Immunokomplekseja sitovien vasta-aineiden tunnistaminen sekvenssianalyysillä - Sontag, Samu (My University, 2019)
Uuden polven sekvensointimenetelmät ovat kehittyneet viimevuosina nopeasti. Sekvensointilaitteiden kehittymisen myötä menetelmät ovat muuttuneet yhä luotettavammiksi, joustavimmiksi ja edullisimmiksi. Tämä on mahdollistanut uusien vasta-aineseulontamenetelmien kehittämisen, ja ennustaa uuden polven sekvensointimenetelmiin pohjautuvien tekniikoiden yleistymistä vasta-ainekehityksessä. Turun yliopiston biotekniikan laitoksella kehitettyjen synteettisten vasta-ainekirjastojen avulla on mahdollista seuloa vasta-aineita, joita on vaikea kehittää perinteisen eläinten immunisaation avulla. Tällä hetkellä faaginäyttötekniikan ongelmana on parhaiden vasta-aineiden löytäminen tuhansien kloonikandidaattien joukosta. Uuden polven sekvensointimenetelmät tarjoavat mahdollisuuden valvoa vasta-aineiden rikastumista faaginäyttöseulonnan aikana. Lisäksi käyttämällä DNA-pohjaisia viivakooditunnisteita voidaan sekvensoida yhden ajon aikana jopa kymmeniä eri näytteitä. Yhdistämällä kirjastoja voidaan vasta-aine kehitykselle selvittää optimaaliset olosuhteet pelkän uuden polven sekvensoinnista saadun tiedon perusteella. Tässä työssä hyödynnettiin uuden polven sekvensointitekniikkaa sekä bioinformatiikan työkaluja skatoli-, testosteroni-, mikrokystiini-LR- ja mikroystiini-RR-immunokomplekseja sitovien vasta-aineineiden tunnistamisessa, sekä niiden sitomisominaisuuksien määrittämisessä. Näytteinä käytettiin faaginäyttötekniikan ensimmäisen ja neljännen selektiokierroksen jälkeen eristettyjä kokonaisia scFv-M13-faageja sekä niistä eristettyä faagemidi-DNA:ta. Näytteet viivakoodattiin DNA-tunnistusalukkeilla ja sekvensoitiin Illumina Miseq sekvensointialustalla. Bioinformatiikkaa hyödyntäen sekvensseistä pystyttiin tunnistamaan CDRH3-alueet, joiden rikastumiskertoimia vertailemalla määritettiin sekvenssit, jotka ennustivat hyvää sitoutumista immunokomplekseja vastaan. Lisäksi sitoutumisominaisuuksien määrittämiseksi sekvenssien rakenteita vertailtiin toisiinsa klusterianalyysissä. Tutkimuksessa onnistuttiin löytämään uusia hyvin rikastuneita, mikrokystiini-LR:lle spesifisiä CDRH3-sekvenssejä, joita ei ole aiemmin pystytty Turun yliopistossa havaitsemaan perinteisiä menetelmiä käyttäen. Testosteroni- ja skatolikirjastoissa sekvenssien monimuotoisuus oli huomattavasti suurimpi kuin pidemmälle rikastetuissa mikrokystiinikirjastoissa. Skatolin tai testosteroni muodostamille immunokomplekseille ei tässä työssä onnistuttu sekvensointidatan perusteella löytämään muita selkeästi enemmän rikastuneita ja spesifisempinä erottuvia CDRH3-sekvenssejä.