Sähkökemiallisen leima- ja pesuvapaan DNA-sensorin kehittäminen PCR-pohjaiseen nukleiinihappodiagnostiikkaan

Abstract

Nukleiinihappojen havaitsemiseen soveltuvat molekulaarisen diagnostiikan menetelmät mahdollistavat infektiotauteja aiheuttavien patogeenien tunnistamisen nopeasti ja tarkasti. Menetelmät vaativat kuitenkin usein kehittyneet laboratoriotilat ja koulutetun henkilöstön, mikä rajoittaa testien käytön usein vain keskuslaboratoriotasolle. Tämä voi johtaa pidempään testin kokonaissuoritusaikaan muun muassa näytteen kuljetukseen ja käsittelyyn liittyvien viiveiden vuoksi. Kehittämällä testeistä helppokäyttöisempiä, voidaan niitä suorittaa yksinkertaisemmissa olosuhteissa, jopa vastaanotolla potilaan läsnä ollessa. Tällaisten potilasläheisten vieritestien kehittäminen vaatii menetelmien automatisointia ja määritykseen käytettävältä laitteistolta riittävän pientä kokoa. Optisiin merkkiaineisiin perustuvissa nukleiinihappotesteissä mittauksen vaatima optiikka ja siihen liittyvät komponentit ovat yksi laitteiston kokoa rajoittava tekijä, johon helposti elektroniikkaan integroitava sähkökemiallinen mittausteknologia voi olla mahdollinen ratkaisu.

Diplomityön tavoitteena oli tutkia ja vertailla kahta eri sähkökemiallista mittaustekniikka DNA:n havaitsemiseen, joita voitaisiin hyödyntää vieritestaukseen soveltuvan polymeraasiketjureaktioon (engl. polymerase chain reaction, PCR) perustuvan diagnostisen nukleiinihappotestin kehittämisessä. Työssä vertailtiin potentiometristä kanavatransistoriin (engl. field-effect transistor, FET) perustuvaa ja impedanssispektroskopiaan (engl. electrochemical impedance spectroscopy, EIS) perustuvaa menetelmää. Menetelmät perustuivat elektrodin pinnalle kiinnitettyihin nukleiinihappokoettimiin ja niistä pyrittiin kehittämään leima- ja pesuvapaita menetelmiä, jotta työvaiheiden määrä olisi mahdollisimman vähäinen. Näin menetelmien automatisointi on yksinkertaisempaa ja ne soveltuvat mahdollisesti myös reaaliaikaiseen PCR-reaktion seurantaan.

Työn aikana EIS-tekniikkaan perustuvalla sensorilla saatiin lupaavia tuloksia, mutta FET-tekniikkaan perustuvalla sensorilla ei kyetty havaitsemaan DNA-kohteita edes suhteellisen korkeissa pitoisuuksissa. Työn rajallisen ajan vuoksi ongelmalle ei löydetty varmaa syytä tai selitystä. EIS-sensorilla kyettiin havaitsemaan DNA-kohde ilman hybridisaation ja mittauksen välistä pesua, minkä perusteella se saattaa soveltua PCR-reaktion reaaliaikaiseen seurantaan. Sensorin käyttöä ei kuitenkaan ehditty testaamaan PCR-reaktion mittaamisessa.

Molecular diagnostic methods for detecting nucleic acids provide rapid and specific means to detect pathogens causing infectious diseases. However, these methods often require advanced and dedicated laboratory and trained laboratory staff, which limits the use of these tests to central laboratories. This can lead to longer turn-around time for the test resulting delays from transportation and handling the specimen. By developing more user-friendly tests, they can be used in less advanced environments, even at the outpatient clinics while the patient is waiting. Developing point-of-care tests for the near-patient use requires automatizing the test and minimize the test device to a sufficient size. Nucleic acid tests utilizing optical labels require optics and related components for detecting the labels, which is one of the limiting factors for the size of the test device. One solution for this is electrochemical detection technology which is easily integrable with small portable electronics.

The aim of this master’s thesis was to research and compare two electrochemical detection technologies for DNA detection, which then could be integrated for polymerase chain reaction (PCR) based point-of-care test. The two methods were field-effect transistor (FET) based potentiometric sensing and electrochemical impedance spectroscopy (EIS), Both methods were based on probes immobilized on electrode surface. The aim was to develop a label- and wash-free sensors to keep the detection method as simple as possible for automatization and to possibly implement it for real-time detection of PCR.

Results with EIS-based sensor were promising, but FET-based sensor was not able to detect DNA-targets even in rather high concentrations. Due to limited time a definitive explanation was not found for the problem. EIS-sensor on the other hand was able to detect DNA-target without wash between hybridization and detection. Based on the results EIS-sensor might be suitable detection technology for PCR-based test. However, this integration remains to be tested.