Nukleiinihappopohjaiset määritysmenetelmät veden mikrobiologisessa diagnostiikassa ja vesiympäristössä elävien haitallisten mikrobien moniparametrinen havaitsemismenetelmä
Preede, Mikko (2017-10-11)
Nukleiinihappopohjaiset määritysmenetelmät veden mikrobiologisessa diagnostiikassa ja vesiympäristössä elävien haitallisten mikrobien moniparametrinen havaitsemismenetelmä
Preede, Mikko
(11.10.2017)
Tätä artikkelia/julkaisua ei ole tallennettu UTUPubiin. Julkaisun tiedoissa voi kuitenkin olla linkki toisaalle tallennettuun artikkeliin / julkaisuun.
Turun yliopisto
Tiivistelmä
Parantuneesta hygieniasta huolimatta saastunut vesi on yhä iso ongelma monessa maassa. Veden haitallisuuteen voivat vaikuttaa niin bakteerit kuin viruksetkin, mutta myös toksiineja tuottavat syanobakteerit.
Perinteisten kasvatukseen perustuvien määritysten tilalle on yhä enemmissä määrin tullut nukleiinihappopohjaisia menetelmiä. Näitä ovat muun muassa polymeraasiketjureaktio, DNA mikroarray, fluorenssi in situ hybridisaatio sekä seuraavan sukupolven DNA-sekvensointimenetelmät kuten pyrosekvensointi ja Illumina-teknologia. Solujen keräämiseen käytetyt tekniikat ovat avainasemassa määritysten onnistumiseen ja joissakin tekniikoissa vaaditaan myös nukleiinihappojen erillinen eristys.
Työssä pyrittiin luomaan määritys, jolla voitaisiin tunnistaa samalla kertaa useampi toksiinia tuottava syanobakteeri. Määritys tehtiin saksitoksiinille sekä mikrokystiinille. Siinä vesinäytteistä eristetylle syanobakteeri-DNA:lle tehtiin ensin yhtäaikainen ligaatio sekä asymmetrinen PCR. Kohteen tunnistus tapahtui toksiinin tuottoon liittyvien geenien havaitsemisella spesifisillä ligaatiokoettimilla. Ligaation ja PCR:n jälkeen tuotteille suoritettiin kelaattikomplementaatiodetektio kaivon pohjaan sidottujen kaappausoligonukleotidien ja kelaattikomplementaatiokoetinten avulla. Siitä kehitettiin kaksi erilaista versiota, joista toisessa molemmat kelaattikomplementaatio koettimet olivat vapaana liuoksessa sekä toinen versio, jossa kaappausoligonukleotidi oli leimattu ja liuoksessa oli vain yksi kelaattikomplementaatiokoetin. Jälkimmäisen etuna oli se, että se ei tarvitse pesua ennen määritystä.
Määrityksellä pystyttiin erottamaan toisistaan mikrokystiiniä tuottavat ja tuottamattomat kannat toisistaan. Lisäksi todistettiin sen mahdollinen toimivuus saksitoksiinia tuottavien syanobakteerien havaitsemiseen. Määritystä pystyttäisiin kehittämään tunnistamaan myös useampia eri toksiineita tuottavia syanobakteereita.Testillä on potentiaalia tulla luotettavaksi ja nopeaksi määritystavaksi toksiineja tuottaville syanobakteereille.
Perinteisten kasvatukseen perustuvien määritysten tilalle on yhä enemmissä määrin tullut nukleiinihappopohjaisia menetelmiä. Näitä ovat muun muassa polymeraasiketjureaktio, DNA mikroarray, fluorenssi in situ hybridisaatio sekä seuraavan sukupolven DNA-sekvensointimenetelmät kuten pyrosekvensointi ja Illumina-teknologia. Solujen keräämiseen käytetyt tekniikat ovat avainasemassa määritysten onnistumiseen ja joissakin tekniikoissa vaaditaan myös nukleiinihappojen erillinen eristys.
Työssä pyrittiin luomaan määritys, jolla voitaisiin tunnistaa samalla kertaa useampi toksiinia tuottava syanobakteeri. Määritys tehtiin saksitoksiinille sekä mikrokystiinille. Siinä vesinäytteistä eristetylle syanobakteeri-DNA:lle tehtiin ensin yhtäaikainen ligaatio sekä asymmetrinen PCR. Kohteen tunnistus tapahtui toksiinin tuottoon liittyvien geenien havaitsemisella spesifisillä ligaatiokoettimilla. Ligaation ja PCR:n jälkeen tuotteille suoritettiin kelaattikomplementaatiodetektio kaivon pohjaan sidottujen kaappausoligonukleotidien ja kelaattikomplementaatiokoetinten avulla. Siitä kehitettiin kaksi erilaista versiota, joista toisessa molemmat kelaattikomplementaatio koettimet olivat vapaana liuoksessa sekä toinen versio, jossa kaappausoligonukleotidi oli leimattu ja liuoksessa oli vain yksi kelaattikomplementaatiokoetin. Jälkimmäisen etuna oli se, että se ei tarvitse pesua ennen määritystä.
Määrityksellä pystyttiin erottamaan toisistaan mikrokystiiniä tuottavat ja tuottamattomat kannat toisistaan. Lisäksi todistettiin sen mahdollinen toimivuus saksitoksiinia tuottavien syanobakteerien havaitsemiseen. Määritystä pystyttäisiin kehittämään tunnistamaan myös useampia eri toksiineita tuottavia syanobakteereita.Testillä on potentiaalia tulla luotettavaksi ja nopeaksi määritystavaksi toksiineja tuottaville syanobakteereille.