Oligonukleotidien leimakoetinkompleksin siirtoon perustuva hybridisaatiomääritys - Liimatainen, Maiju (My University, 2024)
Määrityksessä mitattava signaali koostuu materiaalien ja mittalaitteen aiheuttamasta taustasignaalista, leiman epäspesifisen sitoutumisen aiheuttamasta taustasignaalista ja spesifisesti sitoutuneen leiman signaalista. Määritysten herkkyyttä voidaan parantaa lisäämällä leiman spesifistä aktiivisuutta tai vähentämällä leiman epäspesifistä sitoutumisesta aiheutuvaa taustasignaalia. Herkkiä määrityksiä tarvitaan esimerkiksi veren soluvapaiden oligonukleotidien, kuten mikro-RNA:iden mittaamiseen. Mikro-RNA:t ovat lupaavia merkkiaineita useille eri sairauksille, mutta niiden pieni koko ja alhainen pitoisuus aiheuttaa haasteita määrityksissä. Tässä työssä kehitettiin leimakoettimen ja oligonukleotidianalyytin muodostaman leimakoetinkompleksin siirtoon pohjautuva määritys epäspesifisestä sitoutumisesta aiheutuvan taustasignaalin poistamiseksi ja oligonukleotidimäärityksen herkkyyden parantamiseksi. Määrityksessä käänteisviritteiseen nanopartikkeliin liitetty hiuspinnikoetin sitoutuu oligonukleotidianalyytin toiseen päähän, ja nämä muodostavat leimakoetinkompleksin. Kiintokantajapinnalle kiinnitetty sitojakoetin sitoutuu analyytin vapaaseen päähän, jolloin leimakoetinkompleksi kiinnittyy sitojapinnalle. Pesun jälkeen leimakoetinkompleksi irrotetaan jalansijavälitteisesti lisäämällä reaktioon sitojakoettimelle komplementaarista, leimakoetinkompleksin syrjäyttävää oligonukleotidia. Syrjäyttävä oligonukleotidi sitoutuu sitojakoettimen yksijuosteiseen jalansijaan ja korvaa leimakoetinkompleksin sitojakoettimessa. Leimakoetinkompleksi vapautuu spesifisesti liuokseen, ja epäspesifisesti sitoutuneet leimat jäävät sitojapinnalle. Vapautunut leimakoetinkompleksi siirretään ja sidotaan uudelleen toiselle sitojapinnalle, jolloin analyytille spesifinen signaali voidaan mitata ilman epäspesifisesti sitoutuneen leiman aiheuttamaa taustasignaalia. Kompleksin siirrolla epäspesifinen taustasignaali saatiin poistettua lähes kokonaan, mikä paransi merkittävästi määrityksen herkkyyttä verrattuna määritykseen, jossa kompleksia ei siirretty. Kompleksin siirtomäärityksellä analyyttinen herkkyys oli 73 amol/l ja parannus herkkyydessä vertailumääritykseen verrattuna oli viisisataakertainen. Proteiinipitoisessa näytematriisissa herkkyys oli 800 amol/l ja parannus vertailumääritykseen verrattuna oli sataviisikymmentäkertainen. Leimakoetinkompleksin siirto on lupaava keino parantaa nukleiinihappomääritysten herkkyyttä.

The measured signal of an assay consists of background signal caused by reagents and the detector of the analyzer, background signal caused by non-specific binding of the label and the specific signal of the label. The sensitivity of an assay can be improved by improving the detectability of the label or limiting the non-specific binding of the label. Sensitive assays are needed for detecting circulating cell-free oligonucleotides such as microRNAs. MicroRNAs are potential biomarkers for different diseases. However, the small size and low concentrations of these molecules require great sensitivity from assays. For this thesis, an assay based on the transfer of oligonucleotide complex formed by label probe and analyte was developed to remove non-specific binding of the label and create a sensitive assay. In the first step of the assay, an upconverting nanoparticle conjugated label probe binds the analyte and label probe-analyte complex is formed. Then, the first solid support bound capture probe binds to the other end of the analyte, and the complex is bound to the solid support. After washing, the label probe-analyte complex is released specifically in a toehold mediated strand displacement reaction by adding an eluting oligonucleotide. Eluting oligonucleotide binds to a single stranded toehold of the capture probe and displaces the label probe-analyte complex. The complex is released into the solution while non-specifically bound labels remain on the first surface. Then, the complex is transferred and bound to a second solid support surface using a different capture probe. Signal is measured from the second surface eliminating the background signal caused by the non-specifically bound labels. The complex transfer assay removed most of the non-specific background signal and improved analytical sensitivity of the assay compared to an assay without complex transfer. Analytical sensitivity was 73 amol/L for the complex transfer assay. The improvement in analytical sensitivity was 500-fold compared to an assay without the complex transfer procedure. In a protein rich sample matrix, the analytical sensitivity of the assay was 800 amol/L and improvement was 150-fold. Complex transfer assay is a promising way to improve the sensitivity of oligonucleotide assays.
Keywords: oligonukleotidit, hybridisaatiomääritys, kompleksin siirto, jalansijavälitteiset korvausreaktiot, epäspesifinen sitoutuminen