Translocation mechanism of the multisubunit RNA polymerase - Turtola, Matti (fi=Turun yliopisto|en=University of Turku|, 2018)
The expression and replication of genetic information forms the basis of life. The first step of gene expression, the transcription of DNA into RNA, is carried out in all organisms by multisubunit RNA polymerase enzymes (RNAP). During transcription, RNAP maintains 10 nucleotides of unwound DNA, the “transcription bubble”, allowing the use of one DNA strand as a template for RNA synthesis. The enzymatic machinery of RNAP couples the synthesis of RNA from nucleoside triphosphate substrates to the unwinding of the double helical DNA and the movement (translocation) along the DNA. After each transcribed nucleotide RNAP first occupies the “pre-translocated state”, after which RNAP and the transcription bubble thermally fluctuate either in the forward or backward direction. Upon forward movement, RNAP occupies the “post-translocated state” where it can bind the next nucleoside triphosphate substrate and catalyze the synthesis of RNA. Backward movement, in turn, forms the “backtracked state”, which blocks the active site in the enzyme and pauses the RNA synthesis. The molecular transitions during the translocation motion also serve as targets for regulating gene expression by protein factors and signals in the transcribed DNA. The RNAP translocation states have been characterized both structurally and biochemically, yet, the conformational dynamics of the RNAP and nucleic acids that control the translocation of RNAP still remain poorly understood. This gap in understanding is partially due to a lack of methods to directly monitor translocation with sufficient spatial and temporal resolution. Consequently, the detailed principles of the regulation of transcript synthesis remain to be discovered. Furthermore, a number of natural and synthetic antibiotics inhibit transcription by interfering with the movement of RNAP along the DNA. Thus, understanding the mechanisms of RNA synthesis and RNAP translocation as well as how they are inhibited by existing antibiotics provide routes and strategies for developing new antimicrobial drugs. In this thesis, I present the development of biophysical methods to measure Escherichia coli RNAP translocation in a time scale of milliseconds and with a resolution of one base pair (~3.4 Å). The methods rely on labelling the transcribed DNA with fluorescent nucleotide base analogues. When incorporated into suitable positions in the transcription bubble, the environment of the fluorophores changes with RNAP translocation, which can be detected as a change in the fluorescence intensity. We dissected the catalytic mechanism of RNAP by performing the fluorescent translocation measurements in parallel with assays that monitored the binding of the nucleoside triphosphate substrate into the active site of RNAP, the incorporation of the nucleotide into the RNA and the liberation of the by-product pyrophosphate (PPi). With this approach we were able to kinetically separate, for the first time, the individual steps of the RNAP catalytic cycle and established that RNAP spends a 30-80% share of the total time of the catalytic cycle in the translocation step. We employed the methods described above to study the thermodynamic and conformational basis of RNAP translocation. A key finding was that translocation is controlled by the opening and closing of the RNAP active site. The closing of the active site stabilized the pre-translocated state, whereas the opening of the active site facilitated forward translocation to the intrinsically more stable post-translocated state. PPi binding and release modulated translocation by favoring active site closing and opening, respectively. These findings were corroborated by the identification of RNAP variants with altered translocation and/or PPi release properties. Moreover, these investigations were inseparably connected to the identification of the inhibitory mechanisms of small molecules. We found that the RNAP inhibitor tagetitoxin prevented forward translocation by stabilizing the closed active site, whereas CBR703 destabilized the closed active site facilitating forward translocation, which, however, made RNAP hypersensitive to DNA encoded regulatory signals. We further dissected the movements of the DNA and the RNA during translocation with a combination of kinetic assays and the structural analysis of the transcription bubble using nucleic acid photo-crosslinking techniques. Our observations indicated that translocation is a multi-step process. Nucleotide addition by RNAP was followed by the opening of the active site and the translocation of the RNA, however, the DNA translocated only partially at this stage, suggesting the presence of an intermediate translocation state between the canonical pre- and post-translocation states. The RNAP catalytic cycle was then completed by the translocation of the DNA. Interestingly, the transcribed sequence could modulate the rate of DNA translocation to an extent that it became the rate-limiting step of the RNAP catalytic cycle. We provide experimental evidence for the two-step translocation mechanism and demonstrate how it can explain the control of RNA synthesis by the DNA sequence. Finally, we studied the mechanism and regulation of RNAP backtracking by measuring the kinetics of entry into the backtracked state by Gre-factor mediated RNA cleavage. RNAP backtracking was found to be facilitated by the melting of the DNA at the rear end of the transcription bubble. The universally conserved transcription factor NusG inhibited RNAP backtracking by stabilizing the DNA base pairs at the rear end of the transcription bubble, explaining at the molecular level, how NusG speeds up the rate of RNA synthesis. In another study, we investigated the structural basis of backtracking by incorporating a base analogue fluorophore into the RNA. Upon entry into the backtracked state the end of the RNA separated from the DNA giving rise to a fluorescence signal. Unexpectedly, the closing of the active site stabilized the backtracked RNA and prolonged the life-time of the backtracked pause. We found that the backtracked RNA binds in a pocket near the RNAP active site (the so-called E-site) that overlaps with the PPi and tagetitoxin binding sites. Together these interactions inhibited the forward translocation of RNAP by a factor of ~100. Although the prolonged occupancy of the RNA in the backtracked state facilitated transcriptional proofreading, the closed active site interfered with the RNA cleavage by the Gre-factors. Thus, our observations indicate that the binding of the backtracked RNA in the E-site may contribute to gene regulation by modulating the rate of RNA synthesis. The results present advances in the quantitative description of the catalytic mechanism of RNAP. Our observations reveal important features of RNAP operation as a molecular machine controlled by nucleic acids, transcription factors and small molecules, and open new mechanistic questions to be pursued. The methods presented here are applicable to similar studies in Archaeal and Eukaryotic transcription machineries.

TIIVISTELMÄ Elämä perustuu geneettisen perimän ilmentymiseen ja kopioitumiseen. Kaikissa eliöissä geenien ilmenemisen ensimmäinen vaihe on DNA:n kopioituminen RNA:ksi eli transkriptio. Transkriptiota katalysoivat RNA-polymeraasientsyymit (RNAP). Transkription aikana RNAP erottaa kaksinauhaisen DNA:n juosteet toisistaan ylläpitämällä 10 nukleotidiä sisältävää ”transkriptiokuplaa”, jolloin toista DNA-juostetta voidaan käyttää RNA:n synteesin ohjeena. RNAP:n entsyymikoneisto kytkee yhteen RNA-synteesin nukleosiditrifosfaatti-substraateista, DNA:n kaksoiskierteen avaamisen ja liikkeen (translokaation) DNA:ta pitkin. Jokaisen nukleotidin liittämisen jälkeen RNAP on ”pre-translokaatiotilassa”, josta se lämpöliikkeen vaikutuksesta siirtyy joko eteen- tai taaksepäin. Eteenpäin suuntautuvan liikkeen jälkeen RNAP päätyy ”post-translokaatiotilaan”, jossa se voi sitoa seuraavan substraatin ja katalysoida RNA:n synteesiä. Taaksepäin suuntautuva liike puolestaan synnyttää ”peruutustilan”, jossa RNA:n synteesi estyy. RNAP:iin sitoutuvat toiset proteiinit ja DNA:n signaalit voivat ohjata näitä liikkeitä ja siten säädellä geenien ilmenemistä. Vaikka RNAP on perusteellisesti kuvattu sekä rakenteellisesti että biokemiallisesti translokaation eri vaiheissa, näiden tilojen välinen dynamiikka sekä niitä välittävät konformaatiomuutokset ovat edelleen huonosti tunnettuja. Joukko synteettisiä ja luonnosta eristettyjä antibiootteja ehkäisee mikrobien kasvua estämällä RNAP:n liikkumista DNA:ta pitkin. Uusien antibioottien kehittämiseksi on tärkeää ymmärtää RNA-synteesin ja translokaation mekanismeja sekä selvittää, miten tunnetut antibiootit estävät RNAP:a katalysoimasta yllä mainittuja reaktiovaiheita. Transkription säätelyyn liittyvien molekyylitason periaatteiden selvittämistä on hidastanut olennaisesti puute menetelmistä, joilla translokaatiota voidaan suoraan havainnoida. Väitöskirjassani kehitin biofysikaalisia menetelmiä, joilla voitiin mitata Escherichia coli -bakteerista eristetyn RNAP:n translokaatiota millisekuntien aikaskaalassa yhden emäsparin (~3.4 Å) tarkkuudella. Menetelmät perustuvat fluoresoivien emäsanalogien sijoittamiseen DNA:han. Sopivissa kohdissa transkriptiokuplaa fluoroforien ympäristö muuttuu translokaation seurauksena, ja tämä voidaan havaita fluoresenssisignaalin kasvuna. Tutkimme RNAP:n katalyysimekanismia mittaamalla translokaation lisäksi nukleotidin sitoutumista aktiiviseen keskukseen, nukleotidin liittymistä RNA:han ja pyrofosfaatin (PPi) irtoamista. Näin pystyimme ensimmäisinä erottamaan toisistaan RNAP:n katalyysisyklin erilliset reaktiovaiheet ja mittaamaan translokaation kestoksi 30-80% katalyysisyklin kokonaisajasta. Menetelmien avulla tutkimme translokaation termodynaamista perustaa. Keskeinen havaintomme oli, että translokaatiota säätelee RNAP:n aktiivisen keskuksen avautuminen ja sulkeutuminen. Aktiivisen keskuksen sulkeutuminen stabiloi pre-translokaatiotilaa, kun taas sen avautuminen mahdollisti eteenpäin suuntautuvan liikkeen muutoin stabiilimpaan post-translokaatiotilaan. PPi:n sitoutuminen ja irtoaminen kytkeytyivät translokaatioon, edellinen suosimalla aktiivisen keskuksen sulkeutumista ja jälkimmäinen sen avautumista. Havaintojemme vahvistukseksi tunnistimme RNAP:sta rakenteellisia mutaatioita, jotka vaikuttivat translokaatioon ja PPi:n irtoamiseen. Nämä tutkimukset liittyivät myös selvitykseen mekanismeista, joilla pienmolekyylit estävät RNAP:n katalyysiä. Havaitsimme, että tagetitoksiini esti translokaatiota stabiloimalla suljettua aktiivista keskusta, kun taas CBR703 vaikutti päinvastaisesti ja edisti translokaatiota. Jälkimmäisessä tapauksessa RNAP kuitenkin muuttui samalla yliherkäksi DNA:n transkriptiota sääteleville signaaleille, mikä hidasti RNA:n synteesinopeutta. Selvitimme translokaation aikana tapahtuvia DNA:n ja RNA:n liikkeitä kineettisten mittausten lisäksi biokemiallisilla menetelmillä, joilla voitiin analysoida transkriptiokuplan rakennetta. Tulosten mukaan translokaatioon sisältyy useita vaiheita. Nukleotidin liittymistä seurasi aktiivisen keskuksen avautuminen ja RNA:n translokaatio, mutta DNA ei kuitenkaan translokoitunut tässä vaiheessa vielä kokonaan viitaten siihen, että tyypillisten pre- ja post-translokaatiotilojen lisäksi on olemassa niiden välivaihe. Tämän jälkeen seurasi katalyysisyklin päättävä DNA:n täydellinen translokaatio. Mielenkiintoista oli se, että DNA:n emäsjärjestys vaikutti DNA:n translokaationopeuteen jopa toisinaan siinä määrin, että siitä tuli koko katalyysisyklin nopeutta rajoittava vaihe. Kokeelliset tuloksemme tukevat kaksivaiheista translokaatiomallia ja osoittavat, miten malli voi selittää DNA:n emäsjärjestyksen erilaiset vaikutukset RNA-synteesiin. Tutkimme myös taaksepäin suuntautuvaa translokaatiota ja sen säätelyä mittamalla RNAP:n peruutustilan muodostumista. Tässä hyödynsimme Gre-proteiineja, jotka edistävät RNA:n leikkautumista RNAP:n peruutustilassa. DNA:n kaksoiskierteen avautuminen transkriptiokuplan perässä edisti taaksepäin suuntautuvaa translokaatiota. Evolutiivisesti hyvin konservoitunut säätelyproteiini NusG vähensi peruutustilaan joutumista stabiloimalla DNA:n emäspareja transkriptiokuplan perässä. Tämä tulos selittää molekyylitasolla, mihin perustuu NusG:n kyky nopeuttaa RNA:n synteesiä. Toisessa osatyössä tutkimme RNAP:n peruutustilan rakennetta sijoittamalla fluoresoivan emäsanalogin RNA:n päähän. Fluoresenssi kasvoi, kun RNA:n pää erkani DNA:sta peruutustilan muodostuessa. Yllättäen aktiivisen keskuksen sulkeutuminen stabiloi peruutustilaa ja näin pitkitti RNA-synteesin pysähdystä. Havaitsimme, että peruutustilaan joutunut RNA sitoutui aktiivisen keskuksen lähellä sijaitsevaan taskuun, joka sivuaa PPi:n ja tagetitoksiinin sitoutumiskohtia. Yhdessä nämä vuorovaikutukset hidastivat RNAP:n eteenpäin suuntautuvaa translokaationopeutta noin sadasosaan alkuperäisestä. Vaikka RNA:n pitkittynyt sitoutuminen peruutustilaan edisti RNA:n oikolukua, sulkeutunut aktiivinen keskus esti Gre-välitteistä RNA:n leikkautumista. Kuvaamamme peruutustilan vuorovaikutukset voivat täten ensisijaisesti vaikuttaa RNA-synteesin nopeuteen, ja edelleen geenien ilmenemisen säätelyyn. Väitöskirjani tulokset edistävät kvantitatiivista ymmärrystä RNAP:n katalyysimekanismeista. Havaintomme valaisevat RNAP:n molekyylikoneiston toimintaa ja periaatteita, joilla nukleiinihappo-rakenteet, transkriptiota säätelevät proteiinit ja pienmolekyylit vaikuttavat RNAP:n aktiivisuuteen. Esitetyt tutkimusmenetelmät ovat sovellettavissa myös arkkibakteerien ja eukaryoottien transkriptiokoneistojen tutkimiseen.