Structural studies of glutathione transferases towards the development of novel applications and drug design - Poudel, Nirmal (fi=Turun yliopisto|en=University of Turku|, 2022)
Glutathione transferases (GSTs) represent a ubiquitous large family of multifunctional enzymes which protect cellular macromolecules from reactive electrophiles. GSTs catalyse the nucleophilic addition of glutathione to electrophilic groups of a large variety of hydrophobic molecules, thereby increasing their solubility to facilitate their excretion from the cell. GSTs play a key role in detoxification, drug metabolism, and multiple-herbicide resistance in weed species. However, the structural basis for the activity of several classes of GSTs remains unknown. Multiple-herbicide resistance (MHR) is a global threat to weed control in cereal crops. MHR weeds express specific phi class glutathione transferases (MHR-GSTF) that confer resistance against multiple herbicides. MHR-GSTFs, therefore, represent a promising target against MHR weeds. On the other hand, the mammalian GSTs, such as the mu-class GSTs, are linked to the development of resistance to a variety of anti-cancer drugs, resulting in the failure of the treatment. The mu-class GSTs are also associated with Parkinson´s disease as well as other illnesses related to oxidative stress. The present work investigates the structure of the MHR-GSTFs from different grass weeds and crops, in particular Alopecurus myosuroides and Lolium rigidum. The work also presents structural and functional insights into the mu-class GSTs from Camelus dromedarius and Homo sapiens. The crystal structures of MHR-GSTF from Alopecurus myosuroides (AmGSTF) and Lolium rigidum (LrGSTF) were determined by molecular replacement at 1.33 Å and 1.90 Å resolution, respectively. The structure of AmGSTF was resolved with a bound glutathione sulfenic acid (GSOH) and succinic acid (SIN) at the enzyme´s active site whereas the LrGSTF structure was determined in complex with the inhibitor S-(4-nitrobenzyl) glutathione. Both enzymes showed conserved structural features compared with other phi class glutathione transferases. However, differences were observed at the C-terminal _8-helix and the H-site _4-helix that may affect the substrate specificity. Moreover, the structural analysis of GSTFs revealed an induced-fit mechanism and a decisive role of conserved Tyr118 and Phe122 in ligand binding. The results presented here provide new knowledge on the enzymology of phi class glutathione transferases and may be used to derive strategies to combat MHR weeds. The structures of a mu-class GST from Camelus dromedarius (CdGSTM1-1) with a bound substrate (GSH) or the reaction product, S-p-nitrobenzyl-glutathione (Nb-GSH) were determined by X-ray crystallography at 2.55 Å and 2.05 Å resolution respectively. The H-site of CdGSTM1-1 is variable and lined by Met35, Arg43, Tyr116, Phe209, Leu210, and Met212, which govern the recognition and binding of substrate in the active site. A noticeable 4 Å move of the β2-α2 loop region upon Nb-GSH binding presents snapshots of an induced-fit mechanism that facilitates the binding of various substrates. The studies will improve our understanding of camelid GSTs detoxification mechanisms and their contribution to abiotic stress adaptation in the desert environment. Besides, the structure of ligand-free Homo sapiens mu-class GST (hGSTM1-1) was determined at 1.59 Å resolution. The high-resolution hGSTM1-1 structure allowed the study of the induced-fit mechanism operated by hGSTM1-1 and the binding of Nb-GSH in detail.

Glutationitransferaasien rakennetutkimuksilla kohti uusien sovellusten kehitystä ja lääkeaineiden suunnittelua Glutationitransferaasit (GST:t) ovat tärkeä ryhmä entsyymejä, joilla on useita biokemiallisia funktioita ja ne suojaavat solun makromolekyylejä reaktiivisilta elektrofiileiltä. GST:t katalysoivat glutationin nukleofiilistä lisäystä useiden hydrofobisten molekyylien elektrofiilisiin ryhmiin, mikä lisää niiden liukoisuutta helpottaen niiden poistamista soluista. GST:eilla on keskeinen rooli rikkakasvilajien myrkkyjen poistamisessa, lääkeaineenvaihdunnassa ja useiden rikkakasvien torjunta-aineiden vastustuskyvyssä. Useiden GST-luokkien toiminnan rakenteellinen perusta on kuitenkin tuntematon. Moniherbisidiresistenssi (MHR) on maailmanlaajuinen uhka viljakasvien rikkakasvien torjumiselle. MHR-rikkakasvit ekspressoivat spesifisiä phi-luokan glutationitransferaaseja (MHR-GSTF), jotka antavat vastustuskyvyn useita herbisidejä vastaan. Siksi MHR-GSTF:t edustavat lupaavaa kohdetta MHR-rikkakasveja vastaan. Toisaalta nisäkkäiden GST:t, kuten mu-luokan GST:t, liittyvät resistenssin kehittymiseen useille syöpälääkkeille, mikä johtaa hoidon epäonnistumiseen. Mu-luokan GST:t liittyvät myös Parkinsonin tautiin sekä muihin oksidatiiviseen stressiin liittyviin sairauksiin. Tässä työssä tutkittiin eri ruohorikkakasvien ja -kasvien, erityisesti Alopecurus myosuroidesin ja Lolium rigidumin, MHR-GSTF:ien rakennetta. Tutkimuksessa käsiteltiin myös rakenteellisia ja toiminnallisia eroja Camelus dromedariuksen ja Homo sapiensin mu-luokan GST:ien välillä. Alopecurus myosuroidesin (AmGSTF) ja Lolium rigidumin (LrGSTF) MHR-GSTF:n kiderakenteet määritettiin templaattirakenteen avulla 1,33 Å:n ja 1,90 Å:n resoluutiolla. AmGSTF:n rakenteessa oli aktiiviseen kohtaan sitoutuneena glutationisulfeenihappo (GSOH) ja meripihka-happo (SIN), kun taas LrGSTF:n rakenne määritettiin kompleksina inhibiittorin S-(4-nitroben-tsyyli)glutationin kanssa. Molemmilla entsyymeillä oli konservoituneita rakenteellisia piirteitä verrattuna muihin phi-luokan glutationitransferaaseihin. Kuitenkin eroja havaittiin C-term-naalisessa _8-heliksissä ja H-alueen _4-heliksissä, jotka voivat vaikuttaa substraattispesifi-syyteen. Lisäksi GSTF:n rakenneanalyysi paljasti indusoidun konformaatiomuutoksen ja konser-voituneiden aminohappojen Tyr118:n ja Phe122:n ratkaisevan roolin ligandin sitoutumisessa. Tässä esitetyt tulokset tarjoavat uutta tietoa phi-luokan glutationitransferaasi-entsyymien toiminnasta, ja tuloksia voidaan hyödyntää uusien MHR-rikkakasvien torjunta-aineiden kehittämiksessä. Camelus dromedariuksen (CdGSTM1-1) mu-luokan GST:n rakenteet sidotun substraatin (GSH) tai reaktiotuotteen S-p-nitrobentsyyliglutationin (Nb-GSH) kanssa määritettiin röntgenkristallografialla 2,55 Å ja 2,05 Å resoluutiolla. CdGSTM1-1:n H-kohta on aminohapposekvenssiltään vaihteleva ja sitä reunustavat Met35, Arg43, Tyr116, Phe209, Leu210 ja Met212 säätelevät substraatin tunnistamista ja sitoutumista aktiivisessa kohdassa. Huomattava 4 Å:n liike β2-α2-silmukka-alueella Nb-GSH:n sitoutumisen yhteydessä esittää tilannekuvia indusoiduista konformaatiomuutoksista, jotka vaikuttavat erilaisten substraattien sitoutumiskykyyn. Tutkimukset parantavat ymmärrystämme kamelien GST:n detoksifikaatio-mekanismeista ja niiden vaikutuksesta abioottiseen stressiin sopeutumiseen aavikko-ympäristössä. Lisäksi ligandittoman Homo sapiens mu-luokan GST:n (hGSTM1-1) rakenne määritettiin 1,59 Å:n resoluutiolla. Korkean resoluution hGSTM1-1-rakenne mahdollisti hGSTM1-1:n indusoidun konformaatiomuutoksen (engl. induced-fit mechanism) ja Nb-GSH:n sitoutumisen yksityiskohtaisen tutkimuksen.