Infektiivisen pikornaviruksen tuottaminen virus-RNA:sta

Abstract

Pikornavirukset ovat vaipattomia RNA-viruksia, joiden genomi muodostuu yksinauhaisesta positiivissäikeisestä RNA:sta. Pikornavirukset kuuluvat Picornaviridae-heimoon ja ne ovat yleisimpiä ihmisen taudinaiheuttajia. Suurin osa pikornavirusinfektioista on oireettomia. Tyypillisin oireinen tauti on nuhakuume, mutta tämän lisäksi pikornavirukset aiheuttavat laajan kirjon vakavampia tautitiloja kuten aivokalvontulehdusta, velttohalvausta ja maksa- ja sydänlihastulehdusta. Työn tavoitteena oli selvittää, miten viruksesta tehdystä cDNA-kloonista saadaan tuotettua uusia lisääntymiskykyisiä viruspartikkeleita. Tätä tutkittiin transfektoimalla soluihin joko suoraan virusgenomin sisältävää rengasmaista plasmidia (cDNA-kloonia) tai sen linearisoitua muotoa (linearisointi tapahtui virusgenomin 3´-päästä), samasta plasmidista tuotettua in vitro -transkriptoitua RNA:ta (IVT-RNA) tai samasta plasmidista tuotettua PCR-tuotetta. Viruksen lisääntymistä havainnoitiin immunofluoresenssimikroskopialla. Kaikki neljä cDNA-muotoa tuottivat yllättäen lisääntymiskykyisiä viruksia. Tuottomenetelmiä käytettiin muokattujen virusten ominaisuuksien tutkimiseen. Tutkittavina viruksina käytettiin pikornavirus-sukuun kuuluvia ihmisen parechovirus 1:tä (HPeV-1) ja sen mutanttimuotoa HPeV-1-RGDdel, jonka genomista on poistettu kolmen aminohapon pituinen RGD-alue, ja coxsackievirus A9 -kantaa (CV-A9) ja tämän mutanttimuotoa CV-A9-eGFP, jossa virusgenomiin on lisätty eGFP:tä eli vihreää fluoresoivaa proteiinia tuottava geeni. RGD-alueen vaikutusta HPeV-1-viruksen infektiokykyyn tutkittiin ihmisen keuhkokarsinoomasoluilla. RGD-alueella näytti olevan selvä vaikutus infektiokykyyn, koska HPeV-1-villityyppi kykeni infektoimaan solut, kun taas HPeV-1-RGDdel ei kyennyt. CV-A9-eGFP-infektiota seurattiin reaaliajassa EVOS FL AUTO -fluoresenssimikroskoopilla kahdessa solulinjassa: ihmisen keuhkokarsinoomasoluissa ja viherapinan munuaissoluissa. Viruksen etenemisen kuvantaminen reaaliaikaisesti osoittautui mahdolliseksi käytetyillä koeasetelmilla.