Fluorescence-based imaging of cellular defect in lysinuric protein intolerance (LPI) - Toivonen, Minna (Annales Universitatis Turkuensis D 1094, 2013)
Fluoresenssiperusteiset kuvantamismenetelmät lysinurisen proteiini-intoleranssin (LPI) soluhäiriön tutkimuksessa Lysinurinen proteiini-intoleranssi on suomalaiseen tautiperintöön kuuluva autosomaalisesti peit¬tyvästi periytyvä sairaus, jonka aiheuttaa kationisten aminohappojen kuljetushäiriö munuaisten ja ohutsuolen epiteelisolujen basolateraalikalvolla. Aminohappojen kuljetushäiriö johtaa moniin oirei¬siin, kuten kasvuhäiriöön, osteoporoosiin, immuunijärjestelmän häiriöihin, oksenteluun ja runsaspro¬teiinisen ravinnon nauttimisen jälkeiseen hyperammonemiaan. LPI-geeni SLC7A7 (solute carrier family 7 member 7) koodaa y+LAT1 proteiinia, joka on basolateraali¬nen kationisten ja neutraalien aminohappojen kuljettimen kevyt ketju, joka muodostaa heterodimee¬rin raskaan alayksikön 4F2hc:n kanssa. Tällä hetkellä SLC7A7-geenistä tunnetaan yli 50 LPI:n aiheut¬tavaa mutaatiota. Tässä tutkimuksessa erityyppisiä y+LAT1:n LPI-mutaatiota sekä yhdeksän C-terminaalista polypep¬tidiä lyhentävää deleetiota kuvannettiin nisäkässoluissa y+LAT1:n GFP (green fluorescent protein) -fuusioproteiineina. Tulokset vahvistivat muissa soluissa tehdyt havainnot siitä, että 4F2hc on edel¬lytyksenä y+LAT1:n solukalvokuljetukselle, G54V-pistemutantti sijaitsee solukalvolla samoin kuin vil¬lityyppinen proteiini, mutta lukukehystä muuttavia ja proteiinia lyhentäviä mutantteja ei kuljeteta solukalvoon. Lisäksi havaittiin, että poikkeuksena tästä säännöstä ovat y+LAT1-deleetioproteiinit, joista puuttui korkeintaan 50 C-terminaalista aminohappoa. Nämä lyhentyneet kuljettimet sijaitsevat solukalvolla kuten villityyppiset ja LPI-pistemutanttiproteiinit. Dimerisaation osuutta kuljetushäiriön synnyssä tutkittiin käyttämällä fluorescence resonance energy transfer (FRET) menetelmää. Heterodimeerin alayksiköistä kloonattiin ECFP (cyan) ja EYFP (yellow) fuusioproteiinit, joita ilmennettiin nisäkässoluissa, ja FRET mitattiin virtaussytometri-FRET -menetel¬mällä (FACS-FRET). Tutkimuksissa kaikkien mutanttien havaittiin dimerisoituvan yhtä tehokkaasti. Kul¬jetushäiriön syynä ei siten ole alayksiköiden dimerisaation estyminen mutaation seurauksena. Tutkimuksessa havaittiin, että kaikki mutantti-y+LAT1-transfektiot tuottavat vähemmän transfektoi¬tuneita soluja kuin villityyppisen y+LAT1:n transfektiot. Solupopulaatioissa, joihin oli tranfektoitu lu¬kukehystä muuttava tai stop-kodonin tuottava mutaatio havaittiin suurempi kuolleisuus kuin saman näytteen transfektoitumattomissa soluissa, kun taas villityyppistä tai G54V-pistemutanttia tuottavas¬sa solupopulaatiossa oli pienempi kuolleisuus kuin saman näytteen fuusioproteiinia ilmentämättö¬missä soluissa. Tulos osoittaa mutanttiproteiinien erilaiset vaikutukset niitä ilmentäviin soluihin, joko suoraan y+LAT1:n tai 4F2hc:n kautta aiheutuneina. LPIFin SLC7A7 lähetti-RNA:n määrä ei merkittävästi poikennut villityyppisen määrästä fibroblasteissa ja lymfoblasteissa. SLC7A7:n promoottorianalyysissä oli osoitettavissa säätelyalueita geenin 5’ ei-koo¬daavalla alueella sekä ensimmäisten kahden intronin alueella. LPI-taudin tautimekanismin kannalta keskeisin tekijä on kuitenkin aminohappokuljetuksen häiriö, jonka vaikutuksesta näistä aminohapoista riippuvaiset prosessit elimistössä eivät toimi normaalisti. Havaittu virheellinen y+LAT1/4F2hc kuljetuskompleksin sijainti edellyttää lisätutkimuksia sen mahdol¬lisen kliinisen merkityksen selvittämiseksi.

Lysinuric protein intolerance is an autosomal recessive disease of Finnish disease heritage characterized by cationic amino acid transport defect in kidney and small intestine epithelium basolateral cell membranes. The primary defect leads to a variety of symptoms, such as failure to thrive, osteoporosis, growth failure, nausea and postprandial hyperammonemia. LPI gene SLC7A7 (solute carrier family 7, member 7) codes for y+LAT1, the light chain of basolateral transporter for cationic amino acids, which dimerizes with the heavy subunit 4F2hc. Today, over 50 LPI-causing mutations have been identified in SLC7A7 gene. In this study, a selection of LPI causing mutations and nine C-terminal truncating deletions of y+LAT1 were expressed and the resulting transporters were visualized in mammalian cells using GFP (green fluorescent protein) fusions of y+LAT1. The results on the LPI mutants confirmed the observations obtained from non-mammalian system: y+LAT1 requires the 4F2hc for membrane trafficking. Equally to wild type transporter, the point mutant G54V is localized to the plasma membrane, but the frameshift and nonsense mutant transporters remain cytoplasmic. In contrast to these observations, the truncated constructs lacking less than or equal to 50 amino acids also localized to the plasma membrane. To study, whether the reason for the trafficking defect is the inability of frameshift mutant y+LAT1 to dimerize with 4F2hc, fluorescence resonance energy transfer (FRET) method was utilized. ECFP (cyan) and EYFP (yellow) fusion proteins of the heterodimer subunits were expressed in mammalian cells, and FRET was measured using flow cytometry (FACS) FRET. When mutant y+LAT1 protein interaction with 4F2hc was analyzed using FACS-FRET, all the studied mutants dimerized at equal efficiency. Thus, the inability of 4F2hc to interact with mutant y+LAT1 proteins is not causing the trafficking defect. Throughout the series of experiments, all the mutant y+LAT1 proteins were expressed in lower rate compared to wild type y+LAT1. The frameshift and nonsense mutant y+LAT1 protein expressing cells had higher mortality than non-expressing cells in the same sample. In contrast, wild type and G54V point mutant positive cells had lower mortality, demonstrating the different effects of the mutant proteins on cell viability and proliferation independently or via the interaction with 4F2hc. The LPIFin SLC7A7 mRNA levels did not differ significantly from wild type mRNA levels in fibroblasts and lymhoblasts. The analysis of the SLC7A7 promoter suggested regulatory elements in the 5’ non-coding region as well as in the first two exons. The most significant factor in LPI pathogenesis is the primary amino acid transport failure, causing processes dependent on its’ substrates to function deficiently. However, the clinical significance of the mistargeting of the y+LAT1/4F2hc complex needs further studies.