Ulostenäytteestä tehtävän kvantitatiivisen kalprotektiinitestin kehitys - Mäkinen, Emma (My University, 2022)
Kalprotektiini on neutrofiileistä vapautuva suoliston tulehdusmerkkiaine, jota hyödynnetään suolistosairauksien diagnosoinnissa. Kalprotektiinin pitoisuus ulosteessa kohoaa suoliston tulehdustiloissa, joiden syynä voi olla infektiivinen tai ei-infektiivinen tekijä. Nykyiset kalprotektiinipikatestit ovat joko kvantitatiivisia tai semi-kvantitatiivisia. Kvantitatiiviset laboratoriotestit kalibraatiosuorineen ovat työläitä ja/tai vaativat isoja automatisoituja laitteistoja. Työn tavoitteena oli kehittää sisäisen kalibraation antigeeniosoitustesti kalprotektiinille ja tutkia kaksoisfotoniviritteisen ArcDia™ (TPX) -määritystekniikan soveltuvuutta kvantitatiivisessa ulostenäyteanalyysissä. Työssä valmistettiin kalprotektiinille spesifisiä diagnostisia testireagensseja päällystämällä mikropartikkelit vasta-aineilla ja konjugoimalla vasta-aineita fluoroforeilla. Vasta-ainereagenssien suorituskyky osoittaa kalprotektiini tutkittiin rekombinanttisella kalprotektiinilla ja sen alayksiköillä sekä ulostenäytteillä. Lisäksi optimoitiin prototyyppitestin reagenssien reaktiopitoisuudet. Lopuksi tutkittiin prototyyppitestin suorituskykyä osoittaa kalprotektiini kvantitatiivisesti ulostenäytteistä, joiden kalprotektiinipitoisuus oli määritetty immunofluorometriaan perustuvalla PhadiaTM 250 (Thermo Fisher) -laitteella. Kalprotektiinin prototyyppitestin analyyttinen herkkyys reaktiossa oli 0,4 ng/ml ja lineaarinen alue noin 20 ng/ml asti. PhadiaTM 250 -laitteen ja prototyyppitestin tulosten välillä oli eroa. Prototyyppitestillä kalprotektiinipitoisuudet olivat noin kaksinkertaisesti alhaisempia. Erot määritetyissä kalprotektiinipitoisuuksissa voi johtua työn aikana havaitusta ulostenäytteestä johtuvasta inhibitiosta, joka tulisi estää. Toisaalta eri testeillä analysoituna näytteiden mitatut kalprotektiinipitoisuudet ovat suuruudeltaan kuitenkin hyvin erilaisia. Kirjallisuuden perusteella jopa 5-kertaisia toisiinsa nähden. Tällaisiin laitteiden keskisiin eroihin nähden prototyyppitestin ja PhadiaTM 250-laitteen väliset erot kalprotektiinipitoisuuksissa eivät olleet suuret. Huomattavat erot pitoisuuksissa kaupallisten laitteiden välillä voivat johtua standardin kalibrointimenetelmän puutteesta. Työssä pystyttiin osoittamaan, että TPX-määritystekniikka soveltuisi kvantitatiiviseen kalprotektiinin osoitukseen ulostenäytteestä, mutta testiä pitää vielä merkittävästi kehittää toiminnallisuuden, käytettävyyden ja tarkkuuden parantamiseksi optimoimalla reagenssipitoisuuksia sekä ulostenäytteen esikäsittelyä.

Calprotectin is an intestinal inflammatory marker released from neutrophils. It is used to diagnose intestinal diseases. Calprotectin concentration in feces is elevated in inflammatory bowel conditions that may be due to an infectious or non-infectious factor. Current calprotectin rapid tests are either quantitative or semi-quantitative. Quantitative laboratory tests with calibration procedures are laborious and / or require space because of large, automated equipment. The aim of this work was to develop a quantitative antigen detection test with internal calibration for calprotectin and to study the applicability of the two-photon excitation ArcDia™ (TPX) assay technique for quantitative analysis from stool samples. Diagnostic test reagents specific for the calprotectin were prepared by coating microparticles with antibodies and conjugating the antibodies with fluorophores. The charasteristics of antibody reagents to detect calprotectin was studied with recombinant calprotectin and its subunits as well as with stool samples. The reaction concentrations of the prototype test reagents were optimized. Finally, the performance of the protype test to quantify calprotectin from faecal samples was studied with stool samples, which kalprotectin concentrations were determined with PhadiaTM 250 (Thermo Fisher) immunofluorometry instrument. The analytical sensitivity of the prototype test for calprotectin was 0.4 ng/mL in the reaction and the linear range was up to 20 ng mL. There was a difference between the results of the PhadiaTM 250 and the prototype test. In the prototype test, calprotectin concentrations were lower. Differences in determined calprotectin concentrations may be due to inhibition of the faecal sample observed during work, which should be prevented. On the other hand, approximately 5-time concentration differences can be obtained when comparing different commercial calprotectin test platforms. Compared to such differences between tests, the differences in calprotectin concentration difference between the prototype test and the PhadiaTM 250 was smaller Significant differences in concentrations between commercial devices may be due to the lack of standard calibration methods. In this work it was demonstrated that the TPX assay technique would be suitable for the quantitative detection of calprotectin from stool samples. Nevertheless, the test still needs to be significantly developed to improve functionality, usability, and accuracy by optimizing reagent concentrations and stool sample pretreatment.
Keywords: Kalprotektiini, TPX-määritystekniikka, , tulehdukselliset suolistosairaudet