RNA-polymeraasin peruuttamisen mekanismi transkription pysähtymisessä - Mäkinen, Janne (My University, 2018)
Geenien ilmenemisen ensimmäisessä vaiheessa, transkriptiossa, RNA-polymeraasi syntetisoi RNA:ta DNA:n emäsjärjestyksen mukaisesti. Transkription aikana RNA-polymeraasi satunnaisesti peruuttaa eli liikkuu taaksepäin DNA-juostetta pitkin työntäen RNA:n 3’-pään pois aktiivisesta keskuksesta. Peruutustilassa RNA:n pidentyminen estyy ja transkriptio pysähtyy. Poistuakseen peruutustilasta RNA-polymeraasin on (i) liikuttava eteenpäin tai (ii) leikattava nukleotidejä RNA:n 3’-päästä, jotta aktiivinen keskus vapautuu. RNA-polymeraasin peruuttaminen on tärkeä osa geenien ilmenemisen säätelyä ja RNA-polymeraasin tekemien virheiden korjaamista kaikilla eliöillä. Peruutustilan muodostumisen ja RNA:n leikkautumisen mekanismia ei kuitenkaan vielä täysin tunneta. Tutkimuksessani selvitin peruutustilasta palautumisen ja RNA:n leikkautumisen mekanismia lyhyissä peruutustiloissa. Tätä varten kehitimme koeasetelmia, jotka mahdollistavat peruutustilan määrän ja stabiilisuuden tarkastelun. Hyödynsin entsyymikineettisiä menetelmiä ja RNA-polymeraasin aktiiviseen keskukseen kohdistettuja mutaatioita selvittääkseni, miten RNA-polymeraasin rakennemuutokset vaikuttavat peruutustilaan ja RNA:n leikkautumiseen. Tuloksemme osoittavat, että aktiivisen keskuksen liikkuvan domeenin, liipaisinsilmukan, laskostunut muoto stabiloi peruutustilaa ja ohjaa RNA:n leikkautumista peruutustilassa. Lisäksi havaitsimme, että sekundäärikanavan juuressa oleva E-kohta suojaa peruutustilassa olevaa RNA:ta leikkautumiselta. Selvitin edelleen, miten eri transkriptiotekijät vaikuttavat peruutustilaan. Tutkin transkription leikkaamistekijöiden GreA ja GreB indusoiman leikkautumisen mekanismia kohdennetulla mutageneesillä. Mutaatiot Gre-tekijän kärjessä vaikuttivat siihen, mistä kohdasta se ohjaa RNA:ta leikkautumaan. Lisäksi havaitsin, että σ70 tehostaa RNA-polymeraasin siirtymistä peruutustilaan, millä voi olla merkitystä transkription aloitusvaiheen säätelyssä.
Keywords: geeni, RNA-polymeraasi, RNA, DNA, transkriptio, peruuttaminen