Bioluminesenssiin perustuva immunomääritys syanobakteerien tuottamien toksiinien havaitsemiseen - Valtonen, Nea (My University, 2020)
Syanobakteerien muodostamia massaesiintymiä esiintyy maailmanlaajuisesti vesistöissä. Osa syanobakteerikannoista tuottavat myrkkyjä. Näistä yleisimmät ovat rengasrakenteiset mikrokystiinit ja nodulariini, jotka ovat hepatotoksisia eli maksaa vaurioittavia. Talousvesissä myrkkyjä ei luonnollisesti tulisi olla lainkaan ja siksi mikrokystiinit ovat viranomaisvalvontaa vaativia. Tämän yhdisteryhmän voimakkain myrkky on mikrokystiini LR (MC-LR), jolle maailman terveysjärjestö WHO on määrittänyt juomavedessä enimmäispitoisuussuosituksen 1 µg/L. Tällä hetkellä on jo olemassa analyyttisiä menetelmiä mikrokystiinin ja nodulariinin havaitsemiseen juomavedestä kuten kilpailevia ja ei-kilpailevia immunomäärityksiä, korkean erotuskyvyn nestekromatografi (HPLC, eng. high performance liquid chromatography) sekä massaspektrometri. Ongelmana olemassa olevissa menetelmissä on, että määritykset eivät ole riittävän tarkkoja, määritykset ovat hitaita tai määritykset vaativat isoja ja kalliita laitteita. Nopeampi, helppokäyttöinen ja kustannustehokas määritys edesauttaisi tehokkaammassa juomaveden laadun tarkkailussa. Diplomityön tavoitteena oli kehittää kaksi bioluminesenssiin perustuvaa, homogeenista sekä ei-kilpailevaa immunomääritystä mikrokystiinien ja nodulariinin havaitsemiseksi. Toinen on perinteinen ei-kilpaileva immunomääritys ja toinen perustuu entsyymin komplementaatioon. Työssä suunniteltiin kaksi vasta-ainekonstruktia: i) primäärivastaaine anti-ADDA Fab tunnistamaan rengasrakenteisten mikrokystiinien ja nodulariinin ADDA-ryhmä sekä ii) sekundäärinen vasta-aine tunnistamaan anti-ADDA Fab:n ja mikrokystiinin tai nodulariinin muodostaman immunokompleksin. Sekundääriseen vasta-aineeseen fuusioitiin lusiferaasientsyymi NanoLuc, joka furimazine-substraatin katalysoidessa reaktiota tuottaa valoa. Alustavien tulosten perusteella anti-ADDA Fab:lla havaittiin aktiivisuutta ja sen sekä mikrokystiinin muodostaman immunokompleksin tunnistava NanoLuc-Fab-fuusio tuotti signaalia. Tämä mahdollistaa määrityksen jatkokehityksen sekä entsyymin komplementaatioon perustuvan määrityksen kehityksen.

Cyanobacteria exist around the world and they are found in mass occurrences partly due to climate change. Some cyanobacterial strains produce toxins and the moststudied and abundant toxic groups are cyclic structured microcystins and nodularin that are hepatotoxic. Toxins should not be found in domestic water and therefore microcystins are controlled by the authorities. The most severe variant of cyanobacterial toxins is microcystin LR (MC-LR) and World Health Organization has set a guidance limit for MCLR concentration in drinking water, 1 µg/L. There are already several analytical methods available to detect microcystins and nodularin from drinking water, for example competitive and non-competitive immunoassays, high performance liquid chromatography (HPLC) and mass spectrometry. However, there are some problems in the current methods. Methods are not sensitive enough, methods are slow or methods need expensive and large equipment. A rapid, easy to use and cost-effective method would improve the detection of the quality of the drinking water. The aim of this Master’s thesis was to develop two bioluminescence based noncompetitive immunoassays to detect microcystins and nodularin. The first assay is a traditional non-competitive immunoassay and the other assay is based on complementation of the enzyme. In this study, two antibody constructs were designed: i) a primary antibody anti-ADDA Fab that recognizes the cyclic structured microcystin and nodularin and ii) a secondary antibody that recognizes the immunocomplex which is formed by anti-ADDA Fab and microcystin or nodularin. Luciferase enzyme NanoLuc was fused to secondary antibody. When substrate furimazine catalyzes this chemical reaction, it produces light. According to preliminary test results, activity is detected in anti-ADDA Fab and NanoLuc-Fab-fusion produced light when it recognized the immunocomplex formed by anti-ADDA Fab and microcystin. This enables further development of the immunoassay which is based on the enzyme complementation.
Keywords: ei-kilpaileva immunomääritys, bioluminesenssi, mikrokystiini