3D-tulostettu näytteen esikäsittelykasetti molekyylidiagnostiseen vieritestausjärjestelmään - Junes, Helea (My University, 2023)
Nukleiinihapposekvenssien monistukseen perustuvat osoitustestit ovat infektio-diagnostiikassa hyödynnettäviä spesifisiä ja herkkiä molekyylidiagnostisia testejä. Niiden toiminnan edellytyksenä on monivaiheinen näytteen esikäsittely, jossa nukleiinihapot eristetään ja puhdistetaan potilasnäytteestä. Infektiotautien nopeaan diagnosointiin vieritestauksessa on kehitetty kaupallisia alustoja, joissa kertakäyttöiseen suljettuun testikasettiin on integroitu näytteen esikäsittely osoitustestin ohella. Uusien alustojen suunnittelua ja kehitystyötä hidastaa prototyyppikasettien valmistus perinteisillä teollisen mittakaavan valmistusmenetelmillä, jotka ovat etenkin pienten prototyyppierien valmistukseen aikaa vieviä ja kalliita. Lisäävä valmistus eli 3D-tulostus tarjoaa nopean ja kustannustehokkaan menetelmän testikasettiprototyyppien valmistukselle, mutta vähäinen tieto tulostusmateriaalien ja -tekniikoiden soveltumisesta nestekäsittelyyn ja biokemiallisiin reaktioihin vaikeuttaa siirtymää 3D-tulostukseen kehitystyössä. Työn tavoitteena oli toteuttaa 3D-tulostamalla toiminnallinen ja automatisoitu nestekäsittelykasetti DNA:n eristykseen ja puhdistukseen. Työssä suunniteltiin ja valmistettiin ruuviekstruusio- ja stereolitografiatulostuksella nestekäsittelyyn soveltuva kasetti, johon integroitiin silikapinnoitteisiin superparamagneettisiin helmiin perustuva nukleiinihappojen eristys ja puhdistus. Nestekäsittelykasetin toiminnot automatisoitiin ja kasetin suorituskykyä verrattiin manuaalisesti toteutettuihin kaupallisiin eristyssarjoihin. Työssä kehitetty suljettu kasettikonsepti (83 mm x 35,5 mm x 17 mm) hyödyntää ruiskumäntäpohjaista nesteensiirtoa ja valitsijaventtiiliä sekä mahdollistaa reagenssien vapaan yhdistämisen, sekoittamisen ja lämmityksen erillisessä reaktiokammiossa. Erillisistä 3D-tulostetuista osista koottu kasetti on nestetiivis myös pintajännitettä poistavilla nesteillä. Kasetin ohjaamiseen rakennettu mikrokontrolleri-ohjattu analysaattori mahdollistaa tarkkojen tilavuuksien siirron ja kasetin toimintojen automatisoinnin. Automatisoidulla nestekäsittelykasetilla otettiin talteen ja puhdistettiin onnistuneesti jo eristettyä genomista DNA:ta, mutta kasetin suorituskyky ei vielä vastannut manuaalisesti toteutettujen eristysten tasoa. Työssä kehitetty menetelmä optisesti kirkkaiden rakenteiden toteuttamiseen 3D-tulostetuissa rakenteissa mahdollistaa tulevaisuudessa nukleiinihappojen osoitustestin integroimisen kasettiin ja siten kokonaisen molekyylidiagnostisen vieritestausalustan toteuttamisen 3D-tulostamalla.

Nucleic acid amplification tests (NAAT) are specific and sensitive molecular diagnostic (MDx) tests used commonly in infection diagnostics. The basis of their operation, exponential amplification of nucleic acids, relies on multi-step sample pretreatment where the nucleic acids are extracted and purified from the sample. For rapid diagnosis of infectious diseases in point-of-care (POC) settings, commercial operators have developed MDx-POC platforms that integrate sample pretreatment and NAAT into a single, self-contained test cartridge. The design and development of novel MDx-POC platform solutions and specifically the cartridge prototypes is hindered by the use of traditional manufacturing processes, that are slow and expensive especially when producing small batches of prototypes. Additive manufacturing, known as 3D printing, provides a fast and cost-effective method to develop new prototypes, but the transition to additive manufacturing in product development is hampered by the lack of knowledge on the suitability and applicability of different printing materials and techniques to liquid handling and biochemical reactions. The aim of this work was to fabricate a functional and automated liquid handling cartridge for DNA extraction and purification by the means of 3D printing. Nucleic acid extraction and purification based on silica-coated paramagnetic beads was integrated to the designed cartridge manufactured by stereolithography and fused filament fabrication. The performance of the automated cartridge was compared to manually operated commercial DNA extraction and purification kits. The self-contained cartridge (83 mm x 35,5 mm x 17 mm) developed in this work utilizes a syringe-piston based liquid transfer and a turn valve to enable the free combination, mixing and heating of reagents in a separate reaction chamber. The cartridge, assembled from separately 3D-printed parts, is liquidtight even with detergents. The microcontroller driven analyser built in the work makes it possible to transfer precise volumes and automate all cartridge operations. The automated cartridge was successfully used for recovering and purifying pre-extracted genomic DNA, but the performance of the cassette did not yet match manually performed extractions. A method developed in the work for achieving optically clear structures within 3D printed parts enables the integration of a NAAT to the cartridge and thus the fabrication of an entire MDx-POC platform via 3D-printing.
Keywords: 3D-tulostus, vieritestaus, DNA:n eristys ja puhdistus, nukleiinihapon osoitustestit