siRNA-pallonukleiinihappojen synteesi silmänpohjan ikärappeuman hoitoon - Yliperttula, Ann-Mari (My University, 2025)
RNA-interferenssi on soluissa luontaisesti ilmenevä mekanismi, jonka avulla vieraat nukleiinihapot voivat vaikuttaa solun geeniekspressioon ja proteiinintuotantoon. RNA-interferenssin kautta vaikuttavat pienet häiritsevät RNA:t eli siRNA:t ja mikro-RNA:t eli miRNA:t. RNA-interferenssiin pohjautuvilla lääkehoidoilla voidaan kohdentaa siRNA-lääkkeitä geneettisiä sairauksia vastaan. Maailmanlaajuisesti yleisin sokeuteen johtava sairaus, silmänpohjan ikärappeuma, kehittyy verisuonten endoteelikasvutekijä VEGF:n epätavallisen korkean ilmenemisen kautta. Sairauden etenemistä voitaisiin pystyä estämään tai hidastamaan VEGF-kohdennetulla RNA-interferenssiin perustuvalla siRNA-hoidolla. Muokkaamattomalla siRNA:lla on haasteita vapaan kulkeutumisen kanssa soluun. Erilaiset muokkaukset ja kantajastrategiat ovat osoittautuneet tarpeellisiksi keinoiksi parantaa terapeuttisten oligonukleotidien kuljetinominaisuuksia. Kantajastrategioihin lukeutuvat muun muassa molekulaariset pallonukleiinihapot, joiden rakennetta pystytään muokkaamaan ydinrakenteen valinnalla ja pintamuokkausten kautta. Työn tavoitteena oli syntetisoida kontrolligeeni GAPDH:lle komplementaariset siRNA-oligonukleotidit tarvittavine muokkauksineen ja koota eri ydinrakenteilla (C60-fullereeni sekä 8- ja 10-kätinen atsidimuokattu silseskvioksaani) varustellut pallonukleiinihapot erilaisilla pintamuokkauksilla (polyetyleeniglykoli ja kolesteroli). Valmistettujen nanopartikkeleiden solun sisäänottoa tutkittiin ihmisen verkkokalvon pigmenttiepiteelisolulinja ARPE-19:n soluissa. Sisäänottokokeet analysoitiin virtaussytometrisesti seuraten oligonukleotideihin kiinnitettyä FAM-fluoreseiinileimaa. Kaikki halutut oligonukleotidit syntetisoitiin onnistuneesti. C60-fullereeni- ja 8-kätisen silseskvioksaaniydinrakenteeseen pohjautuvat pallonukleiinihapporakenteet saatiin syntetisoitua onnistuneesti. 10-kätisen silseskvioksaaniydinrakenteen synteesin viimeisessä reaktiovaiheessa kohdattiin ylitsepääsemättömiä haasteita, jolloin 10-kätisiä pallonukleiinihappoja ei päästy ollenkaan tutkimaan solukokeissa. Pääasialliset syyt reaktion epäonnistumiselle ovat epäsuotuisat steeriset tekijät sekä liian tiheä pintavaraus muodostuvassa pallonukleiinihapporakenteessa, jotka johtivat reaktion pysähtymiseen ennen lopputuotteen muodostumista. Valmistettujen rakenteiden solukokeet saatiin suoritettua onnistuneesti ja luotettavasti käyttäen riittävää määrää replikaatteja. Erot tuloksissa olivat suhteellisen pieniä. PEGylointi ei tuonut huomattavaa etua sisäänottoon. Kahdesta eri pitoisuudesta suuremman kolesterolimäärän sisältävät pallonukleiinihapot (1:1 vs. 1:3) kasvattivat solun sisäänottoa. Kolesterolipitoisuuden aiheuttamia ongelmia esimerkiksi aggregaation suhteen ei huomattu. Vapaita oligonukleotidejä verratessa kolesterolimuokkaus toi huomattavimman positiivisen eron solun sisäänotossa. Tulosten avulla saatiin alustavia tuloksia liittyen siRNA-pallonukleiinihappojen potentiaalisuuteen silmäsairauden hoidossa. Saadut tulokset yhdessä myöhemmin tehtävien geeninhiljennys- ja sytotoksisuuskokeiden kanssa luovat kokonaiskuvan, jonka avulla rakenteiden tehokkuutta ja luotettavuutta sairauden hoidossa voidaan arvioida entistä tarkemmin.

RNA interference is a naturally occurring mechanism by which foreign nucleic acids can affect the genetic expression and protein synthesis on the cell. The main affectors of RNA interference are small interfering RNAs or siRNAs and micro-RNAs or miRNAs. Therapeutic treatments based on RNA interference enable the use of therapeutic siRNAs and miRNAs for treating genetic illnesses. The most common illness causing blindness worldwide is age-related macular degeneration or AMD is caused by the abnormally high expression of the vascular endothelial growth factor or VEGF. VEGF-silencing siRNA-treatments based on RNA-interference could be a possible way of slowing down or halting the progression of AMD. Unmodified siRNA faces some difficulties with free uptake to the cell, which establishes the need for different modifications and carrier strategies for therapeutic oligonucleotides (ONs). Molecular spherical nucleic acids (MSNAs) are an example of a carrier strategy, where a bigger ON content could be carried into the cell via receptor-mediated endocytosis. Several options for modifying the core and surface structures of MSNAs bring many possibilities for forming an efficient and biocompatible carrier structure, which could answer the questions regarding ON delivery. The aims of this study were to synthesize complementary siRNA-ONs with a sequence coding a control gene GAPDH and assemble several MSNAs using different azide-modified core structures (C60-fullerene and 8- & 10-armed silsesquioxane) and surface modifications (polyethylene glycol and cholesterol). The cell uptake of the prepared nanoparticles was assessed with the human retinal pigment epithelium ARPE-19 cell line and the results were analyzed with flow cytometry following a FAM-fluorescent label attached to the sense-ON strand. All the desired ONs and the MSNAs with the C60 fullerene and 8-armed silsesquioxane core structures were successfully synthesized. On the other hand, when preparing the 10-armed silsesquioxane MSNA, some great challenges were faced. As a result, the 10-armed MSNA structure couldn’t be investigated via cell uptake and flow cytometry analysis. Steric hindrance and dense sufrace charges ended up being the most probable reasons causing the reaction to fail. The cell uptake studies were successfully done with synthesized nanoparticles. The results had only slight differences with PEGylation showing the most minimal changes compared to the control sample with untreated cells. MSNAs with cholesterol showed slightly more increased uptake with the higher cholesterol:antisense ratio giving the best results. Any aggregation issues with the cholesterol-containing structures weren’t detected. When comparing the free hybridized ONs without any core structures, the cholesterol modification resulted in a significant increase in uptake. These preliminary results highlighted some possibilities in the use of MSNAs as delivery vehicles for therapeutic ONs. These results together with some further gene silencing and cytotoxicity studies will help us to better understand the possible efficacy and usability of MSNAs for genetic illnesses.
Keywords: terapeuttiset siRNA:t, molekulaariset pallonukleiinihapot, silmänpohjan ikärappeuma