Kliinisten näytteiden PCR-yhteensopiva konsentrointi
Nylund, Sami (2017-06-20)
Kliinisten näytteiden PCR-yhteensopiva konsentrointi
Nylund, Sami
(20.06.2017)
Tätä artikkelia/julkaisua ei ole tallennettu UTUPubiin. Julkaisun tiedoissa voi kuitenkin olla linkki toisaalle tallennettuun artikkeliin / julkaisuun.
Turun yliopisto
Kuvaus
Siirretty Doriasta
Tiivistelmä
Kliiniset näytteet sisältävät inhibiittoreita ja komponentteja, jotka häiritsevät polymeraasiketjureaktioon (PCR, engl. polymerase chain reaction) perustuvia diagnostisia määrityksiä. Vähäisen kohdepatogeenin määrän takia tulee näytettä usein konsentroida PCR-määrityksen herkkyyden parantamiseksi. Näytteen puhdistus ja konsentrointi vaativat joko bakteerin viljelyä tai usein kallista instrumentointia vaativaa, monimutkaista ja työlästä käsittelyä, jossa käytetään haitallisia PCR:ää inhiboivia reagensseja. Potilasläheisessä käytössä PCR-määrityksen tulee olla täysin automatisoitu tai sisältää vain vähän näytteen manuaalisia käsittelyvaiheita.
B-ryhmän streptokokki (Streptococcus agalactiae, engl. Group B Streptococcus, GBS) on yleisin vakavien infektioiden aiheuttaja vastasyntyneillä. Bakteeri voi siirtyä äidiltä lapselle synnytyksen aikana ja aiheuttaa vakavan infektion ensimmäisten elinpäivien aikana. GBS seulotaan raskausviikoilla 35−37 vagina-rektaalisivelynäytteestä, jota suositellaan rikastusviljeltävän ennen GBS-määritystä. Tuloksen mukaan äidille annetaan synnytyksen aikana antibioottihoitoa. Seulonnassa suositellaan siirryttäväksi suoraan sivelynäytteestä tehtävään synnytyksenaikaiseen ja potilasläheiseen nukleiinihappomääritykseen.
Diplomityön tavoitteena oli kartoittaa manuaalista ja PCR-yhteensopivaa kliinisten näytteiden konsentrointimenetelmää Abacus Diagnostica Oy:n GenomEra®-määritysalustalle. Työssä vertailtiin kaupallisia näytteen puhdistus- ja konsentrointisovelluksia. Parhaaksi arvioidulla sovelluksella suoritettiin toteutettavuustutkimus sen käytöstä suorien GBS-sivelynäytteiden käsittelyssä. Käsittelystä pyrittiin muokkaamaan mahdollisimman nopea ja yksinkertainen, jotta sitä voitaisiin käyttää potilasläheisessä GenomEra® GBS -testissä. Tutkimukseen valittiin DNA-eristysmenetelmä, joka perustuu pintavaraukseltaan pH-riippuvaisella ioninvaihtomatriisilla pinnoitettuihin paramagneettisiin partikkeleihin. Alhaisessa pH:ssa positiivisesti varautuneet partikkelit sitovat DNA:ta. DNA eluoidaan pH:ssa 8,5 partikkelien pintavarauksen neutraloituessa.
Työssä onnistuttiin kehittämään GenomEra®-määritysalustalle soveltuva näytteen käsittelymenetelmä, jolla näyte puhdistetaan ja konsentroidaan alle 10 minuutissa. Menetelmällä todettiin olevan potentiaalia suorien GBS-sivelynäytteiden käsittelyyn. Sen suurimpina etuina ovat vähäinen instrumentointitarve ja miedot PCR-yhteensopivat reagenssit. Manuaalisena menetelmänä se ei välttämättä sovellu suoraan potilasläheiseen ympäristöön, mutta se tarjoaa mahdollisuuden täysin automatisoidun näytteenkäsittelyn kehittämiseen GenomEra®-määritysalustalle tulevaisuudessa.
B-ryhmän streptokokki (Streptococcus agalactiae, engl. Group B Streptococcus, GBS) on yleisin vakavien infektioiden aiheuttaja vastasyntyneillä. Bakteeri voi siirtyä äidiltä lapselle synnytyksen aikana ja aiheuttaa vakavan infektion ensimmäisten elinpäivien aikana. GBS seulotaan raskausviikoilla 35−37 vagina-rektaalisivelynäytteestä, jota suositellaan rikastusviljeltävän ennen GBS-määritystä. Tuloksen mukaan äidille annetaan synnytyksen aikana antibioottihoitoa. Seulonnassa suositellaan siirryttäväksi suoraan sivelynäytteestä tehtävään synnytyksenaikaiseen ja potilasläheiseen nukleiinihappomääritykseen.
Diplomityön tavoitteena oli kartoittaa manuaalista ja PCR-yhteensopivaa kliinisten näytteiden konsentrointimenetelmää Abacus Diagnostica Oy:n GenomEra®-määritysalustalle. Työssä vertailtiin kaupallisia näytteen puhdistus- ja konsentrointisovelluksia. Parhaaksi arvioidulla sovelluksella suoritettiin toteutettavuustutkimus sen käytöstä suorien GBS-sivelynäytteiden käsittelyssä. Käsittelystä pyrittiin muokkaamaan mahdollisimman nopea ja yksinkertainen, jotta sitä voitaisiin käyttää potilasläheisessä GenomEra® GBS -testissä. Tutkimukseen valittiin DNA-eristysmenetelmä, joka perustuu pintavaraukseltaan pH-riippuvaisella ioninvaihtomatriisilla pinnoitettuihin paramagneettisiin partikkeleihin. Alhaisessa pH:ssa positiivisesti varautuneet partikkelit sitovat DNA:ta. DNA eluoidaan pH:ssa 8,5 partikkelien pintavarauksen neutraloituessa.
Työssä onnistuttiin kehittämään GenomEra®-määritysalustalle soveltuva näytteen käsittelymenetelmä, jolla näyte puhdistetaan ja konsentroidaan alle 10 minuutissa. Menetelmällä todettiin olevan potentiaalia suorien GBS-sivelynäytteiden käsittelyyn. Sen suurimpina etuina ovat vähäinen instrumentointitarve ja miedot PCR-yhteensopivat reagenssit. Manuaalisena menetelmänä se ei välttämättä sovellu suoraan potilasläheiseen ympäristöön, mutta se tarjoaa mahdollisuuden täysin automatisoidun näytteenkäsittelyn kehittämiseen GenomEra®-määritysalustalle tulevaisuudessa.