Funktionaalisesti tuntemattomien BRCA1- ja BRCA2-varianttien tarkastelu in silico -menetelmillä ja ANO7-varianttien alleelisen epätasapainon tutkiminen droplet digital PCR -menetelmällä - Hautanen, Niko (My University, 2020)
Tutkimuksen tarkoituksena oli tarkastella Turun yliopistollisen keskussairaalan Perinnölli-syyslääketieteen poliklinikan potilailta sekvensoinnin perusteella löydettyjä tuntemattoman merkityksen varianteiksi, eli VUS-varianteiksi, kutsuttuja BRCA1- ja BRCA2-geenien emäsvariantteja. Tutkittavia BRCA1-variantteja oli neljä ja BRCA2-variantteja 18. Alun perin tutkimuksen tarkoitus oli tutkia näiden varianttien alleelista epätasapainoa droplet digital PCR- eli ddPCR -menetelmällä, mutta huonon näytesaatavuuden takia tutkimus rajattiin vain varianttien tarkasteluun in silico -menetelmillä. Varianttien tarkastelu suoritet-tiin erilaisilla tietokoneohjelmilla, joihin lukeutuivat Alamut, Human Splicing Finder, RBPmap ja RegRNA. Tietokoneanalyysien tuottamaa tietoa tarkasteltiin jokaisen variantin osalta, ja tämän perusteella varianttien joukosta löytyi kolme erityisen mielenkiintoista varianttia, jotka tietokoneanalyysien perusteella voisivat sopia hyvin jatkotutkimuksiin, ohjelmien havaitsemien geenin toiminnan kannalta mahdollisesti haitallisten ominaisuuk-sien perusteella. Nämä variantit olivat BRCA2 c.6821G>T c.7712A>G, ja c.9872C>G. Tämän lisäksi tutkimuksen tarkoituksena oli tutkia ANO7-geenin eturauhassyöpäriskiä lisäävän rs77559646-varianttia kantavien potilaiden cDNA-näytteiden alleelista epätasa-painoa droplet digital PCR -menetelmällä. Tutkimukseen valittiin kymmenen näytettä ja kolme yhden nukleotidin polymorfian (SNP) emästä RNA-tason alleelisen epätasapainon määritystä varten. Tarkoituksena oli vertailla tällä menetelmällä saatuja tuloksia jo olemas-sa oleviin sekvensointituloksiin, ja tarkastella menetelmän soveltuvuutta alleelisen epäta-sapainon tutkimiseen RNA-tasolla. Tulosten perusteella ddPCR pystyi helposti havaitse-maan toisen alleelin puuttumisen homotsygoottisista näytteistä, mutta heterotsygoottisten näytteiden osalta menetelmän tarkkuus alleelisen epätasapainon määrityksessä vaihteli tutkittavasta SNP:stä ja näytteestä toiseen. Joissain näytteissä sekvensointi ja ddPCR-tulokset tukivat toisiaan, mutta toisissa näytteissä menetelmillä saadut tulokset erosivat toisistaan merkittävästi. Tilanteessa, jossa sekvensoinnilla saatu tieto alleelien välisestä suhteesta ei ollut kattavaa, ddPCR pystyi todennäköisesti määrittämään alleelien välisen suhteen tarkemmin kuin sekvensointidataan perustuva tulkinta.
Keywords: VUS-variantti, in silico -menetelmät, BRCA1, BRCA2, ANO7, alleelinen epätasapaino, droplet digital PCR, ddPCR