Aktiivisuusmääritysmenetelmän kehittäminen kynureniiniaminotransferaaseille - Jakovleva, Jelena (My University, 2019)
Kynureniiniaminotransferaasientsyymit (engl. Kynurenine aminotransferase, KAT) osallistuvat tryptofaanin metaboliaan muuttamalla kynureniinin kynureenihapoksi irreversiibelissä transaminaatioreaktiossa. Kynureniiniaminotransferaaseista esiintyy neljää eri muotoa, jotka eroavat toisistaan rakenteellisesti substraatin tunnistamiskohdan suhteen, mutta toiminnaltaan ovat samankaltaisia ja niiden substraatti- ja inhibiittorimolekyylien profiileissa esiintyy samankaltaisuuksia. Keskushermostossa kynureenihapon poikkeavia pitoisuuksia havaitaan monien neurologisten sairauksien ja erilaisten terveydentilojen yhteydessä. Näin ollen KAT-entsyymien aktiivisuuden säätely nähdään mahdollisena keinona vaikuttaa kynureenihapon tasoihin. Tämän diplomityön tavoitteena oli kehittää aktiivisuusmääritysmenetelmä KAT-entsyymien aktiivisuuden tutkimiseksi entsyymien luonnollista toimintaympäristöä mallinnettavassa mallissa. Työhön valittiin KAT-entsyymejä eri suhteissa ilmentäviä eukaryoottisolulinjoja, joiden KAT-entsyymien ilmentymistä ja aktiivisuutta tutkittiin relatiivisen polymeraasiketjureaktion, Western Blot-analyysin ja aktiivisuusmääritysmenetelmän avulla. Aktiivisuusmäärityksen pohjana olevan entsymaattisen reaktioiden parametreja optimoitiin kunkin solulinjan ominaisuuksien mukaan. Reaktion lopputuote määriteltiin korkean erotuskyvyn nestekromatografian ja fluoresenssidetektorin avulla. Optimoidun aktiivisuusmääritysmenetelmän avulla voidaan luotettavasti määrittää KYNA:n pitoisuus solupohjaisesta reaktioliuoksesta ja tutkia KAT-entsyymien aktiivisuutta syöpäsolupohjaisissa malleissa. Entsyymitoimintaa moduloivan tekijän vaikutusta KYNA:n tuotantoon voidaan luotettavasti seurata optimoidulla aktiivisuusmäärityksellä. Aktiivisuusmääritysmenetelmän periaate voi olla käytettävissä myös muiden KAT-entsyymejä ilmentävien solulinjojen kanssa solulinjakohtaisin muokkauksin.
Keywords: KAT, kynureenihappo, eukaryoottisolulinjat, korkean erotuskyvyn nestekromatografia, kynurenic acid, eukaryotic cell lines, High Performance Liquid Chromatography