Kelaattikomplementaatio : Integroidun DNA:n monistus- ja detektointimenetelmän optimointi - Lempainen, Anna-Maija (fi=Turun yliopisto|en=University of Turku|, 2018)
Kelaattikomplementaatio perustuu kahteen, itsessään ei-fluoresoivaan koettimeen, jotka sitoutuessaan lähekkäin samaan vastinjuosteeseen muodostavat fluoresoivan kokonaisuuden. Tutkimassani menetelmässä kohdesekvenssi monistetaan polymeraasiketjureaktiolla (PCR) ja havainnoidaan paikkaspesifisesti reaktiokammion pinnalla ilman pesuvaiheita tai reaktiokammion avausta. Pintadetektio mahdollistaa usean eri analyytin määrittämisen käyttäen vain yhdenlaista leimaa. Polypropyleenilastujen pinta aktivoitiin primaarisilla aminoryhmillä (diaminosykloheksaani (DACH), allyyliamiini (AA), aminopropyylitrietoksysilaani (APTES) tai aminopropyylitrimetoksysilaani (APTMS)) ja atsidifunktionalisoitiin, minkä jälkeen reaktiokammion pintaan kiinnitettiin 5’-alkyynimodifioitu antennaligandikoetin kuparikatalysoidulla atsidi-alkyyni sykloadditiolla. Hybridisaatioliuoksessa kullekin monistustuotteelle oli spesifinen Eu3+-kelaattikoetin. Aikaerotteinen fluoresenssi mitattiin reaktiokammion alueelta 10 × 10 rasterina. Paras signaali-tausta-suhde saatiin antennakoetinkonsentraatiolla 1,67 µM. Koska primaariset aminoryhmät häiritsevät PCR:ää testattiin erilaisia pienimolekulaarisia yhdisteitä (Tween-20, glysiini, 3-butyynihappo ja alkyyni-polyetyleeniglykoli5-happo) pinnan blokkaamiseen. Menetelmän analyyttinen herkkyys (määriteltynä taustasignaalina lisättynä kolme kertaa taustan keskihajonnalla) oli DACH:lla 0,02 nM, AA:lla 0,01 nM, APTES:lla 0,03 nM ja APTMS:lla 0,21 nM. Kelaattikomplementaatioon perustuva integroitu monistus- ja detektointimenetelmä on lupaava uusi menetelmä nukleiinihappodiagnostiikan alalla. Paikkaspesifisen pintadetektoinnin ansiosta sillä saattaisi olla potentiaalia monianalyyttimääritykseksi, joka voisi haastaa tällä hetkellä käytössä olevat, eri fluoroforien mittaukseen perustuvat menetelmät.

Chelate complementation is based on two intrinsically nonfluorescent probes which form a fluorescent complex when they are bound adjacent to each other on a complementary DNA-strand. In this project the target DNA is amplified by PCR (polymerase chain reaction) and detection is performed as a 10 x 10 raster based on spatial resolution from the reaction vessel, which negates the need for washes and opening of reaction vessel while making it possible to detect several analytes at once. The surface of polypropylene chips was functionalized with primary amines by the use of DACH (diaminocyclohexane), AA (allyleamine), APTES ((3-aminopropy)ltriethoxysilane) or APTMS (aminopropyltrimethoxysilane) and activated with azides. An antenna ligand probe with a 5’-alkyne modification was attached to the surface via copper catalyzed azide-alkyne cycloaddition. Hybridization was done with a specific Eu3+-chelate probe for each analyte. Signal was measured as time resolved fluorescence with a raster of 10 x 10. The best signal-to-background –ratio was achieved using an antenna ligand probe concentration of 1,67 µM. Because primary amines may inhibit PCR several types of blocking were tested (Tween-20, glycine, 3-butynic acid and alkyne-polyethyleneglycol-acid). Analytic sensitivity was defined as background + 3SD and was 0.02 nM for DACH, 0.01 nM for AA, 0.03 nM for APTES, and 0.21 nM for APTMS. An integrated amplification and detection method based on chelate complementation is a new and promising method within the field of molecular diagnostics. Because detection is performed with spatial resolution, it has the potential to become a multiplexed method and it may outcompete the current diagnostic methods which are based on using several different fluorophores.