Assessing the effects of ANO7 mutations on mRNA splicing using a minigene splicing assay - Tulonen, Nea (My University, 2021)
Prostate cancer (PrCa) is the most common cancer type in men. Dysregulated splicing is considered a hallmark of cancer, and PrCa has its own characteristic splicing landscape. Alternative splicing (AS) enables production of multiple protein isoforms from a single gene by altering splicing of exons and introns. AS outcomes can be studied with reverse transcription PCR (RT-PCR) or a minigene splicing assay, which allows comparison of wild type and mutant sequences in identical conditions. This MSc study focused on two splicing mutations in ANO7, a PrCa susceptibility gene. Variant rs77559646 in the splice donor site of intron 4 leads to exon skipping and increased intronic expression presumably by disrupting binding of an essential splicing factor. The variant was corrected by CRISPR-Cas9 base-editing, also producing a new unwanted mutation upstream. This study aimed to determine whether normal splicing would be restored regardless. Ultimately, RT-PCR analysis revealed that intron 3 expression was not reduced. Additionally, the region exhibited deletions related to Alu repeat elements. Splicing assay showed that exon 4 splicing was improved, but only slightly. Variant rs78154103 in intron 7 causes cryptic splice site selection and partial intron retention. The variant’s effect on splicing was studied with a minigene splicing assay using a longer construct than in a previous study, allowing formation of endogenous secondary structures, suspected of contributing to dysregulated splicing. As anticipated, more exon skipping was detected compared to reference, but inclusion of cryptic exon did not differ between the constructs, contrary to what was expected.

Eturauhassyöpä on miesten yleisin syöpä. Eturauhassyövässä, kuten muissakin syö vissä, havaitaan häiriintynyttä esiaste-RNA:n silmukointia. Vaihtoehtoinen silmukointi mahdollistaa useamman erilaisen proteiinituotteen tuoton yhdestä geenistä vaihtoeh toisilla eksoni-introni-yhdistelmillä. Vaihtoehtoista silmukointia voidaan tutkia esimerkik si RT-PCR-tekniikalla (reverse transcriptase - polymerase chain reaction) tai minigee nien silmukointianalyysillä (engl. minigene splicing assay), joka mahdollistaa villityypin ja mutanttisekvenssin vertailun identtisissä olosuhteissa. Tässä tutkielmassa tutkin kahta ANO7-eturauhassyöpäalttiusgeenissä ilmenevää sil mukointimutaatiota. Variantti rs77559646 sijaitsee introni 4:n luovuttaja-alueella, josta silmukointi tavallisesti alkaa. Variantti johtaa eksoni 4:n poissilmukointiin ja lisäänty neeseen introni 3:n ekspressioon oletettavasti estämällä silmukointiin tarvittavan ribo nukleoproteiinin sitoutumisen. Mutaatio on korjattu CRISPR-Cas9 ba se-editing -tekniikalla, mutta samanaikaisesti syntyi uusi mutaatio yläjuosteessa. Tut kimuksen tavoitteena oli selvittää, palautuuko asianmukainen silmukointi tahattomasta muutoksesta huolimatta. Asiaa tutkittiin RT-PCR-tekniikalla ja minigeenien silmukointi analyysillä. RT-PCR-analyysi osoitti, että introni 3:n ekspressio ei eronnut muokatun ja varianttisekvenssin välillä. Lisäksi tutkitulla introni 3 -alueella havaittiin deleetioita, jotka olivat yhteydessä Alu-toistojaksoihin. Silmukointianalyysistä kävi ilmi, että eksoni 4:n silmukointi palautui, mutta odotettua heikommin. Introni 7:ssä sijaitseva variantti rs78154103 aiheuttaa kryptisen silmukointikohdan akti vaation, johtaen kryptisen eksonin (eksoni + osa intronia) muodostumiseen. Variantin vaikutusta silmukointiin tutkittiin minigeenien silmukointianalyysillä käyttäen pidempää minigeenikonstruktia, kuin aiemmassa tutkimuksessa. Pidempi sekvenssi mahdollistaa RNA:n sekundaarirakenteiden muodostumisen, joiden rakennemuutosten epäillään aiheuttavan häiriintynyttä silmukointia kyseisellä geenialueella. Odotusten mukaisesti variantti aiheutti lisääntynyttä eksonin poistoa verrattuna villityyppiin. Kryptinen eksoni kuitenkin ekspressoitui yhtä vahvasti molemmilla konstrukteilla, toisin kuin odotettiin.
Keywords: ANO7, prostate cancer, SNP, mutation, alternative splicing, RT-PCR, minigene splicing assay