Vaihtoehtoisten sisäisten monistuskontrollien suunnittelu ja testaus - Alanko, Tommi (fi=Turun yliopisto|en=University of Turku|, 2017)
Polymeraasiketjureaktio (engl. polymerase chain reaction, PCR) on yleisesti käytetty menetelmä kliinisessä diagnostiikassa. PCR:llä voidaan monistaa potilasnäytteen sisältämää taudinaiheuttajan DNA:ta eksponentiaalisesti hyvin lyhyessä ajassa. Herkkä PCR-tekniikka on kuitenkin altis monistuksen inhibitiolle, jota aiheuttaa monien kliinisten näytematriisien yhdisteet, vikatilanteet PCR-laitteessa, virheet PCR-reaktioseoksen valmistuksessa tai esimerkiksi toiminnaltaan heikot reagenssit. Todellinen negatiivinen näyte ja inhibitio tulee kyetä erottamaan toisistaan, ja tähän käytetään erityistä sisäistä monistuskontrollia (engl. internal amplification control, IAC). Se sisältää halutusta monistuskohteesta eli kohdetemplaatista poikkeavaa sekvenssiä, mutta monistuu tämän kanssa samassa reaktiossa. IAC suunnitellaan siten, ettei sen läsnäolo merkittävästi heikennä kohdetemplaatin monistumista, jolloin diagnostisen testin herkkyys ei vaarannu. Tässä työssä tavoitteena oli kehittää vaihtoehtoisia IAC:ta Abacus Diagnostica Oy:n käyttöön. Suunnittelun lähtökohdaksi valittiin organismi, jonka esiintyvyys kliinisissä näytteissä on vähäistä. Sopiva templaattisekvenssi valittiin GenBank-tietokannasta BLAST-sekvenssihakutyökalun (engl. Basic Local Alignment Search Tool) ja UGENE-bioinformatiikkaohjelman avulla. Templaattia monistavat alukkeet ja PCR:ssä monistustuotteen havainnointiin tarvittavat leima- ja sammuttajakoettimet suunniteltiin in silico. Valitun organismin DNA:ta eristettiin DNA:n eristyskitillä. Templaattisekvenssi sijoitettiin plasmidivektoriin, joka tilattiin transformoituna E. coli -soluihin. Alukkeiden toimivuutta ja eristetyn DNA:n sekä plasmidi-DNA:n monistumista tutkittiin PCR:ssä yhteensopivien alukeparien valitsemiseksi. Lopuksi koko IAC:n eli alukeparien, koettimien ja plasmidi-DNA:n toimivuus varmennettiin GenomEra-alustan DNA-kuivakemialastuilla. Tutkimuksessa valittiin IAC:idenn templaattisekvenssiksi kirjallisuus- ja sekvenssianalyysin pohjalta flamingonkukan (lat. Anthurium andraeanum) genomista DFR-geenistä noin 500 emäsparin jakso. Tälle alueelle suunniteltiin useita alukepareja niin, että erilaisilla yhdistelmillä templaattisekvenssin monistettavan osan eli amplikonin pituus vaihteli 100 ja 300 emäsparin välillä. Alukeparien seulonnassa käytettiin templaattina flamingonkukasta eristettyä DNA:ta ja plasmidi-DNA:ta. Osa alukkeista muodosti kokeellisissa tutkimuksissa epäspesifisiä dimeerejä, joita ei in silico -analyysilla havaittu. Alukkeista ja koettimista onnistuttiin muodostamaan yhteensopivia IAC-kokonaisuuksia, joiden toimivuus pystyttiin osoittamaan GenomEra-alustan DNA-kuivakemialastuilla. Näistä IAC:ista yhtä käytettiin onnistuneesti Abacus Diagnostican C. difficile -testissä nykyisen IAC:n tilalla. Tuotantokäyttöä varten IAC:ille tulee suorittaa vielä optimointia ja validointi.