Nopean nukleiinihappojen eristysmenetelmän kehittäminen osaksi zikavirus PCR -testiä
Hirvonen, Tatu (2020-03-23)
Nopean nukleiinihappojen eristysmenetelmän kehittäminen osaksi zikavirus PCR -testiä
Hirvonen, Tatu
(23.03.2020)
Julkaisu on tekijänoikeussäännösten alainen. Teosta voi lukea ja tulostaa henkilökohtaista käyttöä varten. Käyttö kaupallisiin tarkoituksiin on kielletty.
suljettu
Julkaisun pysyvä osoite on:
https://urn.fi/URN:NBN:fi-fe2020042019430
https://urn.fi/URN:NBN:fi-fe2020042019430
Tiivistelmä
Zikavirustartunta raskaana olevalla naisella voi aiheuttaa sikiön mikrokefaliaa eli pienipäisyyttä. Flaviviruksiin kuuluva zikavirus leviää pääosin Aedes suvun hyttysten toimesta sekä seksuaalikontaktissa. Äidillä zikavirustartunta ilmenee flunssamaisina oireina, mutta se voi olla myös oireeton. Taudin vaikeasti tunnistettavien oireiden takia tautia ei usein havaita ajoissa, mikä johtaa taudin leviämiseen. Taudin toteamisen työkaluna käytettäviä määrityksiä on mahdollista kehittää saataville niukkaresurssisessa ympäristössä. Näytteen esikäsittelymenetelmä on osa määritystä, jossa eristetään analyytti muusta näytteestä, joka mahdollisesti haittaa määrityksen toimintaa. Tässä diplomityössä kehitettiin zikavirus käänteistranskriptaasi polymeraasiketjureaktio (RT-PCR) -testille nopea, helppokäyttöinen ja sähkövapaa näytteen esikäsittelymenetelmä.
Esikäsittelymenetelmä suoritettiin läpinäkyvän putken sisällä ja se koostui kolmesta päävaiheesta: lyysis- ja sitoutumisvaihe, pesuvaihe ja eluutiovaihe. Näytteinä käytettiin zikaviruspartikkeleita ja Escherichia colin MS2-bakteriofagia. Näytteen nukleiinihapot vapautettiin guanidiinia sisältävässä lyysis- ja sitoutumispuskurissa, jossa ne sitoutuivat silikapäällysteisten magneettipartikkelien (SMP) pintaan. SMP:t siirrettiin tästä puskurista ilmafaasin kautta pesupuskuriin, jossa SMP:ien mukana liikkunut guanidiini pestiin pois. Pesuvaiheita oli 1–3 kappaletta, joiden jälkeen SMP:t siirrettiin ilmafaasin kautta eluutiopuskuriin, jonne nukleiinihapot vapautuivat. Eluutiopuskurissa oleva zikavirus ja MS2 bakteriofagin RNA käytettiin RT-PCR:n näytteenä. Näytematriisia simuloitiin lisäämällä keskivirtsanäytteeseen templaattia. Näytteen esikäsittelymenetelmän tehokkuutta tutkittiin käyttäen referenssinä kaupallista SMP:ien huuhtelumenetelmää.
Nukleiinihappojen eristys pystyttiin tekemään ilman nesteiden käsittelyä viidessä minuutissa 53,6 % saannolla. Kahdesta eri SMP:sta mikrometri kokoluokan partikkelit havaittiin sitovan tehokkaammin nukleiinihappoja kuin nanometri kokoluokan SMP:t. Pesuvaiheiden sopivimmaksi määräksi osoittautui yksi, suuren nestetilavuuden pesu. Eluutioliuoksen ei havaittu inhiboivan RT-PCR:ta ja menetelmällä onnistuttiin eristämään nukleiinihappoja keskivirtsanäytteestä.
Diplomityössä kehitetty sähkövapaa esikäsittelymenetelmä todettiin konseptiltaan toimivaksi. Menetelmä on vaihtoehto mahdollistamaan vieritestien saatavuutta niukkaresurssisessa ympäristössä. Sähkövapaa automatisaatio on mahdollinen kehityssuunta menetelmälle tuomaan sitä helppokäyttöisemmäksi käyttäjälle ilman laboratoriokoulutusta. A Zika virus infection in a pregnant woman can cause microcephaly in the fetus. Zika virus belongs to the flaviviridae family and spreads mainly via Aedes mosquitoes and sexual transmission. The zika virus infection has symptoms that are flu-like, but it can be symptomless also. Because the symptoms are difficult to identify the infection cannot be diagnosed early on. This leads to the spreading of the disease. Diagnostic tools and assays can be developed to be available at a low-resource environment. Sample preparation is part of an assay in which the analyte is extracted from the rest of the sample that can hinder the assay. In this work a rapid, easy-to-use and electricity-free nucleic acid extraction technique was developed and integrated into a reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) assay.
The extraction protocol was performed inside a transparent tube and it was performed in three phases: lysis and binding phase, wash phase and elution phase. The used samples were Zika virus particles and MS2 bacteriophages. Nucleic acids were released from the particles in lysis and binding buffer that contained guanidine and the nucleic acids were bound to silica coated magnetic particles (SMP). The SMPs were moved through an air phase to the wash buffer that washes away residual guanidine. After 1–3 wash phases were performed the SMPs were moved through an air phase to the elution buffer to release the nucleic acids from SMPs. The elution buffer was used as a PCR sample. A simulated sample matrix was also tested by spiking urine with templates. The protocol’s performance was studied comparing it to a commercial protocol.
Nucleic acid extraction was possible to perform without liquid handling under five minutes with a yield of 53,6 %. Micrometer scale SMPs performed better than nanometer scale SMPs. The best performance wash phase was achieved with one high volume wash. Elution did not cause PCR inhibition and nucleic acids were successfully extracted from a urine matrix.
This thesis demonstrated a proof of concept in the developed electricity-free nucleic acid extraction. The technique is an alternative to make point-of-care tests more accessible in low-resource environments. Further development for the technique could be an electricity-free automation to improve the accessibility even further.
Esikäsittelymenetelmä suoritettiin läpinäkyvän putken sisällä ja se koostui kolmesta päävaiheesta: lyysis- ja sitoutumisvaihe, pesuvaihe ja eluutiovaihe. Näytteinä käytettiin zikaviruspartikkeleita ja Escherichia colin MS2-bakteriofagia. Näytteen nukleiinihapot vapautettiin guanidiinia sisältävässä lyysis- ja sitoutumispuskurissa, jossa ne sitoutuivat silikapäällysteisten magneettipartikkelien (SMP) pintaan. SMP:t siirrettiin tästä puskurista ilmafaasin kautta pesupuskuriin, jossa SMP:ien mukana liikkunut guanidiini pestiin pois. Pesuvaiheita oli 1–3 kappaletta, joiden jälkeen SMP:t siirrettiin ilmafaasin kautta eluutiopuskuriin, jonne nukleiinihapot vapautuivat. Eluutiopuskurissa oleva zikavirus ja MS2 bakteriofagin RNA käytettiin RT-PCR:n näytteenä. Näytematriisia simuloitiin lisäämällä keskivirtsanäytteeseen templaattia. Näytteen esikäsittelymenetelmän tehokkuutta tutkittiin käyttäen referenssinä kaupallista SMP:ien huuhtelumenetelmää.
Nukleiinihappojen eristys pystyttiin tekemään ilman nesteiden käsittelyä viidessä minuutissa 53,6 % saannolla. Kahdesta eri SMP:sta mikrometri kokoluokan partikkelit havaittiin sitovan tehokkaammin nukleiinihappoja kuin nanometri kokoluokan SMP:t. Pesuvaiheiden sopivimmaksi määräksi osoittautui yksi, suuren nestetilavuuden pesu. Eluutioliuoksen ei havaittu inhiboivan RT-PCR:ta ja menetelmällä onnistuttiin eristämään nukleiinihappoja keskivirtsanäytteestä.
Diplomityössä kehitetty sähkövapaa esikäsittelymenetelmä todettiin konseptiltaan toimivaksi. Menetelmä on vaihtoehto mahdollistamaan vieritestien saatavuutta niukkaresurssisessa ympäristössä. Sähkövapaa automatisaatio on mahdollinen kehityssuunta menetelmälle tuomaan sitä helppokäyttöisemmäksi käyttäjälle ilman laboratoriokoulutusta.
The extraction protocol was performed inside a transparent tube and it was performed in three phases: lysis and binding phase, wash phase and elution phase. The used samples were Zika virus particles and MS2 bacteriophages. Nucleic acids were released from the particles in lysis and binding buffer that contained guanidine and the nucleic acids were bound to silica coated magnetic particles (SMP). The SMPs were moved through an air phase to the wash buffer that washes away residual guanidine. After 1–3 wash phases were performed the SMPs were moved through an air phase to the elution buffer to release the nucleic acids from SMPs. The elution buffer was used as a PCR sample. A simulated sample matrix was also tested by spiking urine with templates. The protocol’s performance was studied comparing it to a commercial protocol.
Nucleic acid extraction was possible to perform without liquid handling under five minutes with a yield of 53,6 %. Micrometer scale SMPs performed better than nanometer scale SMPs. The best performance wash phase was achieved with one high volume wash. Elution did not cause PCR inhibition and nucleic acids were successfully extracted from a urine matrix.
This thesis demonstrated a proof of concept in the developed electricity-free nucleic acid extraction. The technique is an alternative to make point-of-care tests more accessible in low-resource environments. Further development for the technique could be an electricity-free automation to improve the accessibility even further.