Embigiini - uusi fibronektiinireseptori

Abstract

Embigiini (GP-70, lyhenne EMB) on immunoglobuliinisuperperheeseen kuuluva solukalvon runsaasti glykosyloitu proteiini. Se löydettiin jo 1988, mutta sen toiminta on edelleen huonosti tunnettu. Se on luultavasti tärkeä proteiini alkionkehityksessä, koska se ilmentyy voimakkaasti alkionkehityksen alkuvaiheessa. Se toimii avustajaproteiinina monokarboksylaattitransportteri-2-proteiinille (MCT2) ja saattaa voimistaa integriinivälitteistä soluadheesiota. Se saattaa liittyä solun kasvuun ja kehitykseen ja välittää solun ja solun ulkopuolisen matriksin välisiä vuorovaikutuksia, joten sillä voi olla merkittävä tehtävä soluadheesiossa.

Aiemmin ryhmässämme ihmisen embigiinin solun ulkopuolisen osan on havaittu sitoutuvan soluväliaineproteiineista erityisesti fibronektiiniin. Tutkimuksen tavoitteena oli selvittää embigiinin toimintaa fibronektiinireseptorina tutkimalla proteiinitasolla sen sitoutumismekanismia fibronektiiniin ja solutasolla sen tehtävää soluadheesiossa luomalla ihmisen embigiinihiljennetty (EMB KO) solulinja. Embigiinin solun ulkopuolista osaa tuotettiin Escherichia coli -soluissa villityyppinä ja viitenä erilaisena mutaatiosettinä ja näiden sitoutumista fibronektiiniin tutkittiin EuLISA-kokeissa. Lisäksi embigiinin homofiilistä sitoutumista yritettiin tutkia Biacore-laitteella. Solutasolla embigiini yritettiin hiljentää ihmisen MG-63-osteosarkoomasoluista CRISPR/Cas9-menetelmällä. EMB KO -solujen embigiinitasoja tarkasteltiin kvantitatiivisella polymeraasiketjureaktiolla, western blot -menetelmällä (WB) sekä immunofluresenssimikroskopiassa. Lisäksi niiden sitoutumista ja leviämistä fibronektiinille mitattiin xCELLigence-laitteella. Hiljennystä yritettiin myös DU145-eturauhassyöpäsoluista lentiviruksiin perustuvalla hiljennysmenetelmällä. Lisäksi useita eri embigiinivasta-aineita vertailtiin keskenään WB:ssa.

Embigiinin tarttuminen fibronektiiniin toistettiin onnistuneesti, mutta minkään fibronektiinisitoutumisessa tärkeäksi ajatellun kohdan mutatoiminen ei estänyt sitoutumista. Sitoutumismekanismi jäi vielä epäselväksi, mutta saadut tulokset auttavat sitoutumisen mallitusta tulevaisuudessa. Embigiini-embigiini-homofiilistä sitoutumista ei havaittu, mutta tämän tutkimus jäi vielä kesken. Solutasolla osa CRISPR/Cas9-hiljennetyistä soluista oli EMB KO heterotsygootteja (EMB+/-), mutta ei homotsygootteja (EMB-/-). EMB+/--solut eivät eronneet villityypin soluista, joten osittainen hiljennys ei ollut riittävä. Lentivirushiljennys ei onnistunut DU145-soluissa luultavasti teknisen ongelman vuoksi. Eri embigiinivasta-aineet erosivat toisistaan paljon ja suuri osa niistä saattaa olla epäspesifisiä. Hiiren embigiinivasta-aine vaikutti lupaavalta, ja siksi embigiinin tutkimuksessa ollaan siirtymässä hiirimalliin.