Lihasperäiselle kreatiinikinaasille spesifinen immunomääritys Duchennen lihasdystrofian seulontaa varten

Abstract

Duchennen lihasdystrofia (engl. Duchenne muscular dystrophy, DMD) on lähes pelkästään pojilla ilmenevä perinnöllinen lihasrappeumatauti, joka johtaa kuolemaan noin 25 vuoden iässä. Noin yksi 3500–6000 pojasta sairastaa DMD:tä. Taudin aiheuttaa X-kromosomissa sijaitsevan dystrofiinigeenin mutaatio, jonka seurauksena toimivaa, lihaksia koossapitävää dystrofiinia ei tuotu. Kliinisissä testeissä on lupaavia hoitoja, joten DMD:n vastasyntyneiden seulonnan aloittamista harkitaan. DMD:n seulonnassa analyyttina olisi mahdollista käyttää lihasperäistä kreatiinikinaasia (engl. muscle-type creatine kinase tai creatine kinase MM isoform, CK-MM), jota päätyy vereen lihassolujen vaurioituessa. DMD:tä sairastavilla vastasyntyneillä CK-MM:n määrä veressä on moninkertainen terveisiin vastasyntyneisiin verrattuna lihasten rappeutumisesta johtuen. Perinteisesti kreatiinikinaasia on mitattu entsyymiaktiivisuusmäärityksillä, jotka mittaavat kaikkia kreatiinikinaasimuotoja eli myös sydänperäistä ja aivoperäistä kreatiinikinaasia (CK-MB ja CK-BB).

Työn tarkoituksena oli kehittää kuivatuista veritäplistä tehtävä CK-MM:lle spesifinen kaksipuoleinen immunomääritys, joka olisi siirrettävissä PerkinElmerin automaattiselle GSP® Genetic Screening Processor -analysaattorille. Työ suoritettiin kolmessa vaiheessa. Ensimmäiseksi vertailtiin kaupallisesti saatavilla olevien CK-MM-vasta-aineiden affiniteetteja biosensorilla. Seuraavassa vaiheessa pystytettiin manuaalinen kaksipuoleinen immunomääritys käyttäen ensimmäisessä vaiheessa valittuja vasta-aineita ja optimoitiin immunomäärityksen parametreja. Lopuksi immunomääritys sovitettiin GSP-laitteelle.

Biosensorimittausten ja manuaalisten immunomääritysten tulosten perusteella valittiin kaksi potentiaalista leimavasta-ainetta ja yksi sitojavasta-aineeksi sopiva vasta-aine. Niitä käytettäessä määritys on melko spesifinen CK-MM:lle, sillä CK-BB ei tuottanut lainkaan signaalia ja CK-MB:n ristireaktiivisuus oli noin 7 %. GSP-laitteella mitattaessa DMD:tä sairastavien (n = 10) CK-MM-pitoisuuksien mediaani (vaihteluväli) oli 7590 ng/ml (1490–13400 ng/ml) ja terveiden vastasyntyneiden (n = 8) 165 ng/ml (108–263 ng/ml). Määrityksen dynaamista mittausaluetta ei vielä selvitetty, mutta alustavien mittausten perusteella se kattaa terveiden vastasyntyneiden pitoisuudet ja sairaiden pitoisuudet ainakin 8770 ng/ml asti, mikä mahdollistaa sairaiden erottumisen. Työssä kehitetty määritys vaikuttaa siis sopivalta DMD:n seulontaan vastasyntyneiltä.

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is an inheritable disorder, which causes muscle degeneration. DMD affects mostly boys and leads to death usually by the age of 25. About one boy in every 3500–6000 has DMD. The disease is caused by a mutation in the dystrophin gene in the X chromosome, which prevents the production of functional dystrophin protein that maintains the structure of muscles. Starting of the newborn screening program for DMD is being considered since promising treatments are on clinical trials. A potential analyte for screening is muscle-type creatine kinase (CK-MM), which is released in blood by damaged muscle cells. In blood of a newborn with DMD, CK-MM concentration is multiplied compared to that of a non-affected newborn because of degenerating muscles. Traditionally, the creatine kinase is measured with enzyme activity assays that measure all creatine kinase isoforms that include also heart-type creatine kinase and brain-type creatine kinase (CK-MB and CK-BB).

The purpose of this work was to develop a two-site Dried Blood Spot immunoassay specific to CK-MM which could be transferred to PerkinElmer’s automated GSP® Genetic Screening Processor. Work consisted of three main parts. First, the affinities of commercial antibodies were compared using a biosensor. Then a manual, two-site immunoassay was set up using antibodies selected in the first part and assay parameters were optimized. Last, the assay was transferred to GSP.

Based on the biosensor measurements and the manual immunoassays, two potential label antibodies and one capture antibody were selected. Using these antibodies, the assay was rather specific to CK-MM as there was no cross-reactivity with CK-BB and the cross-reactivity with CK-MB was about 7%. Using GSP, the median (range) of CK-MM concentrations of the affected (n = 10) was 7590 ng/ml (1490–13400 ng/ml) and the median of the non-affected newborns (n = 8) was 165 ng/ml (108–263 ng/ml). The dynamic range of the assay was not yet determined but the initial studies suggest that it covers the concentrations of the non-affected and the concentrations of the affected at least up to 8770 ng/ml, which enables distinction of the affected. Therefore, the newborn screening of DMD ought to be possible with the CK-MM immunoassay.