Immunomäärityksen kehittäminen perinataalisen aivovaurion havaitsemiseen - Lammi, Riikka (My University, 2020)
Perinataalinen aivovaurio on juuri ennen syntymää, syntymän aikana tai pian syntymän jälkeen tapahtuva vaurio aivoissa. Perinataalisen aivovaurion taustalla voi olla useita syitä, mutta yhdistävänä tekijänä on usein hapenpuute ja verenkierron häiriöt. Perinataalinen aivovaurio voi johtaa vakaviin neurologisiin häiriöihin tai pahimmassa tapauksessa kuolemaan. Perinataalisen aivovaurion aiheuttamat kliiniset ongelmat ovat usein havaittavissa vasta viikon tai vuosien päästä syntymästä. Perinataalisen aivovaurion seurauksia on mahdollista lieventää viilennyshoidolla, joka tulisi aloittaa kuuden tunnin sisällä syntymästä. Näin ollen perinataalisen aivovaurion havaitseminen aikaisessa vaiheessa on tärkeää. Toistaiseksi luotettavin menetelmä perinataalisen aivovaurion diagnosointiin on magneettikuvaus, joka on kuitenkin kallis ja aikaavievä menetelmä. Kaikkia vastasyntyneitä ei siten voida kuvantaa, vaan tarvittaisiin luotettava menetelmä jatkotutkimuksia vaativien vastasyntyneiden tunnistamiseksi. Immunomääritys voisi tarjota mahdollisuuden perinataalisen aivovaurion nopeaan havaitsemiseen riippumatta siitä, onko vastasyntyneellä havaittavissa kliinisiä oireita. Tämän diplomityön tavoitteena oli kehittää immunomääritys, jolla voidaan havaita perinataalinen aivovaurio vastasyntyneeltä. Määrityksen tuli olla riittävän herkkä, jotta sillä voitaisiin mitata valittua biomerkkiainetta sekä terveiltä että aivovaurion saaneilta vastasyntyneiltä. Työssä pyrittiin kehittämään kaksi immunomääritystä, joilla mitattiin seerumista joko S100B:tä tai tau-proteiinia. S100B:n ja taun pitoisuuksien on havaittu nousevan aivovaurion yhteydessä vastasyntyneiden seerumissa. Kehitettävät määritykset olivat kaksipuoleisia immunofluorometrisiä määrityksiä, joissa käytettiin leimana europium-kelaattia. Fluoresenssi mitattiin aikaerotteisesti. Määritysten toimintaa arvioitiin oletetusti terveiden ja aivovaurion saaneiden aikuisten seeruminäytteillä. Määritykset oli tarkoitus automatisoida PerkinElmerin laitteelle, jotta niitä voitaisiin tulevaisuudessa käyttää perinataalisen aivovaurion seulontaan. S100B-määritystä ei saatu kehitettyä, sillä S100B:tä ei kyetty havaitsemaan terveiden ja aivovauriopotilaiden seeruminäytteistä. Mahdollisesti ainakaan toinen määritykseen käytetyistä vasta-aineista ei tunnistanut luonnollista S100B:tä, joka on homodimeeri. Määrityksen kehitystä ei kuitenkaan jatkettu, eikä toimimattomuuden syystä ole varmaa tietoa. Tau-määrityksellä voitiin havaita kohonneita pitoisuuksia aivovaurion saaneiden aikuisten näytteistä. Oletetusti terveiden aikuisten näytteiden osalta suurimmasta osasta ei kuitenkaan saatu mitattua tau-pitoisuuksia. Määrityksen analyyttiseksi herkkyydeksi saatiin 4,5 pg/ml, kun standardilaimennokset tehtiin naudan sikiön seerumiin. Määritystä ei päästy vielä tutkimaan vastasyntyneiden seeruminäytteillä. Määritys vaatii lisäksi optimointia ennen kuin se voidaan automatisoida. Tau-määrityksen suurimpia haasteita on taun matala pitoisuus seerumissa.

Perinatal brain injury refers to an injury that occurs before, during or soon after birth. There are several etiologies behind perinatal brain injury, of which the common factors are usually asphyxia and disturbance in cerebral blood flow. Perinatal brain injury is a significant cause of death and severe neurological disability. However, the clinical manifestations of perinatal brain injury are often delayed. While some might be observed within the first week of life, some might take years to occur. The prognosis of perinatal brain injury can be improved by therapeutic hypothermia, which should be initiated within six hours of birth. Therefore, early detection of perinatal brain injury is essential. Currently, the most reliable method for diagnosis of perinatal brain injury is magnetic resonance imaging. Yet, it is also costly and time consuming. Consequently, it is not practical to use magnetic resonance imaging unless there is a reason to suspect brain injury. An immunoassay could provide a fast method to detect newborns requiring further examinations, even when there is no apparent sign of injury. The aim of this Master’s thesis was to develop an immunoassay to detect perinatal brain injury in newborns. The assay needed to be sensitive enough to measure biomarker levels in both healthy and brain injured newborns. This research aimed to develop two immunoassays, one for S100B and another for tau. The concentrations of S100B and tau have been observed to increase in newborn serum due to perinatal brain injury. The selected assay format was sandwich immunofluorometric assay with a europium chelate label to allow time-resolved fluorescence measurement. The assay functionality was assessed with serum samples from brain injured and presumably healthy adults. The assays were to be automated for PerkinElmer’s platform to be used for possible newborn screening of perinatal brain injury. The S100B immunoassay could not be developed as S100B could not be detected in the serum samples. Possibly at least one of the two antibodies used could not recognize the homodimeric S100B present in biological fluids. However, this could not be confirmed as no further investigations were conducted. The tau immunoassay was successful in detecting increased levels in samples from adults with brain injury. However, tau concentrations could not be detected in the majority of the presumably healthy serums. The analytical sensitivity of the assay was 4.5 pg/ml when fetal bovine serum was used for standard dilutions. The assay performance has not yet been assessed with newborn serums. Optimization is also required before the tau immunoassay can be automated. One of the greatest challenges for the assay is low tau concentration in serum.
Keywords: perinataalinen aivovaurio, immunofluorometrinen määritys, S100B, tau, perinatal brain injury, immunofluorometric assay, S100B, tau