Oligonukleotidiraaka-aineen puhtauden optimointi Vanadis NIPT Assay analyysille - Sihvonen, Sanni (My University, 2023)
Kromosomaalisten sairauksien seulonta on osa kansallisia raskaudenaikaisia tutkimuksia. Seulontojen tarkoitus on tunnistaa kromosomipoikkeavuudet sikiönkehityksen alkuvaiheessa, ja siten helpottaa hoitopäätösten tekoa. Perinteisten invasiivisten raskaudenseulontamenetelmien rinnalle on kehitetty noninvasiivisia menetelmiä (NIPT), jotka mahdollistavat sairauksien tunnistuksen ilman invasiivisesta näytteenotosta aiheutuvaa keskenmenoriskiä. NIPT-seulonnat perustuvat äidin plasmasta eristetyn soluvapaan DNA:n analysointiin. Rolling circle amplification-reaktioon (RCA-reaktio) perustuvassa NIPT-menetelmässä soluvapaa DNA monistetaan ja leimataan entsymaattisesti kromosomispesifisti fluoresoivilla leimoilla. Syntyneet rolling circle tuotteet (RCP) analysoidaan fluoresenssia mittaavalla kuvantamislaitteella. Fluoresenssin määrän perusteella määritetään analysoitavan näytteen kromosomaalisten sairauksien riskiarvio. Työssä selvitettiin erilaisten oligonukleotidi-raaka-aineiden puhtausasteen ja muodostuvien RCP:iden toiminnallisuuden välistä korrelaatiota. Päämääränä oli parantaa RCA-reaktioon pohjautuvan NIPT-seulontamenetelmän toimivuutta optimoimalla RCA-reaktiossa käytettävien oligonukleotidi-raaka-aineiden laatua. Laadun optimointiin pyrittiin puhdistamalla oligonukleotideja HPLC-menetelmillä ja analysoimalla erilaisten puhtausasteiden vaikutusta menetelmän toimivuuteen. Puhdistetuttujen oligonukleotidien puhtausastetta analysoitiin analyyttisen HPLC-analyysien ja UHPLC-MS-analyysin avulla ja erilaisten puhtausasteiden vaikutusta menetelmän toimivuuteen toiminnallisuustestien avulla. Tulosten perusteella kehitetyllä HPLC-menetelmällä puhdistettujen oligonukleotidien toiminnallisuus parani ja vastasi kontrolli-oligonukleotidin toiminnallisuutta. Tulosten perusteella puhdistusmenetelmän toimivuutta pyritään jatkossa laajentamaan muihin RCA-reaktion oligonukleotidi-raaka-aineisiin pyrkimyksenä parantaa NIPT-teknologian toiminnallisuutta ja käytettävyyttä sikiöseulonnoissa.
Keywords: NIPT, rolling circle amplification, oligonukleotidit, puhtausaste