DigitalMLPA:n käytön validointi kliinisessä työssä perinnöllisten syöpien tunnistuksessa - Raappana, Ville (My University, 2023)
Syöpä on genomin sairaus, joka on seurausta patogeenisten mutaatioiden kertymisestä yksilön genomiin. Syöpä voi johtua ympäristötekijöistä ja perinnöllisistä tekijöistä. Näistä jälkimmäinen voidaan yhdistää perinnölliseen syöpäalttiuteen, joka on yleensä seurausta kopiolukumuutoksista ituradan solujen kasvunrajoitegeeneissä. Kopiolukumuutokset ovat luonteeltaan geenialueiden eksonien kahdentumia tai häviämiä, ilmeten täten mahdollisesti joko geenituotteiden yli- tai alimääränä. Yksilön periessä toiselta vanhemmaltaan kopiolukumuutoksen omaavan alleelin hän omaa kasvaneen syöpäriskin riippuen geenistä. Diploidisen genomin turvin viallisen alleelin kantaja ei täten ilmennä useimmiten heti syövän oireita. Kun yksilön toimiva alleeli mutatoituu toimimattomaksi, mutaatiota kantavat solut ajautuvat lähemmäksi syöpäsoluiksi muuntumista. Ituradan solujen geenien kopiolukumuutosten havaitsemista varten on kehitetty molekyyligenetiikan menetelmiä, joissa hyödynnetään homologista pariutumista tunnetuille geenialueille valmistetuilla koettimilla DNA:n denaturaation myötä. Multipleksiligaatiosta riippuva koettimien monistus (MLPA) on yksi tällainen menetelmä, joka on laajasti käytössä. Menetelmää varten on suunniteltu useita eri koetinsarjoja perustuen eri syöville altistavien kopiolukumuutosten tunnistamiseen. Koettimien kanssa hybridisoituneet ja monistetut geenialueet tunnistetaan kapillaarisekvensoinnilla. Menetelmä on hyvä kopiolukumuutosten tunnistuksessa, mutta siitä on kehitetty massasekvensointia hyödyntävä tehokkaampi versio, digitaMLPA. Massasekvensoinnin kautta sekvensoitavien geenialueiden määrä kasvaa huomattavasti, joka tarkoittaa mahdollisuutta sisältää enemmän kohdennettuja koettimia yksittäiseen reaktioon. Tämä johtaa kattavampiin syöville altistavien kopiolukumuutosten seulontaan vähemmällä työmäärällä kuin MLPA:lla. Tämän työn tarkoituksena oli selvittää digitalMLPA:n luotettavuus tunnistaa TYKS Genomiikan vastuualueella ennalta tutkituista potilaiden DNA-näytteistä syöville altistavat kopiolukumuutokset kaupallisilla digitalMLPA koetinseoksilla. Lisäksi testauksen kohteena olivat ennalta tutkitut potilasnäytteet, joista ei ollut löydetty kopiolukumuutoksia koetinseoksilla havaittavilta geenialueilta. Menetelmällä onnistuttiin havaitsemaan kaikki kopiolukumuutokset sekä varmistamaan pseudogeeni yhdestä potilasnäytteestä. Normaalin kopiolukumuutoksen omaavista näytteistä kaikki todettiin normaaleiksi. Saadut tulokset tukevat menetelmän luotettavuutta yhdessä muiden yksittäisten tutkimusryhmien tekemien digitalMLPA kokeiden kanssa.

Cancer is a disease of the genome that results from the accumulation of pathogenic mutations in an individual's genome. Cancer can be caused by environmental factors and hereditary factors. The latter of these can be linked to an inherited susceptibility to cancer, which is usually the result of copy number variation (CNV) in germline cells’ cancer suppressor genes. CNVs are descripted as duplications or deletions of exons in gene regions, thus potentially manifesting as either excess or deficiency of gene products. When an individual inherits an allele with a CNV from one parent, they have an increased risk of cancer depending on the gene. Due to the diploid genome, the carrier of the defective allele does not usually show symptoms of cancer immediately. When individual's functional allele of the same gene is mutated to non-functional variant, the cells carrying the mutation start drifting into cancer cells. Molecular genetic methods have been developed for the detection of changes in the copy number of genes in germline cells, which utilize homologous pairing with probes prepared for known gene regions after DNA denaturation. Multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) is one such method that is widely used. Several different sets of probes have been designed for the method, based on the identification of copy number changes predisposing to different cancers. The gene regions hybridized with the probes are amplified and identified by capillary sequencing. The method is good for detecting copy number changes, but a more efficient version, digitaMLPA, has been developed that utilizes next generation sequencing (NGS). Through NGS, the number of gene regions that can be sequenced increases considerably, which means the possibility of including more targeted probes in a single reaction. This leads to more comprehensive screening of cancer predisposing copy number changes with less work compared to MLPA. The purpose of this work was to determine the reliability of digitalMLPA to identify cancer predisposing CNVs from DNA samples of patients previously examined in TYKS Genomics laboratory with commercial digitalMLPA probe mixtures. In addition, the subject of the testing were pre-examined patient samples in which no CNVs had been found in the gene regions detectable with the probe mixtures. The method succeeded in detecting all CNVs and confirmed a pseudogene from one patient sample. Of the samples with a normal copy number change, all were found to be normal. The obtained results support the reliability of the method together with other digitalMLPA tests performed by individual research groups.
Keywords: digitalMLPA, MLPA, massasekvensointi, kopiolukumuutos, syöpäalttius, iturata, perinnöllinen