CRISPR-Cas-systeemit ja Streptomyces-bakteerien antibioottien biosynteesitutkimus - Virtanen, Olli (My University, 2019)
CRISPR-Cas-systeemi on useaan tyyppiin jaettu bakteerien ja arkkien adaptiivinen immuunipuolustusjärjestelmä, joka toimii kolmeosaisesti: adaptaatio, ilmennys ja häirintä. Tyyppeihin kuluu esimerkiksi hyvin tunnetut tyypin I- (I-E: Escherichia coli) ja tyypin II-systeemi (II-A: Streptococcus pyogenes). Tyypin II-A CRISPR-Cas-systeemin modulaarista Cas9-endonukleaasia ja ohjattua häirinnän sekvenssispesifistä DNA:n katkomista voidaan käyttää sekvenssispesifisessä geneettisessä muokkauksessa: Cas9:llä tehdään kohdegeeniin katkos, joka korjataan tämän ja muokatun geenielementin välisellä homologisella rekombinaatiolla. Prosessia kutsutaan CRISPR/Cas9-geenieditoinniksi, jota on alun perin käytetty esimerkiksi eukaryoottien muokkaukseen. Työn tarkoituksena oli tutkia Streptomyces-bakteerien C-glykosidiantibioottien metaboliareittien geenejä deletoimalla näitä CRISPR/Cas9-geenieditointiplasmideilla ja tulkitsemalla geenien roolia yhdistetuotossa deleetioiden vaikutuksen perusteella. Kohteena oli Streptomyces showdoensiksen showdomysiiniin liittyvä sdmA-geeni ja S. albuksen pseudouridimysiiniin (PUM) liittyvät stuC- tai stuG-geenit. Showdomysiinin on osoitettu estävän syöpäsolujen kasvua, kun taas PUM tehoaa antibioottiresistentteihin bakteereihin inhiboimalla transkriptiokoneiston toimintaa. Kyseisten antibioottien metaboliareittien tuntemusta on mahdollista soveltaa esimerkiksi lääkekehityksessä. Deleetiokanta S. showdoensis ATCC15227-ΔsdmA ei tuottanut showdomysiiniä. Tämän lisäksi osoitettiin, että komplementoitu deleetiokanta ja villityyppi tuottivat showdomysiiniä, osoittaen sdmA-geenin olevan tärkeä showdomysiinin tuotossa. Jatkotutkimuksissa selvisi, että SdmA on tärkeä showdomysiinin C-nukleosidisen sidoksen synteesissä. S. albus DSM40763-kannan stuG-deleetiota yritettäessä huomattiin, että menetelmä ei todennäköisesti sovellu kyseiseen kantaan; syynä huono rekombinaatiotehokkuus tai kannan resistenssi selektioantibiootteihin.
Keywords: Cas9, C-nukleosidi, CRISPR-Cas, geenieditointi, Streptomyces