprep RP-18 (40–63 μm) -materiaalilla (Merck K6aA, Darmstadt, 19 Germany). Eluentin virtausnopeus oli 8,0 ml/min. Eluentteina käytettiin HPLC-laatuista metanolia (A) ja 1 % muurahaishapon vesiliuosta (B). Puhdistuksen gradientti on esitetty taulukossa 3. Fraktionkerääjällä kerättiin automaattisesti 120 fraktiota, joiden tilavuus oli 8 ml:aa. Ensin tehtiin testiajo parhaan keruuvälin selvittämiseksi. Keräämistä intensiteetin perus- teella ei voitu käyttää, sillä saponiinit eivät ole UV-aktiivisia. Valittua fraktiota punnittiin 508 mg:aa 10 ml:n lasipulloon ja liuotettiin 3 ml:aan vettä. Näyte suodatettiin 0,2 μm:n PTFE-suodattimella. Pullo ja suodatin huuhdeltiin vielä 0,5 ml:lla vettä. Fraktioista joka neljäs analysoitiin UPLC-DAD-MS:llä (kohta 2.2.4). Valittua fraktiota puhdistettiin kaksi rinnakkaista kertaa. Näytettä punnittiin kummal- lakin kerralla 806 mg:aa. Se liuotettiin 4,5 ml:aan vettä ja suodatettiin 0,2 μm:n PTFE- suodattimella. Pullo ja suodatin huuhdeltiin vielä 0,5 ml:lla vettä. Fraktiot kerättiin välillä 180–260 min. Neljännen puhdistuksen fraktioista 30–70 joka toinen analysoitiin UPLC- DAD-MS:llä. Fraktioista haihdutettiin orgaaninen faasi, valitut fraktiot yhdistettiin ja kyl- mäkuivattiin. Yhdistetyt fraktiot punnittiin ja analysoitiin UPLC-DAD-MS:llä. Taulukko 3. Preparatiivisessa HPLC-menetelmässä käytetty gradientti, A= metanoli, B=1 % muurahaishapon vesiliuos aika (min) A (%) B (%) 0 0 100 5 0 100 180 40 60 220 60 40 240 80 20 260 80 20 270 0 100 300 0 100 2.2.4 UPLC-DAD–ESI-Orbitrap-MS-analyysi Näytteet analysoitiin Acquity UPLC-DAD-laitteistolla (Waters Corp., Milford, MA, USA), johon oli yhdistetty hybridi kvadrupoli-Orbitrap-massaspektrometri (Q ExactiveTM, Thermo Fisher Scientific GmbH, Bremen, Germany). Ionisaatiomenetel- mänä käytettiin sähkösumutusionisaaatiota negatiivisella moodilla (H-ESI Ⅱ, Thermo Fischer Scientific GmbH, Bremen, Saksa). UV- ja MS-dataa kerättiin 0–16 minuutin ajan 20 m/z-alueelta 150–2000 Da ja aallonpituusalueelta 190–500 nm. Desolvaatiokaasuvirtaus oli 1000 l/h ja kartiokaasuvirtaus 100 l/h. Desolvaatiolämpötila oli 650 ℃. Kapillaarijän- nite oli 3,4 kV. Kartiojännite oli 30 V. Käytetty kolonni oli 100 mm × 2,1 mm i.d, 1,7 µm Acquity UPLC BEH C18 -kolonni (Waters Corp.). Eluentin virtausnopeus oli 0,4 ml/min. Eluentteina käytettiin asetonitriiliä (A) ja 0,1 % muurahaishapon vesiliuosta (B). Analyy- sin gradientti on esitetty taulukossa 4. Data käsiteltiin Xcalibur-ohjelmistolla (Thermo Fisher Scientific). Taulukko 4. UPLC-DAD-ESI-Orbitrap-MS-analyysissä käytetty gradientti, A=asetonitriili, B=0,1 % muurahaishapon vesiliuos. aika (min) A (%) B (%) 0 10 90 1 25 75 9 37 63 11,5 95 5 12 95 5 14 10 90 16 10 90 2.2.5 Pesutestit Kiillolle toimitettiin näytteitä työn eri vaiheissa. Uuttojen jälkeen rohtosuopayrtin raa- kauutetta toimitettiin 15 g:aa ja sokerijuurikkaan raakauutetta 4 g:aa. Pylväskromatogra- fisesti fraktioitua rohtosuopayrttiä toimitettiin 4 g:aa ja preparatiivisella HPLC-menetel- mällä puhdistettuja saponiineja noin 100 mg:aa. Näytteistä tehtiin pintajännitys-, vaah- toavuus- ja pesutestejä Kiillon protokollan mukaisesti. Vaahtoavuustestit tehtiin täyttä- mällä 100 ml:n mittalasi täyteen testattavaa liuosta ja kääntämällä sitä ylösalaisin 10 kertaa. Vaahdon korkeus mitattiin viivoittimella hetkellä 0 s, 10 s, 30 s, 60 s ja 120 s. Pintajännitys mitattiin Force Tensiometer – K6 -mittarilla. Näytteiden yhteensopivuutta pesuaineiden kanssa testattiin lisäämällä 50 g:aan pyykinpesunestettä 4 %:a näytettä. Rohtosuopayrtin ja sokerijuurikkaan raakauutteista valmistettiin 0,2 % liuokset vaah- toavuus- ja pintajännitystestejä varten. Rohtosuopayrtin raakauute liukeni veteen (20 ℃) hyvin ja melko nopeasti. Sokerijuurikkaan raakauute ei liuennut hyvin veteen pitkän sekoituksenkaan jälkeen, mikä on ollut havaittavissa muissakin työn vaiheissa. Veden lämpötilan nostamisella (30 ℃) ei ollut vaikutusta raakauutteiden liukoisuuteen. 21 Fraktioidusta raakauutteesta valmistettiin 0,1 % liuos ja puhdistetuista saponiineista 0,05 % liuos vaahtoavuus- ja pintajännitystestejä varten. Molemmat näytteet liukenivat veteen hyvin (20 ℃). 3. Tulokset 3.1 Uuttoliuottimen vaikutus saponiinien uuttumiseen Uuttoliuotinvertailussa uuttoliuottimista metanolin ja etanolin vesiliuokset (2:8, 1:1, 8:2, v/v), sekä metanoli osoittautuivat melkein yhtä tehokkaiksi (kuvat 10 ja 11). 100 % etanolin ei havaittu uuttavan saponiineja. Ensin uutoissa päätettiin käyttää metanolin vesiliuosta (2:8, v/v), koska sen havaittiin olevan hieman etanolin vesiliuosta (2:8, v/v) tehokkaampi ja saponiinien uuttamista sokerijuurikkaasta testattiin sillä. Jotta orgaanisen liuottimen määrä olisi mahdollisimman pieni, valittiin metanolin ja veden suhteeksi 2:8. Jatkossa uuttoliuottimeksi valittiin kuitenkin etanolin vesiliuos (2:8, v/v), koska kehitettäessä menetelmää kaupalliseen sovellutukseen haluttiin välttää myrkyllisiä orgaanisia liuottimia. Rohtosuopayrtin lehtien, juurien ja varsien havaittiin sisältävän runsaasti eri saponii- niyhdisteitä. Eri kasvinosissa havaittiin myös samoja yhdisteitä, joten ne päätettiin yhdistää koko kasvimateriaalin uuttoa varten. Rohtosuopayrtin raakauutteen kokonais- massa oli m = 80,16 g. Sokerijuurikkaan juurien ja leikkeen havaittiin sisältävän saponii- niyhdisteitä. Samoja yhdisteitä havaittiin molemmissa materiaaleissa ja ne yhdistettiin koko kasvimateriaalin uuttoa varten. Sokerijuurikkaan uuttojen kokonaissaanto oli m = 33,6 g. Kaurasta ei tunnistettu tunnettuja saponiineja, joten sitä ei uutettu suuremmassa mittakaavassa. Rohtosuopayrtin ja sokerijuurikkaan raakauutteiden kokonaisionikroma- togrammit on esitetty kuvissa 12 ja 13 ja niihin on merkitty niistä tunnistetut saponiinit (taulukot 6 ja 7). Rohtosuopayrtin raakauutteen ja sen neste-nesteuuttojen tuloksia vertailtiin suodatet- tujen kromatogrammien (Extracted ion chromatogram, EIC) avulla. Vertailu tehtiin raa- kauutteesta tunnistetuista saponiineista. Merkittäviä eroja ei havaittu saponiinien jakau- tumisessa veden ja dietyylieetterin tai veden ja butanolin välillä. Kuvassa 14 on esitetty raakauutteen sekä nestenesteuuttojen vesifaasien kokonaisionikromatogrammit. Epäpuh- taudet eivät olleet uuttuneet dietyylieetteriin, kuten toivottiin. Butanoliuutossa saponiinit 22 jakautuivat vesifaasiin toisin kuin oletettiin. Tulosten perusteella raakauutteen puhdistus päätettiin aloittaa pylväskromatografialla ilman esipuhdistusta nestenesteuutoilla. Kuva 10. Rohtosuopayrtin juuren metanolilla ja sen eri vesiliuoksilla tehtyjen uuttotestien kokonaisionikromatogrammit. A = 20 % metanolin vesiliuos (2:8, v/v), B = 50 % metanolin vesiliuos (1:1, v/v), C = 80 % metanolin vesiliuos (8:2, v/v) ja D = 100 % metanoli. 23 Kuva 11. Rohtosuopayrtin juuren etanolilla ja sen eri vesiliuoksilla tehtyjen uuttotestien kokonaisionikromatogrammit. A = 20 % etanolin vesiliuos (2:8, v/v), B = 50 % etanolin vesiliuos (1:1, v/v), C = 80 % etanolin vesiliuos (8:2, v/v) ja D = 100 % etanoli. 24 Kuva 12. Rohtosuopayrtin raakauutteen kokonaisionikromatogrammi (1 mg/ml). Kuvaan on merkitty siitä tunnistetut tunnetut saponiinit 1–15 (taulukko 6). Kuva 13. Sokerijuurikkaan raakauutteen kokonaisionikromatogrammi (1 mg/ml). Ku- vaan on merkitty siitä tunnistetut tunnetut saponiinit 17 ja 19–21, sekä saponiineiksi oletetut yhtisteet 16 ja 18 (taulukko 7). 25 Kuva 14. Rohtosuopayrtin nestenesteuuttojen kokonaisionikromatogrammit. A = raaka- uute (1 mg/ml), B = raakauutteen dietyylieetteriuuton vesifaasi (1 mg raakauutetta + 0,5 ml dietyylieetteriä + 0,5 ml vettä), C=raakauutteen butanoliuuton vesifaasi (1 mg raakauutetta + 0,5 ml butanolia + 0,5 ml vettä). Kuvaan on merkitty ei-halutut yhdisteet. 3.2 Rohtosuopayrtin ja sokerijuurikkaan pylväskromatografinen fraktioiminen Rohtosuopayrtin raakauutteen ensimmäisen fraktioinnin UPLC-DAD-MS-analyysien tulosten perusteella saponiineja havaittiin fraktioissa 8, 9 ja 10. Parhaiten saponiinit eluoi- tuivat fraktiossa 8. Kloroformin ei havaittu eluoivan saponiineja, joten fraktiointiproto- 26 kollaa muutettiin lyhyemmäksi niin, että vain ensimmäisessä fraktiossa käytettiin eluent- tina kloroformin, metanolin ja veden liuosta (40:50:5). Oletettiin, että saponiinit eluoitui- sivat vasta toisessa fraktiossa. Kuva 15. Rohtosuopayrtin yhdistettyjen pylväskromatografiafraktioiden kokonaisioni- kromatogrammit. A = fraktiot 1, B = fraktiot 2, C = fraktiot 3, D = fraktiot 4. Kuvaan on merkitty ei-halutut yhdisteet. Toisen fraktioinnin tulosten perusteella havaittiin kuitenkin, että saponiineja oli eluoi- tunut jonkin verran jo ensimmäiseen fraktioon. Parhaiten saponiinit eluoituivat fraktioon 27 kaksi, kuten oletettiin. Fraktiossa kolme havaittiin vielä vähäisiä määriä saponiineja, mutta fraktiossa neljä ei ollut enää saponiineja (kuva 15). Kloroformin suhde metanoliin olisi pitänyt oletettavasti olla suurempi, jotta saponiinit olisivat pidättyneet kolonnissa. Pylväskromatografialla saponiineista saatiin eroteltua ei-haluttuja yhdisteitä, mutta ei niin hyvin kuin oletettiin. Rohtosuopayrtin fraktiointien 1–4 fraktiot yhdistettiin: fraktiot 1–7 (1. fraktiointi) + fraktiot 1 (2.-4. fraktiointi), fraktio 8 (1. fraktiointi) + fraktiot 2 (2.-4. fraktiointi), fraktio 9 (1. fraktiointi) + fraktiot 3 (2.-4. fraktiointi). Yhdistettyjen metanolin vesiliuoksella (50:5, v/v) eluoitujen fraktioiden saanto oli: m = 14,04 g. Näitä fraktioita päätettiin jatko- puhdistaa preparatiivisella HPLC-menetelmällä. Sokerijuurikkaan pylväsfraktiointi ei toiminut odotetusti. Uute ei liuennut veteen, eikä veden ja metanolin liuokseen, vaan jäi sameaksi. Lisäksi se sakkasi voimakkaasti pyl- väässä. UPLC-DAD-MS-analyysien perusteella sokerijuurikkaan fraktiot 2–4 yhdistet- tiin. Kylmäkuivauksen jälkeen fraktiot punnittiin. Fraktioiden 2–4 saanto oli noin puolet lähtömateriaalista; m = 3,10 g. Saponiineista ei kuitenkaan saatu eroteltua ei-haluttuja yhdisteitä (kuva 16). Päätettiin, ettei sokerijuurikasta fraktioida enempää, eikä sitä puh- disteta preparatiivisella HPLC:llä. Kuva 16. Sokerijuurikkaan raakuutteen (A) sekä yhdistettyjen pylväskromatografiafrak- tioiden 2–4 (B) kokonaisionikromatogrammit. Kuvaan on merkitty ei-halutut yhdisteet. 28 3.3 Rohtosuopayrtin fraktioidun raakauutteen preparatiivinen HPLC- puhdistus Testipuhdistuksessa havaittiin, että saponiinit eluoituivat 210 ja 250 minuutin välillä. Tämän perusteella toisessa ja kolmannessa puhdistuksessa fraktionkerääjä asetettiin ke- räämään välillä 180–260 min, jotta saponiinit saatiin varmasti talteen. Kolmannen puh- distuksen UPLC-DAD-MS-analyysien perusteella fraktiot yhdistettiin. Jokaisen puhdis- tuksen fraktiot yhdistettiin erikseen niin, että kustakin puhdistuksesta yhdistettiin fraktiot 32–47, 48–53, 54–62 ja 63–70. Fraktiot 1–31 ja 71–80 kustakin puhdistuksesta hävitet- tiin. Kylmäkuivauksen jälkeen yhdistetyt fraktiot punnittiin ja niiden massat on esitetty taulukossa 5. Yhdistettyjen fraktioiden UPLC-DAD-MS-analyysien perusteella havaittiin, että sa- poniineista oli saatu erotettua ei-haluttuja yhdisteitä hyvin. Lisäksi havaittiin, että HPLC- menetelmällä pystyttiin erottelemaan myös saponiineja toisistaan (kuva 17). Tämän ansiosta fraktioista pystyttiin tunnistamaan myös uusia saponiineja, joita raakauutteesta ei ollut havaittu (taulukko 8). Saponiinien kokonaissaanto jäi kuitenkin hyvin alhaiseksi (n. 7 %). Taulukko 5. Preparatiivisella HPLC-menetelmällä puhdistettujen ja kylmäkuivattujen fraktioiden massat. fraktiointi (nro) fraktio (nro) massa (mg) 1 32–47 5,9 1 48–53 2,8 1 54–62 24 1 63–70 1,3 2 32–47 10,0 2 48–53 3,7 2 54–62 37,5 2 63–70 1,5 3 32–47 11,6 3 48–53 4,5 3 54–62 36,7 3 63–70 1,6 29 Kuva 17. Preparatiivisella HPLC-menetelmällä puhdistettujen, yhdistettyjen ja kylmä- kuivattujen kolmannen puhdistuksen fraktioiden kokonaisionikromatogrammit (1 mg/ml): A = fraktiot 32–47, B = fraktiot 48–53, C = fraktiot 54–62 ja D = fraktiot 63–70. Kuvaan on merkitty ei-halutut yhdisteet. 30 3.4 Vaahdonmuodostus-, pintajännitys- ja pyykinpesutestit Sokerijuurikkaan raakauutetta sisältävän näytteen vaahdonmuodostus oli heti laskeva. Rohtosuopayrtistä valmistetuista näytteistä 0,05 % puhdistettuja saponiineja sisältävän liuoksen vaahdonmuodostus oli paras. Toiseksi paras vaahdonmuodostus oli 0,2 % raa- kauutteen liuoksella ja huonoin 0,1 % fraktioidun raakauutteen liuoksella. Puhdistettuja saponiineja sisältävällä näytteellä saatiin siis parhaimmat tulokset vaahdonmuodostustes- tissä, vaikka sen pitoisuus oli alhaisin. Fraktioidun raakauutteen tulokset olivat melkein yhtä hyvät kuin raakauutteen, vaikka ensimmäisen pitoisuus oli puolet pienempi kuin jäl- kimmäisen. Vaahdonmuodostustestin tulokset on esitetty kuvassa 18. Pintajännitystestis- sä puhdistettuja saponiineja sisältävällä näytteellä saatiin parempi tulos (56,1 mN/m) kuin fraktioidulla raakauutteella (62,2 mN/m), vaikka sen pitoisuus oli puolet pienempi. Raa- kauutteella pintajännitystä ei testattu. Kuva 18. Rohtosuopayrtin raakauutteen, fraktioidun raakauutteen ja puhdistettujen sa- poniinien vaahdonmuodostus mittalasitestissä. Vaahdonkorkeus ± 0,2 cm. Näytteiden toimivuutta pesuaineissa testattiin raakauutteilla. Rohtosuopayrtin raaka- uute liukeni pyykinpesunesteeseen hyvin, mutta sokerijuurikkaan raakauute sakkasi voi- makkaasti. Näiden seosten sekä pelkän pyykinpesunesteen vaahdonmuodostusta testattiin 30 ℃:ssa vedessä. Havaittiin, että pelkän pyykinpesunesteen vaahdonmuodostus oli 0 1 2 3 4 5 6 0 10 30 60 120 v aa h d o n m u o d o st u s (c m ) aika (s) 0,2 % raakauute 0,1 % fraktioitu raakauute 0,05 % puhdistettujen saponiinien näyte 31 paras. Raakauutteita sisältävistä liuoksista parempi vaahdonmuodostus oli rohtosuopayr- tin raakauutetta sisältävällä näytteellä. Varsinaisessa pyykinpesutestissä raakauutteita si- sältävillä pesuaineilla ei saatu hyviä tuloksia. Pelkkä hanavesikin pesi joissain tapauksissa tehokkaammin. Rohtosuopayrtin raakauutetta sisältävä pesuaine oli tehokkaampi kuin so- kerijuurikkaan raakauutetta sisältävä pesuaine. Vaahdonmuodostus- ja pintajännitystestien tulokset antavat olettaa, että puhdistettu- jen saponiinien pesuteho olisi testatuista näytteistä paras. Saponiinien alhainen kokonais- saanto (7 %) preparatiivisessa HPLC-puhdistuksessa viittaa siihen, että saponiinien pitoi- suus rohtosuopayrtin raakauutteessakin on alhainen. Alhainen saponiinipitoisuus selittää myös fraktioidun raakauutteen vaahtoavuus- ja pintajännitystestien tuloksia sekä raaka- uutteen tehottomuutta pesutesteissä. Vaikka näytteet sisältävät saponiineja, joilla olete- taan olevan pesevä vaikutus, ne sisältävät paljon myös muita yhdisteitä, jotka häiritsevät pesureaktioita. 3.5 Saponiinien tunnistaminen Saponiinit tunnistettiin alustavasti kasvimateriaaleista uuttotestien UPLC-DAD-MS-mit- tauksista saatujen tarkkojen massojen avulla. Ionien massojen avulla laskettiin yhdisteiden tarkka massa ja ennustettiin niiden molekyylikaava. Massoja ja molekyyli- kaavoja verrattiin kirjallisuudesta löytyneisiin karakterisoituihin saponiineihin. Saponii- nit tunnistettiin tarkemmin raakauutteista ja preparatiivisella HPLC-menetelmällä puh- distetuista fraktioista. Tunnistettujen saponiinien rakenteet on esitetty kuvissa 19–23. Rohtosuopayrtin raakauutteesta tunnistettiin yhteensä 15 tunnettua saponiinia. Kaikki tunnistetut saponiinit ovat bidesmosidisiä triterpeenisaponiineja. Tunnistetut saponiinit ovat saponiini 2 (1) (Moniuszko-Szajwaj et al., 2013), saponiini 1 (2) (Lu et al., 2015), saponariosidi F/I (3) (Jia et al., 1999; Koike et al., 1999), saponiini 6 (4) (Lu et al., 2015), saponariosidi C/D (Jia et al., 1999) (5), saponariosidi F/I (6) (Jia et al., 1999; Koike et al., 1999), saponariosidi C/D (7), saponiini 12 (8) (Lu et al., 2015), saponiini 4 (9), saponiini 5 (10) (Moniuszko-Szajwaj et al., 2016), saponiini 11 (11) (Lu et al., 2015), saponiini 1 (12) (Moniuszko-Szajwaj et al., 2016), saponariosidi A (13) (Jia et al., 1998), saponariosidi B/saponiini 13/saponiini 3 (14) (Jia et al., 1998; Lu et al., 2015; Moniuszko- Szajwaj et al., 2016), saponiini 2 (15) (Moniuszko-Szajwaj et al., 2016). Saponariosidi 32 B:tä, saponiini 13:a ja saponiini 3:a ei pystytty erottelemaan toisistaan, sillä niillä kaikilla on sama molekyylikaava. Saponariosidi C:llä ja D:llä, sekä F:llä ja I:llä on keskenään sama molekyylikaava, joten niitä ei pystytty erottelemaan toisistaan. Niitä vastaavat mo- lekyyli-ionit havaittiin kuitenkin selvästi kahdella eri retentioajalla, joten voitiin olettaa, että molemmat yhdisteet löytyvät raakauutteesta. Taulukossa 6 on esitetty rohtosuopayr- tin raakauutteesta tunnistetut tunnetut saponiinit. Kuva 19. Rohtosuopayrtin raakauutteesta tunnistettujen saponiinien 2, 4 ja 8–15 rakenteet. Yhdisteellä 14 on useampi mahdollinen rakenne: a = Jia et al., 1998, b = Lu et al., 2015, c = Moniuszko-szajwaj et al., 2016. aset. = asetyyli, Fuk = Fukoosi, Gal = Ga- laktoosi, Gluk = Glukoosi, GlukHa = Glukuronihappo, Ksyl = Ksyloosi, Ram = Ramnoosi ja Kvin = Kvinovoosi. 33 Sokerijuurikkaan raakauutteesta tunnistettiin yhteensä neljä tunnettua saponiinia, sekä kaksi saponiinia, joita ei ole kirjallisuuden mukaan karakterisoitu tarkasti. Kaikki tunnistetut yhdisteet ovat triterpeenisaponiineja. Tunnistetut saponiinit ovat betavulgarosidi 6 (17), betavulgarosidi 8 (19), betavulgarosidi 1 (20) ja betavulgarosidi 3 (21) (Mikołajczyk-Bator et al., 2016). Kaksi muuta saponiinia on karakterisoitu diokso- laani-heksoosi-uronihappo-hederageniiniksi (16) ja dioksolaani-heksoosi-C4H8O4-uro- nihappo-hederageniiniksi (18) (Mikołajczyk-Bator et al., 2016). Taulukossa 7 on esitetty sokerijuurikkaan raakauutteesta alustavasti tunnistetut tunnetut saponiinit sekä saponii- neiksi oletetut yhdisteet. Kuva 20. Rohtosuopayrtin raakauutteesta tunnistettujen saponiinien 1, 3 ja 5–7 rakenteet. Yhdisteillä 3, 5, 6 ja 7 on kaksi mahdollista rakennetta: a = Jia et al., 1999, b = Koike et al., 1999. Gal = Galaktoosi, Gluk = Glukoosi ja Ksyl = Ksyloosi. Preparatiivisella HPLC-menetelmällä puhdistetuista rohtosuopayrtin fraktioista tun- nistettiin samat 15 saponiinia kuin raakauutteestakin. Lisäksi tunnistettiin 11 uutta tun- nettua saponiinia. Tunnistetuista saponiineista bidesmosidisiä triterpeenejä oli kahdeksan ja monodesmosidisiä triterpeenejä kolme. Tunnistetut saponiinit ovat saponariosidi E (Jia et al., 1998), saponariosidi L tai M (Koike et al., 1999), saponiini 3, saponiini 4, saponiini 34 5 tai 8, saponiini 7, saponiini 10 (Lu et al., 2015), saponiini 3 (Moniuszko-Szajwaj et al., 2013), vakkarosidi A, vakkarosidi B ja vakkarosidi D (Koike et al., 1998). Saponariosidi L:llä ja M:llä on sama molekyylikaava, minkä vuoksi yhdistettä ei pystytty tunnistamaan tarkemmin. Vakkarosidi A:lla ja D:llä on myös sama molekyylikaava, mutta niitä vastaavat molekyyli-ionit havaittiin eri retentioajoilla, joten molempien yhdisteiden voitiin olettaa löytyvän. Taulukossa 8 on esitetty HPLC-fraktioista tunnistetut tunnetut saponiinit. Kuva 21. Sokerijuurikkaan raakauutteesta tunnistettujen saponiinien 17 ja 19–21 raken- teet. Gluk = Glukoosi ja GlukHa = Glukuronihappo. 35 Kuva 22. Preparatiivisella HPLC-menetelmällä kolmannella kerralla puhdistetuista frak- tioista tunnistettujen saponiinien rakenteita. Gluk = Glukoosi HMG = 3-hydroksyyli-3- metyyliglutaroyyli ja Ksyl = Ksyloosi. a = Jia et al., 1999, b = Koike et al., 1999, c = Moniuszko-Szajwaj et al., 2013 ja d = Koike et al., 1998. 36 Kuva 23. Preparatiivisella HPLC-menetelmällä kolmannella kerralla puhdistetuista frak- tioista tunnistettujen saponiinien rakenteita. aset. = asetyyli, Fuk = Fukoosi, Gal = Galak- toosi, Gluk = Glukoosi, GlukHa = Glukuronihappo, Ksyl = Ksyloosi ja Ram = Ramnoosi. a = Lu et al., 2015. 37 Taulukko 6. Rohtosuopayrtin raakauutteesta tunnistetut saponiinit 1–15 sekä niiden retentioajat, molekyylikaavat ja UPLC-DAD-MS-mittauksista saatu MS-data. nro yhdiste retentioaika (min) molekyyli- kaava [M‒H]‒ muut m/z-arvot havaittu tarkka massa laskettu tarkka massa virhe (ppm) viitteet 1 Saponiini 2 2,58 C65H104O35 1443,6315 744,31484 (M+46–2H)2-; 721,31191 (M–2H)- 1444,6387 1444,6362 -1,7804 Moniuszko-Szajwaj et al., 2013 2 Saponiini 1 2,99 C70H110O37 1541,6670 793,33318 (M+46–2H)2-; 770,32920 (M–2H)2- 1542,6743 1542,6730 -0,8634 Lu et al., 2015 3 Saponariosidi F/I 2,99 C59H94O30 1281,5765 663,28838 (M+46–2H)2-; 640,28552 (M–2H)2-; 445,24494 (C22H37O9); 583,21954 1282,5838 1282,5833 -0,3797 Jia et al., 1999, Koike et al., 1999 4 Saponiini 6 3,31 C78H122O43 1745,7299 1149,53422; 895,36454 (M+46–2H)2-; 872,36073 (M–2H)2- 1746,7371 1746,7364 -0,4076 Lu et al., 2015 5 Saponariosidi C/D 3,96 C59H94O29 1265,5810 655,29065 (M+46–2H)2-; 632,28732 (M–2H)2-; 575,19719; 529,19136 1266,5883 1266,5884 0,0853 Jia et al., 1999 6 Saponariosidi F/I 4,2 C59H94O30 1281,5761 1119,52380 (M–162)-; 1165,53007 (M–162+46)- ; 663,28831 (M+46–2H)2- 1282,5834 1282,5833 -0,0912 Jia et al., 1999, Koike et al., 1999 7 Saponariosidi C/D 5,16 C59H94O29 1265,5783 655,28949 (M+46–2H)2-; 632,28660 (M–2H)2- 1266,5856 1266,5884 2,1933 Jia et al., 1999 8 Saponiini 12 7,69 C75H118O40 1657,7130 955,5465; 851,35638 (M+46–2H)2-; 828,35295 (M-2H)2-; 706,41472; 660,40908 1658,7203 1658,7200 -0,1791 Lu et al., 2015 9 Saponiini 4 8,04 C78H122O42 1729,7349 887,36707 (M+46–2H)2-; 864,36327 (M–2H)2-; 682,35803 1730,7422 1730,7415 -0,3796 Moniuszko-Szajwaj et al., 2016 38 10 Saponiini 5 8,73 C80H124O43 1771,7458 908,37285 (M+46–2H)2-; 885,36931 (M–2H)2- 1772,7530 1772,7521 -0,5427 Moniuszko-Szajwaj et al., 2016 11 Saponiini 11 9,99 C72H112O27 1567,6813 806,34053 (M+46–2H)2-; 783,33733 (M–2H)2-; 663,33982 1568,6885 1568,6886 0,0561 Lu et al., 2015 12 Saponiini 1 10,02 C83H130O46 1861,7738 953,38690 (M+46–2H)2-; 930,38451 (M–2H)2- 1862,7811 1862,7838 1,4672 Moniuszko-Szajwaj et al., 2016 13 Saponariosidi A 10,06 C82H128O45 1831,7638 938,38173 (M+46–2H)2-; 915,37876 (M–2H)2- 1832,7710 1832,7732 1,1884 Jia et al., 1998 14 Saponariosidi B/ Saponiini 13/ Saponiini 3 10,06 C77H12O41 1669,7208 872,36078 (M+46–2H)2-; 849,35704 (M–2H)2- 1700,7281 1700,7309 1,6511 Jia et al., 1998, Lu et al., 2015, Moniuszko-Szajwaj et al., 2016 15 Saponiini 2 10,11 C85H132O47 1903,7832 974,39246 (M+46–2H)2-; 951,38843 (M–2H)2- 1904,7907 1904,7944 1,9467 Moniuszko-Szajwaj et al., 2016 Taulukko 7. Sokerijuurikkaan raakauutteesta tunnistetut saponiinit 17 ja 19–21, saponiineiksi oletetut yhdisteet 16 ja 18 sekä niiden retentioajat, molekyylikaavat ja UPLC-DAD-MS-mittauksista saatu MS-data. nro yhdiste retentioaika (min) molekyyli- kaava [M–H]– muut m/z-arvot havaittu tarkka massa laskettu tarkka massa virhe (ppm) viitteet 16 Dioks-Heks- UrHa- hederageniini 4,58 C47H70O21 969,4327 507,21524 (M+46–2H)2-; 556,67418 970,4399 970,4426 2,7147 Mikołajczyk-Bator et al., 2016 17 Betavulgarosidi 6 4,87 C47H72O22 971,4492 508,22342 (M+46–2H)2-; 809,43277; 557,68223; 449.27571 972,4565 972,4568 0,3625 Mikołajczyk-Bator et al., 2016 16 Dioks-Heks- UrHa- hederageniini 5,16 C47H70O21 969,433 507,21528 (M+46–2H)2-; 941,43867; 449,27577; 327,21758 970,4402 970,4426 2,4056 Mikołajczyk-Bator et al., 2016 39 16 Dioks-Heks- UrHa- hederageniini 5,55 C47H70O21 969,4337 507,21590 (M+46–2H)2-; 807,41755; 556,67448; 449,27578; 327,21772 970,4409 970,4426 1,6843 Mikołajczyk-Bator et al., 2016 18 Dioks-Heks- C4H8O4-UrHa- hederageniini 6,24–6,56 C46H66O20 937,4079 659,47439; 329,23311 938,4152 938,4150 -0,2904 Mikołajczyk-Bator et al., 2016 19 Betavulgarosidi 8 6,79 C46H68O20 939,4237 492,21093 (M+46–2H)2-; 777,40717; 659,47460; 492,21092; 329.23332 940,4310 940,4306 -0,4067 Mikołajczyk-Bator et al., 2016 20 Betavulgarosidi 1 8,09 C47H70O20 953,4390 499,21918 (M+46–2H)2-; 548,67775; 327,21796 954,4463 954,4463 -0,0236 Mikołajczyk-Bator et al., 2016 21 Betavulgarosidi 3 8,71 C47H72O20 955,4544 500,22666 (M+46–2H)2-; 793,43932; 679,40742; 329,23365 956,4617 956,4619 0,2379 Mikołajczyk-Bator et al., 2016 Taulukko 8. Preparatiivisella HPLC-menetelmällä kolmannella kerralla puhdistetuista fraktioista tunnistetut yhdisteet sekä niiden retentioajat, molekyylikaavat ja UPLC-DAD-MS-mittauksista saatu MS-data. 3.1 = fraktiot 32–47, 3.2 = fraktiot 48–53, 3.3 = fraktiot 54–62, 3.4 = fraktiot 63–70. fraktio yhdiste retentioaika (min) molekyyli- kaava [M–H] muut m/z-arvot havaittu tarkka massa laskettu tarkka massa virhe (ppm) viitteet 3.1 Saponiini 7 2,34 C81H128O46 1835,7556 940,37793 (M+46–2H)2-; 917,37555 (M–2H)2- 1836,7629 1836,7682 2,8599 Lu et al., 2015 3.1 Saponiini 5/8 2,38 C76H120O42 1703,7151 874,35743 (M+46–2H)2-; 851,35386 (M–2H)2- 1704,7224 1704,7259 2,0138 Lu et al., 2015 3.1 Saponariosidi F/I 2,92 C59H94O30 1281,5729 663,28680 (M+46–2H)2- 1282,5802 1282,5833 2,4193 Jia et al., 1999, Koike et al., 1999 3.1 Saponiini 3 2,92 C75H118O41 1673,7058 859,35193 (M+46–2H)2-; 836,34881 (M–2H)2- 1674,7131 1674,7153 1,3065 Lu et al., 2015 3.1 Saponariosidi F/I 2,99 C59H94O30 1281,5727 663,28669 (M+46–2H)2- 1282,5800 1282,5833 2,5987 Jia et al., 1999, 40 Koike et al., 1999 3.1 Saponiini 1 2,99 C70H110O37 1541,6639 793,33153 (M+46–2H)2-; 770,32731 (M–2H)2- 1542,6712 1542,6730 1,1785 Lu et al., 2015 3.1 Saponiini 6 3,15 C78H122O43 1745,7251 895,36254 (M+46–2H)2-; 872,35954 (M–2H)- 1746,7324 1746,7364 2,3232 Lu et al., 2015 3.1 Saponiini 6 3,32 C78H122O43 1745,7256 895,36317 (M+46–2H)2-; 872,35956 (M–2H)- 1746,7328 1746,7364 2,0598 Lu et al., 2015 3.1 Saponiini 4 5,42 C77H120O42 1715,7181 880,35924 (M+46–2H)2-; 857,35487 (M–2H)2- 1716,7254 1716,7259 0,2872 Lu et al., 2015 3.2 Saponiini 2 2,57 C65H104O35 1443,6248 744,31245 (M+46–2H)2-; 721,30984 1444,6321 1444,6362 2,8506 Moniuszko-Szajwaj et al., 2013 3.2 Saponariosidi F/I 3,05 C59H94O30 1281,5716 663,28600 (M+46–2H)2-; 640,28334 1282,5789 1282,5833 3,4407 Jia et al., 1999, Koike et al., 1999 3.2 Saponariosidi C/D 3,98 C59H94O29 1265,7556 655,28883 (M+46–2H)2-; 632,28571 (M–2H)2-; 1085,51523; 617,36906 1266,5849 1266,5884 2,7381 Jia et al., 1999 3.2 Saponariosidi F/I 4,19 C59H94O30 1281,5716 663,28642 (M+46–2H)2- 1282,5789 1282,5833 3,4563 Jia et al., 1999, Koike et al., 1999 3.2 Saponariosidi E 4,69 C60H96O30 1295,5893 670,29464 (M+46–2H)2-; 647,29247 (M–2H)2- 1296,5953 1296,5990 2,7865 Jia et al., 1999 3.2 Vakkarosidi A/D 5,02 C54H85O25 1133,5367 1134,5440 1134,5461 1,8580 Koike et al., 1998 3.2 Saponiini 4 5,42 C77H120O42 1715,7169 880,35842 (M+46–2H)2-; 857,35435 (M–2H)2- 1716,7242 1716,7259 0,9571 Lu et al., 2015 3.3 Saponariosidi C/D 3,97 C59H94O29 1265,5769 655,28821 (M+46–2H)2-; 632,28546 (M–2H)2-; 1898,86729 (3M–2H)2- 1266,5842 1266,5884 3,3223 Jia et al., 1999 3.3 Saponariosidi C/D 5,15 C59H94O29 1265,5765 655,28904 (M+46–2H)2-, 1898,86726 (3M–2H)2- 1266,5838 1266,5884 3,6302 Jia et al., 1999 3.3 Saponariosidi L/M 5,46 C53H84O24 1103,5261 1655,79253 (3M–2H)2-; 1149,53110 (M+46–H)-; 574,26269 (M+46–2H)2- 1104,5334 1104,5355 1,9130 Koike et al., 1999 41 3.3 Saponiini 3 6,26 C59H92O28 1247,5672 623,28085 (M–2H)2- 1248,5744 1248,5778 2,7015 Moniuszko-Szajwaj et al., 2013 3.3 Vakkarosidi A/D 6,75 C54H85O25 1133,5365 1700,80878 (3M–2H)2-; 1179,54133 (M+46–H)- 1134,5438 1134,5461 2,0255 Koike et al., 1998 3.3 Saponiini 4 7,12 C78H122O42 1729,7307 887,36531 (M+46–3H)2-; 864,36209 (M–2H)2- 1730,7380 1730,7415 2,0471 Moniuszko-Szajwaj et al., 2016 3.3 Saponiini 10 7,55 C70H110O36 1525,6672 785,33372 (M+46–2H)2-; 762,33016 (M–2H)2- 1526,6745 1526,6781 2,3207 Lu et al., 2015 3.3 Saponiini 10 7,7 C70H110O36 1525,6679 785,33384 (M+46–2H)2-; 762,33021 (M–2H)2- 1526,6752 1526,6781 1,8950 Lu et al., 2015 3.3 Saponiini 12 7,7 C75H118O40 1657,7099 851,35466 (M+46–2H)2-; 828,35169 (M–2H)2- 1658,7172 1658,7204 1,9069 Lu et al., 2015 3.3 Vakkarosidi B 7,7 C60H94O29 1277,5781 638,28635 (M–2H)2- 1278,5853 1278,5884 2,3682 Koike et al., 1998 3.3 Saponiini 4 8,03 C78H122O42 1729,7317 887,36573 (M+46–2H)2-; 864,36206 (M–2H)2- 1730,7390 1730,7415 1,4635 Moniuszko-Szajwaj et al., 2016 3.3 Saponiini 10 8,46 C70H110O36 1525,6671 785,33359 (M+46–2H)2-; 762,32986 (M–2H)2- 1526,6744 1526,6781 2,4059 Lu et al., 2015 3.3 Saponiini 5 8,73 C80H124O43 1771,7480 908,37081 (M+46–2H)2-; 885,36882 (M–2H)2- 1772,7553 1772,7521 -1,8119 Moniuszko-Szajwaj et al., 2016 3.3 Saponiini 12 8,73 C75H118O40 1657,7104 851,35558 (M+46–2H)2-; 828,35179 (M–2H)2- 1658,7176 1658,7204 1,6296 Lu et al., 2015 3.3 Saponiini 11 9,99 C72H112O37 1567,6781 806,33918 (M+46–2H)2-; 783,33570 (M-2H)2- 1568,6854 1568,6886 2,0514 Lu et al., 2015 3.3 Saponiini 1 10,03 C83H130O46 1861,7719 953,38634 (M+46–2H)2-; 930,38316 (M–2H)2- 1862,7792 1862,7838 2,4818 Moniuszko-Szajwaj et al., 2016 3.3 Saponariosidi A 10,08 C82H128O45 1831,7616 938,38146 (M+46–2H)2-; 915,37856 (M–2H)2- 1832,7689 1832,7732 2,3615 Jia et al., 1998 3.3 Saponariosidi B/ Saponiini 13/ Saponiini 3 10,08 C77H120O41 1699,7271 872,36059 (M+46–2H)2-; 849,35661 (M–2H)2- 1700,7344 1700,7309 -2,0238 Jia et al., 1998, Lu et al., 2015, Moniuszko-Szajwaj et al., 2016 42 3.3 Saponiini 2 10,12 C85H132O47 1903,7820 974,39200 (M+46–2H)2-; 951,38793 (M–2H)2- 1904,7892 1904,7944 2,7027 Moniuszko-Szajwaj et al., 2016 3.4 Saponariosidi C/D 5,14 C59H94O29 1265,5772 655,28881 (M+46–2H)2-; 632,26650 (M–2H)2- 1266,5845 1266,5884 3,0776 Jia et al., 1999 3.4 Vakkarosidi A/D 6,72 C54H85O25 1133,5362 1179,54091 (M+46–H)-; 1700,80821 (3M–2H)2- 1134,5434 1134,5461 2,3252 Koike et al., 1998 3.4 Saponiini 10 7,69 C70H110O36 1525,6674 785,33353 (M+46–2H)2-; 762,32992 (M–2H)2- 1526,6747 1526,6781 2,1897 Lu et al., 2015 3.4 Saponiini 12 7,69 C75H118O40 1657,7092 851,35401 (M+46–2H)2-; 828,35107 (M–2H)2- 1658,7165 1658,7204 2,3169 Lu et al., 2015 3.4 Vakkarosidi B 7,69 C60H94O29 1277,5767 638,28601 (M–2H)2- 1278,5839 1278,5884 3,4710 Koike et al., 1997 3.4 Saponiini 4 8,0 C78H122O42 1729,7311 887,36540 (M+46–2H)2-; 864,36171 (M–2H)2- 1730,7384 1730,7415 1,8102 Moniuszko-Szajwaj et al., 2016 3.4 Saponiini 5 8,72 C80H124O43 1771,7411 908,37063 (M+46–2H)2-; 885,36753 (M–2H)2- 1772,7484 1772,7521 2,0804 Moniuszko-Szajwaj et al., 2016 3.4 Saponariosidi A 10,07 C82H128O45 1831,7609 938,38115 (M+46–2H)2-; 915,37836 (M–2H)2- 1832,7681 1832,7732 2,7761 Jia et al., 1998 3.4 Saponariosidi B/ Saponiini 13/ Saponiini 3 10,07 C77H120O41 1699,7192 872,36025 (M+46–2H)2-; 849,35671 (M–2H)2- 1700,7264 1700,7309 2,6389 Jia et al., 1998, Lu et al., 2015, Moniuszko-Szajwaj et al., 2016 3.4 Saponiini 2 10,12 C85H132O47 1903,7813 974,39140 (M+46–2H)2-; 951,38725 (M–2H)2- 1904,7886 1904,7944 3,0387 Moniuszko-Szajwaj et al., 2016 3.4 Quillajahappo/ Gypsogeenihappo 11,01 C30H45O5 485,3266 971,66111 (2M–H)- 486,3338 486,3345 1,4352 43 4. Johtopäätökset Työ oli hyvin mielenkiintoinen, sillä tämä on tietääksemme ensimmäinen saponiineja tutkiva työ Suomessa. Kasvien ja niiden sisältämien yhdisteiden hyödyntäminen kulutus- tuotteissa on myös hyvin ajankohtaista. Työssä onnistuttiin eristämään ja tunnistamaan saponiineja rohtosuopayrtistä ja sokerijuurikkaasta. Saponiinien pitoisuus uutteissa jäi kuitenkin alhaiseksi. Erilaisen uuttomenetelmän käyttö voisi parantaa saantoa. Saponii- nien erotteleminen rohtosuopayrtistä onnistui hyvin, mutta sokerijuurikkaasta ei. On mahdollista, että sokerijuurikkaan leike sisältää sokerinerotusprosessin jälkeen liukene- mattomia yhdisteitä, jotka aiheuttavat sakkaamista pylväskromatografiassa ja häiritsevät fraktioitumista. Lisäksi suurempi kloroformin osuus ensimmäisessä fraktiossa voisi tehostaa ei-haluttujen yhdisteiden erottumista saponiineista. Vaahtoavuus- ja pintajännitystestien tulokset ovat yhteneväisiä tutkimuksen kanssa, jossa on havaittu rohtosuopayrtin raakauutteen muodostavan stabiilimpia vaahtoja ja alentavan pintajännitystä paremmin kuin sokerijuurikkaan raakauute (Góral and Wojciechowski, 2020). Pyykinpesutesteissä raakauutteet osoittautuivat tehottomiksi, minkä voidaan olettaa johtuvan niiden sisältämistä muista pesureaktioita häiritsevistä yhdisteistä. Pyykinpesutestit puhdistetuilla saponiineilla antaisivat todellisempaa tulosta saponiinien pesutehosta. Tätä varten uuttoa ja pylväsfraktiointia olisi tehostettava saannon parantamiseksi. Lisäksi vaahdonmuodostus- ja pintajännitystestejä pitäisi toistaa tulosten luotettavuuden takaamiseksi. 44 Lähdeluettelo Bai, L.; Huan, S.; Gu, J.; McClements, D. J. Fabrication of oil-in-water nanoemulsions by dual-channel microfluidization using natural emulsifiers: Saponins, phospholipids, proteins, and polysaccharides. Food Hydrocoll. 2016, 61, 703– 711. Boettcher, S.; Drusch, S. Interfacial Properties of Saponin Extracts and Their Impact on Foam Characteristics. Food Biophys. 2016, 11, 91– 100. Góral, I.; Jurek, I.; Wojciechowski, K. How Does the Surface Activity of Soapwort (Saponaria officinalis L.) Extracts Depend on the Plant Organ? Journal of Surfactants and Detergents, 2018, 21, 797– 807. Góral, I.; Wojciechowski, K. Surface activity and foaming properties of saponin-rich plants extracts. Adv. Colloid Interface Sci. 2020, 279, 102145. Gurielidze, K.; Gogoberidze, M.; Dadeshidze, I.; Vardosanidze, M.; Djaoshvili, M.; Lomkatsi, N. Tissue and subcellular localization of oligofurostanosides and their specific degrading β-glucosidase in Dioscorea caucasica Lipsky. Phytochemistry, 2004, 65, 555– 559. Gus-Mayer, S.; Brunner, H.; Schneider-Poetsch, H.; Rüdiger, W. Avenacosidase from oat: purification, sequence analysis and biochemical characterization of a new member of the BGA family of β-glucosidases. Plant Mol. Biol. 1994, 26, 909– 921. Haralampidis, K.; Trojanowska, M.; Osbourn, A. E. Biosynthesis of triterpenoid saponins in plants. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 2002, 75, 31– 49. Hostettmann, K.; Marston, A. Saponins; Chemistry and Pharmacology of Natural Products; Cambridge University Press: Great Britain, 1995, 1– 548. Inoue, K.; Ebizuka, Y. Purification and characterization of furostanol glycoside 26-O-β- glucosidase from Costus speciosus rhizomes. FEBS Lett. 1996, 378, 157– 160. Inoue, K.; Shimomura, K.; Kobayashi, S.; Sankawa, U.; Ebizuka, Y. Conversion of furostanol glycoside to spirostanol glycoside by β-glucosidase in Costus speciosus. Phytochemistry, 1996, 41, 725-727. Jia, Z.; Koike, K.; Nikaido, T. Major triterpenoid saponins from Saponaria officinalis. J. Nat. Prod. 1998, 61, 1368– 1373. Jia, Z.; Koike, K.; Nikaido, T. Saponarioside C, the first α-D-galactose containing triterpenoid saponin, and five related compounds from Saponaria officinalis. J. Nat. Prod. 1999, 62, 449– 453. Kalinowska, M.; Wojciechowski, Z. A. Enzymatic synthesis of nuatigenin 3β-D-glucoside in oat (Avena sativa) leaves. Phytochemistry, 1986, 25, 2525– 2529. Kalinowska, M.; Wojciechowski, Z. A. Subcellular localization of udpg: Nuatigenin glucosyltransferase in oat leaves. Phytochemistry, 1987, 26, 353– 357. Kalinowska, M.; Wojciechowski, Z. A. Substrate specificity of partially purified UDP- glucose: nuatigenin glucosyltransferase from oat leaves. Plant Science, 1988, 55, 239– 245. 45 Kalinowska, M.; Zimowski, J.; Pączkowski, C.; Wojciechowski, Z. A. The formation of sugar chains in triterpenoid saponins and glycoalkaloids. Phytochemistry Reviews, 2005, 4, 237– 257. Kesselmeier, J.; Urban, B. Subcellular localization of saponins in green and etiolated leaves and green protoplasts of oat (Avena sativa L.). Protoplasma, 1983, 114, 133– 140. Koike, K.; Jia, Z.; Nikaido, T. New triterpenoid saponins and sapogenins from Saponaria officinalis. J. Nat. Prod. 1999, 62, 1655– 1659. Koike, K.; Jia, Z.; Nikaido, T. Triterpenoid saponins from Vaccaria segetalis. Phytochemistry, 1998, 47, 1343– 1349. Kurosawa, Y.; Takahara, H.; Shiraiwa, M. UDP-glucuronic acid:soyasapogenol glucuronosyltransferase involved in saponin biosynthesis in germinating soybean seeds. Planta, 2002, 215, 620– 629. Lu, Y.; Van, D.; Deibert, L.; Bishop, G.; Balsevich, J. Antiproliferative quillaic acid and gypsogenin saponins from Saponaria officinalis L. roots. Phytochemistry, 2015, 113, 108– 120. Mikołajczyk-Bator, K.; Błaszczyk, A.; Czyżniejewski, M.; Kachlicki, P. Identification of saponins from sugar beet (Beta vulgaris) by low and high-resolution HPLC– MS/MS. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences, 2016, 1029-1030, 36– 47. Mitra, S.; Dungan, S. R. Micellar Properties of Quillaja Saponin. 1. Effects of Temperature, Salt, and pH on Solution Properties. J. Agric. Food Chem. 1997, 45, 1587– 1595. Moniuszko-Szajwaj, B.; Masullo, M.; Kowalczyk, M.; Pecio, Ł; Szumacher-Strabel, M.; Cieślak, A.; Piacente, S.; Oleszek, W.; Stochmal, A. Highly Polar Triterpenoid Saponins from the Roots of Saponaria officinalis L. Helv. Chim. Acta, 2016, 99, 347– 354. Moniuszko-Szajwaj, B.; Pecio, L.; Kowalczyk, M.; Simonet, A. M.; Macias, F. A.; Szumacher-Strabel, M.; Cieslak, A.; Oleszek, W.; Stochmal, A. New Triterpenoid Saponins from the Roots of Saponaria officinalis. Nat. Prod. Commun. 2013, 8, 1687– 1690. Nisius, A. The stromacentre in Avena plastids: an aggregation of β-glucosidase responsible for the activation of oat-leaf saponins. Planta, 1988, 173, 474– 481. Oakenfull, D. G. Aggregation of Saponins and Bile Acids in Aqueous Solution. Aust. J. Chem. 1986, 39, 1671– 1683. Oleszek W.; Hamed A. In Saponin-Based Surfactants; Johansson, I., Kjellin, M., Eds.; Surfactants from Renewable Resources; John Wiley & Sons, Incorporated: Hoboken, 2010, 239– 250. Oleszek, W.; Jurzysta, M.; Ploszynski, M.; Colquhoun, I. J.; Price, K. R.; Fenwick, G. R. Zahnic Acid Tridesmoside and Other Dominant Saponins from Alfalfa (Medicago Sativa L.) Aerial Parts. J. Agric. Food Chem. 1992, 40, 191– 196. Osbourn, A. Saponins and plant defence - A soap story. Trends Plant Sci. 1996, 1, 4– 9. 46 Paczkowski, C.; Wojciechowski, Z. A. The occurrence of UDPG-dependent glucosyltransferase specific for sarsasapogenin in Asparagus officinalis. Phytochemistry, 1988, 27, 2743– 2747. Paczkowski, C.; Zimowski, J.; Krawczyk, D.; Wojciechowski, Z. A. Steroid-specific glucosyltransferases in Asparagus plumosus shoots. Phytochemistry, 1990, 29, 63– 70. Stapleton, A.; Allen, P. V.; Friedman, M.; Belknap, W. R. Purification and Characterization of Solanidine Glucosyltransferase from the Potato (Solanum Tuberosum). J. Agric. Food Chem. 1991, 39, 1187– 1193. Vincken, J.; Heng, L.; de Groot, A.; Gruppen, H. Saponins, classification and occurrence in the plant kingdom. Phytochemistry, 2007, 68, 275– 297. Wojciechowski, Z. A. Biosynthesis of oleanolic acid glycosides by subcellular fractions of Calendula officinalis seedlings. Phytochemistry, 1975, 14, 1749– 1753. Yang, Y.; Leser, M. E.; Sher, A. A.; McClements, D. J. Formation and stability of emulsions using a natural small molecule surfactant: Quillaja saponin (Q-Naturale®). Food Hydrocoll. 2013, 30, 589– 596. Zimowski, J. Characterization of UDP-galactose: tomatidine galactosyltransferase from tomato (Lycopersicon esculentum) leaves. Acta Biochim. Pol. 1994, 41, 202– 204. Önning, G.; Asp, N.; Sivik, B. Saponin content in different oat varieties and in different fractions of oat grain. Food Chem. 1993, 48, 251– 254.