Phage display modified antibody to free PSA subform for improved prostate cancer detection - Khan, Md. Ferdhos Liton (fi=Turun yliopisto|en=University of Turku|, 2024)
Prostate specific antigen (PSA) is a key marker for early prostate cancer (PCa) detection. Multi-kallikrein immunoassays are commonly utilized to overcome the limitations of PSA in diagnosing aggressive PCa. PSA subforms have been extensively studied, and their usage has been demonstrated to improve PCa detection in the early stages. Early immunoassays for intact free PSA (iPSA) have demonstrated their clinical utility in multiple large PCa screening cohorts. Adding iPSA to a multi-kallikrein panel (total PSA, free PSA, and hK2) to evaluate the risk of clinically significant PCa in apparently healthy men substantially improves diagnostic specificity. From a technical perspective, the iPSA assay uses a unique monoclonal antibody (Mab) 4D4. The performance characteristics of this antibody are however less than ideal when considering the construction of a robust routine assay. The objectives of the thesis were to improve the binding affinity of 4D4 antibody utilizing phage display technology and to develop different assay formats for the sensitive and robust detection of iPSA and nicked PSA (nPSA). The 4D4 Mab was cloned as recombinant Fab fragment and three mutant Fab libraries were constructed. Phage display technology was used to enrich iPSA-specific antibody Fab fragments from the libraries. Wild-type 4D4 Mab and an affinity-improved mutant 4D4-L3-2 Fab antibody were used as a tracer or capture in iPSA assay. Immunoassays for total PSA, free PSA, iPSA, nPSA, and total and free hK2 were used to assess perioperative plasma samples. The individual PSA and hK2 parameters alone, in different ratios or in the four-kallikrein combinations were specifically analyzed in patients with prostate gland volumes below or equal and above the median. Several 4D4 mutants showing improved affinity and slower dissociation rate while maintaining the original iPSA specificity were identified from the Fab libraries. Using the mutant 4D4-L3-2 Fab in optimized versions of the iPSA assay yielded several-fold improvements in assay sensitivity compared with wild-type 4D4 Fab. The iPSA assay using 4D4-L3-2 Fab as a capture antibody offered an improvement in separating cancer from non-cancer, benign and low-grade cancers from clinically significant cancers especially in patients with lower prostate gland volumes.

---- Prostataspesifinen antigeeni (PSA) on keskeinen merkkiaine eturauhassyövän varhaisessa toteamisessa. Monikallikreiini-immunomäärityksiä käytetään yleisesti vähentämään PSA:han liittyviä rajoitteita aggressiivisen eturauhassyövän diagnosoinnissa. PSA:n eri muotoja on tutkittu laajasti, ja niiden käytön on osoitettu parantavan eturauhassyövän havaitsemista varhaisvaiheessa. Varhaiset intaktin vapaan PSA:n (iPSA) immunomääritykset ovat osoittaneet kliinisen hyödyllisyytensä useissa laajoissa eturauhassyövän seulonnan kohorttitutkimuksissa. iPSA:n lisääminen moni-kallikreiinipaneeliin (kokonais-PSA, vapaa PSA ja hK2), jota käytetäänkliinisesti merkittävän eturauhassyövän kohonneen riskin arviointiin näennäisesti terveillä miehillä, parantaa huomattavasti määrityksen diagnostista spesifisyyttä. Teknisesti iPSA-määrityksessä käytetään ainutlaatuista monoklonaalista vasta-ainetta 4D4. Tämän vasta-aineen ominaisuudet eivät kuitenkaan ole ihanteelliset rutiinimäärityksen pystyttämiseen. Tämän väitöskirjatyön tavoitteena oli parantaa 4D4-vasta-aineen sitoutumisaffiniteettia faaginäyttötekniikan avulla ja kehittää erilaisia määrityksiä iPSA:n ja pilkkoutuneen PSA:n (nPSA) herkkään ja vakaaseen osoittamiseen. 4D4 Mab kloonattiin rekombinantti-Fab-fragmentiksi ja rakennettiin kolme mutatoitua Fab-vasta-ainekirjastoa. Kirjastoista rikastettiin faaginäyttötekniikalla iPSA-spesifisiä Fab-vasta-ainefragmentteja. Villityyppistä 4D4 Mab ja affiniteetiltaan paran-tanutta 4D4-L3-2 Fab-fragmenttia käytettiin leima- ja sitojavasta-aineena iPSA-määrityksessä. Kokonais-PSA:n, vapaan PSA:n, iPSA:n nPSA:n sekä kokonais- ja vapaan hK2:n immunomäärityksiä käytettiin perioperatiivisten plasmanäytteiden arviointiin. Erillisiä PSA- ja hK2-parametreja sellaisenaan, niiden eri suhteita tai neljän kallikreiinin yhdistelmää analysoitiin erityisesti potilailla, joiden eturauhasen tilavuus oli pienempi tai yhtä suuri tai suurempi kuin mediaani. Fab-kirjastoista löydettiin useita affiniteetiltaan parantuneita 4D4-mutantteja, joilla oli hitaampi dissosiaatio samalla kun alkuperäinen iPSA-spesifisyys oli säilynyt. 4D4-L3-2 Fab mutantin käyttö optimoiduissa iPSA-määrityksessä paransi määrityksen herkkyyttä moninkertaisesti verrattuna alkuperäiseen 4D4 Fabiin. iPSA-määritys, jossa käytetään 4D4-L3-2 Fabia sitojavasta-aineena paransi syövän erottamista muista kuin syövistä sekä hyvänlaatuisten ja matala-asteisten syöpien erottamista kliinisesti merkittävistä syövistä erityisesti potilailla, joiden eturauhasen tilavuus on pienempi.