Vasta-ainepinnan sitomiskapasiteetin kasvattaminen katodiseen elektrokemiluminesenssiin perustuvassa määrityksessä

Abstract

Katodinen elektrokemiluminesenssi perustuu korkeaenergisten, eli niin sanottujen kuumien elektronien muodostumiseen vahvan katodisen pulssipolarisaation aikana. Kuumat elektronit tunneloituvat johteesta ohuen eristekerroksen läpi suoraan elektrolyyttiliuokseen, jossa ne muodostavat hapettavia radikaaleja. Kuumat elektronit ja niiden muodostamat radikaalit pystyvät tuottamaan kemiluminesenssia yhdisteistä, joita on normaalisti vaikea virittää kemiallisesti vesiliuoksessa. Kyseistä mittatekniikkaa hyödyntävässä immunomäärityksessä vasta-aineet kiinnitetään eristävällä oksidikerroksella pinnoitetulle piisirulle fysikaalisella adsorptiolla. Tällä päällystysmenetelmällä vasta-aineiden orientaatio vaihtelee, eivätkä kaikki vasta-aineet pysty osallistumaan antigeenin sitomiseen. Lisäksi vuorovaikutus kiinteän pinnan kanssa voi osittain muuttaa vasta-aineen konformaatiota, jolloin vasta-aineen biologinen aktiivisuus saattaa kärsiä. Työn tarkoituksena oli kasvattaa vasta-ainepinnan sitomiskapasiteettia kiinnittämällä vasta-aineet piisirun piidioksidipinnalle paremmassa orientaatiossa kuin fysikaalisella adsorptiolla on mahdollista. Tavoitteen saavuttamiseksi vasta-aineet kiinnitettiin piisirulle kovalenttisesti tai proteiini A:n tai Si-tag-proteiini A:n välityksellä. Proteiini A sitoutuu vasta-aineen kiteytyvään osaan (engl. fragment crystallizable, Fc), mikä takaa sen, että vasta-aineen antigeenia sitovat alueet jäävät saataville. Si-tag-proteiini A on ribosomaalisesta proteiini L2:sta ja proteiini A:sta koostuva rekombinanttiproteiini, jonka Si-tag-osa sitoutuu vahvasti piidioksidiin. Näin proteiini A on mahdollista kiinnittää piisirulle tehokkaasti ja kohdennetusti. Kovalenttisessa päällystysmenetelmässä piidioksidipinta silanoitiin 3-aminopropyylitrietoksisilaanilla, jonka vapaisiin aminoryhmiin vasta-aineet kiinnitettiin kovalenttisin sidoksin glutaraldehydin välityksellä. Eri päällystysmenetelmien tehokkuutta testattiin C-reaktiivista proteiinia (CRP) mallianalyyttinä hyödyntävässä immunomäärityksessä. Proteiini A ja Si-tag-proteiini A toimivat immunomäärityksessä heikommin kuin fysikaalinen adsorptio. Tämä johtuu todennäköisesti siitä, että proteiini A sitoi sitojavasta-ainetta heikosti. Kovalenttisella päällystyksellä määrityksen signaali-taustasuhteet olivat jopa kaksi kertaa paremmat kuin fysikaalisella adsorptiolla. Lisäksi CRP-määrityksen alustava herkkyys oli kolme kertaa matalampi kovalenttisella päällystysmenetelmällä kuin fysikaalisella adsorptiolla. Vasta-aineiden sitomiskapasiteettia pystyttiin kasvattamaan kovalenttisella päällystyksellä, mikä mahdollistaa fysikaalista adsorptiota paremman herkkyyden saavuttamisen.