Estradioli-immunokompleksivasta-aineiden affiniteettimaturaatio uuden sukupolven sekvensointia hyödyntäen - Ojaniittu, Evelina (My University, 2026)
Estradioli on estrogeeneihin kuuluva steroidihormoni, jonka tehtävänä on edistää biologisten naisten sekundääristen sukupuoliominaisuuksien kehittymistä, sekä osallistua kuukautiskierron säätelyyn. Lisäksi estradioli on yhteydessä useisiin sairauksiin ja sen roolia eri kliinisissä tiloissa on tarve tutkia edelleen. Nykyiset käytettävät menetelmät, kilpailevat immunomääritykset ja massaspektrometria, eivät pysty vastaamaan kaikkiin estradiolin määritysvaatimuksiin. Erityisesti estradiolin pienten pitoisuuksien määrittäminen on hankalaa. Nykyisten menetelmien haasteisiin vastauksena on aiemmin kehitetty ei-kilpaileva immunomääritys, joka perustuu estradiolin ja sen sitojavasta-aineen muodostamaan immunokompleksin tunnistavaan immunokompleksi-vasta-aineeseen. Tämän diplomityön yhtenä tavoitteena oli parantaa estradioli-immunokompleksi-vasta-aineen affiniteettia, mikä mahdollistaisi aiempaa herkemmän estradiolimäärityksen. Affiniteettimaturaatioprosessi toteutettiin rikastamalla satunnaismutaatioita sisältävä vasta-ainekirjasto faaginäyttötekniikalla eri estradiolipitoisuuksia käyttäen ja seulomalla valikoituneita variantteja parhaiden sitojien löytämiseksi. Perinteinen kokeellinen seulonta on kuitenkin työlästä ja satunnaisuuteen perustuvaa, joten työn toisena tavoitteena oli kehittää uuden sukupolven sekvensointimenetelmä Oxford Nanopore -sekvensointiin nojaava uudenlainen seulontamenetelmä. Uusi seulontamenetelmä tehtiin kokeellisen menetelmän rinnalla, jotta voitiin tutkia uuden menetelmän toimivuutta. Uudessa seulontamenetelmässä sekvensoitiin faaginäyttötekniikalla tehdystä selektiokierroksesta saadut näytteet, ja eri varianttien rikastumista tutkimalla valittiin parhailta vaikuttavat variantit kokeelliseen analyysiin. Työssä löydettiin usea aikaisemman määrityksen suorituskykyä parantava estradioliimmunokompleksi- vasta-ainevariantti. Parhaan variantin EC50-arvo oli 284 pM, kun aikaisemman määrityksen EC50-arvo oli 326 pM. Affiniteetiltaan parhaimmat variantit löydettiin uudella seulontamenetelmällä, joten sen kehittäminen todettiin onnistuneeksi. Uusi menetelmä avaa mahdollisuuden toteuttaa seulonta aiempaa kattavammin ja löytää harvinaisiakin sitojia.
Keywords: affiniteettimaturaatio; estradioli; faaginäyttötekniikka; immunokompleksivasta-aine; uuden sukupolven sekvensointi