Luustolihasvauriot ja niiden merkkiaineet sekä faaginäyttötekniikalla uusia vasta-aineita luustolihasperäiselle troponiini I:lle
Lammi, Susanna (2018-02-27)
Luustolihasvauriot ja niiden merkkiaineet sekä faaginäyttötekniikalla uusia vasta-aineita luustolihasperäiselle troponiini I:lle
Lammi, Susanna
(27.02.2018)
Tätä artikkelia/julkaisua ei ole tallennettu UTUPubiin. Julkaisun tiedoissa voi kuitenkin olla linkki toisaalle tallennettuun artikkeliin / julkaisuun.
Turun yliopisto
Tiivistelmä
Troponiinit I, T ja C ovat poikkijuovaisten lihasten (sydän- ja luustolihakset) rakenneproteiineja, jotka säätelevät lihasten supistumista. Sydän- ja luustolihasten vaurioitumisen seurauksena troponiineja vapautuu verenkiertoon, josta niitä pystytään mittaamaan immunomääritysten avulla. Koska troponiinit I ja T ovat erilaisia luustolihaksissa (engl. skeletal troponin, skTn) ja sydänlihaksessa (engl. cardiac troponin, cTn), pidetään niitä varsin spesifisinä merkkiaineina. cTnI ja cTnT ovat vakiinnuttaneet asemansa sydäninfarktin merkkiaineina. Toisaalta skTnI:tä pidetään mahdollisena merkkiaineena luustolihassairauksien diagnosoinnissa, mutta tutkimusta asiasta on vähän. Kaupallisia skTnI-määrityksiä ei ole, eikä tällä hetkellä markkinoilla ei ole juurikaan skTnI-spesifisiä vasta-aineita.
Luustolihasperäisen troponiini I:n käyttöä mahdollisena luustolihasvaurion spesifisenä merkkiaineena ei ole tutkittu paljon. Osasyynä tähän on spesifisten vasta-aineiden puute. Nykyään uusia vasta-aineita etsitään ja tuotetaan erilaisin in vitro -tekniikoin, joista faaginäyttötekniikka on tehokkuuden ja yksinkertaisuuden vuoksi yksi parhaimmista. Sen avulla voidaan tunnistaa ja löytää laajoista rekombinanttisista vasta-ainekirjastoista erittäin korkean affiniteetin omaavia vasta-aineita erilaisia molekyylejä vastaan. Uusien skTnI-spesifisten vasta-aineiden avulla pystyttäisiin kehittämään herkkiä skTnI-spesifisiä määrityksiä mittaamaan muun muassa skTnI-pitoisuudet terveiden ja sairaiden verestä. Tätä kautta pystyttäisiin tutkia skTnI:n asemaa kliinisenä merkkiaineena ja mahdollistaa entistä spesifisimpien vasta-aineiden ja herkkien määritysten luominen kaupallisiin tarkoituksiin.
Työssä etsittiin faaginäyttötekniikan avulla uusia skTnI:n tunnistavia vasta-aineita, jotka mahdollistaisivat herkän skTnI-immunomäärityksen kehittämisen. Vasta-aineet rikastettiin Turun yliopistossa valmistetuista synteettisistä vasta-ainekirjastoista faaginäyttötekniikalla. Rikastetuista kirjastoista eristettiin 396 vasta-ainesitojaa, jotka kloonattiin tuottovektoriin scFv-sitojavasta-aineiden (engl. single chain variable fragment, scFv) tuottamiseksi. Parhaat vasta-ainesitojat seulottiin mittaamalla niiden aktiivisuus skTnI:tä ja ristireaktiivisuus cTn:tä vastaan immunomäärityksissä. Tulosten perusteella valittiin 75 vasta-ainesitojaa, jotka sekvensoitiin ja FASTR-kloonattiin Fab-vasta-aineita (engl. fragment antigen-binging, Fab) tuottavaan muotoon. Myös Fab-vasta-aineiden aktiivisuus skTnI:tä ja ristireaktiivisuus cTn:tä vastaan selvitettiin immunomäärityksin sekä sekvensoitiin. Valituista 75 scFv-sitojasta 60 vasta-ainesitojaa osoittautui erilaiseksi CDR-H3 loopinsa perusteella. Fab-muodossa olevat vasta-aineet tunnistavat skTnI:tä heikommin kuin scFV-muodossa olevat vasta-aineet.
Luustolihasperäisen troponiini I:n käyttöä mahdollisena luustolihasvaurion spesifisenä merkkiaineena ei ole tutkittu paljon. Osasyynä tähän on spesifisten vasta-aineiden puute. Nykyään uusia vasta-aineita etsitään ja tuotetaan erilaisin in vitro -tekniikoin, joista faaginäyttötekniikka on tehokkuuden ja yksinkertaisuuden vuoksi yksi parhaimmista. Sen avulla voidaan tunnistaa ja löytää laajoista rekombinanttisista vasta-ainekirjastoista erittäin korkean affiniteetin omaavia vasta-aineita erilaisia molekyylejä vastaan. Uusien skTnI-spesifisten vasta-aineiden avulla pystyttäisiin kehittämään herkkiä skTnI-spesifisiä määrityksiä mittaamaan muun muassa skTnI-pitoisuudet terveiden ja sairaiden verestä. Tätä kautta pystyttäisiin tutkia skTnI:n asemaa kliinisenä merkkiaineena ja mahdollistaa entistä spesifisimpien vasta-aineiden ja herkkien määritysten luominen kaupallisiin tarkoituksiin.
Työssä etsittiin faaginäyttötekniikan avulla uusia skTnI:n tunnistavia vasta-aineita, jotka mahdollistaisivat herkän skTnI-immunomäärityksen kehittämisen. Vasta-aineet rikastettiin Turun yliopistossa valmistetuista synteettisistä vasta-ainekirjastoista faaginäyttötekniikalla. Rikastetuista kirjastoista eristettiin 396 vasta-ainesitojaa, jotka kloonattiin tuottovektoriin scFv-sitojavasta-aineiden (engl. single chain variable fragment, scFv) tuottamiseksi. Parhaat vasta-ainesitojat seulottiin mittaamalla niiden aktiivisuus skTnI:tä ja ristireaktiivisuus cTn:tä vastaan immunomäärityksissä. Tulosten perusteella valittiin 75 vasta-ainesitojaa, jotka sekvensoitiin ja FASTR-kloonattiin Fab-vasta-aineita (engl. fragment antigen-binging, Fab) tuottavaan muotoon. Myös Fab-vasta-aineiden aktiivisuus skTnI:tä ja ristireaktiivisuus cTn:tä vastaan selvitettiin immunomäärityksin sekä sekvensoitiin. Valituista 75 scFv-sitojasta 60 vasta-ainesitojaa osoittautui erilaiseksi CDR-H3 loopinsa perusteella. Fab-muodossa olevat vasta-aineet tunnistavat skTnI:tä heikommin kuin scFV-muodossa olevat vasta-aineet.