Proteiinien biotinylointiasteen määritysmenetelmät
Lehtiö, Mirella (2020-08-17)
Proteiinien biotinylointiasteen määritysmenetelmät
(17.08.2020)
Julkaisu on tekijänoikeussäännösten alainen. Teosta voi lukea ja tulostaa henkilökohtaista käyttöä varten. Käyttö kaupallisiin tarkoituksiin on kielletty.
avoin
Julkaisun pysyvä osoite on:
https://urn.fi/URN:NBN:fi-fe2020100277857
https://urn.fi/URN:NBN:fi-fe2020100277857
Tiivistelmä
Prosessia, jossa biotiini sitoutuu kovalenttisesti proteiiniin tai muuhun makromolekyyliin, kutsutaan biotinyloinniksi. Tärkeä osa biotinylointia on määrittää biotinyloituun johdannaiseen sitoutuneiden biotiinien määrä, jota tässä tutkielmassa kutsutaan biotinylointiasteeksi, sillä se vaikuttaa merkittävästi biotinyloidun yhdisteen toimivuuteen. Pro gradu -tutkielman kirjallisessa osiossa perehdytään erilaisiin biotinylointiasteen määritysmenetelmiin ja vertaillaan niiden toimivuutta. Yleisesti käytetyn 4’-hydroksiatsobentseeni-2-karboksyylihappomäärityksen (HABA-määritys) lisäksi käsitellään entsyymivälitteistä immunosorbenttimääritystä, nestekromatografiaa, massaspektrometriaa ja elektroforeettista liikkuvuussiirtymämääritystä. Lisäksi tarkastellaan määritysmenetelmiä, joissa hyödynnetään biotiinin kykyä sammuttaa (strept)avidiinin luonnollista fluoresenssia tai Biotektive Green -reagenssia. Kirjallisessa osiossa vertaillaan myös erilaisia tapoja tuottaa detektoitava signaali.
Tutkielman kokeellisessa osiossa optimoitiin Radiometer Turku Oy:n laadunvalvonnassa käytettävää määritystä, jolla mitataan biotinyloidun monoklonaalisen vasta-aineen (Bio-mAb) biotinylointisaanto immunomäärityksen avulla. Biotinylointisaannolla tarkoitetaan tässä tutkielmassa sitä, että kuinka suuri osuus biotinyloiduista vasta-aineista on biotinyloitunut. Päämääränä oli parantaa määrityksen luotettavuutta, tarkkuutta ja toistettavuutta. Lisäksi haluttiin parantaa dissosiaatiotehostetun lantanoidifluoresenssi-immunomäärityksen (DELFIA) herkkyyttä, jotta korkean biotinylointisaannon Bio-mAb:ien biotinylointisaannot voidaan määrittää mahdollisimman tarkasti. Myös käyttäjäystävällisyyttä pyrittiin kehittämään ja optimoimaan juuri käyttötarkoitukseen sopivat parametrit. Optimointi suoritettiin testaamalla eri pituisia inkubaatioaikoja, reagenssien pitoisuuksia ja muita vaihtoehtoisia menetelmiä. Lisäksi määritettiin toimivampi standardikäyrä, optimoitiin näytteen ja standardien pitoisuudet sekä näytereplikoiden määrä. Myös streptavidiinin ja eri streptavidiinilevyerien vaikutusta määritykseen tutkittiin. Optimoinnin ansiosta määritys parani ja lisäksi saatiin tärkeää tietoa siitä, että miten erilaiset parametrit vaikuttavat määritykseen.
Tutkielman kokeellisessa osiossa optimoitiin Radiometer Turku Oy:n laadunvalvonnassa käytettävää määritystä, jolla mitataan biotinyloidun monoklonaalisen vasta-aineen (Bio-mAb) biotinylointisaanto immunomäärityksen avulla. Biotinylointisaannolla tarkoitetaan tässä tutkielmassa sitä, että kuinka suuri osuus biotinyloiduista vasta-aineista on biotinyloitunut. Päämääränä oli parantaa määrityksen luotettavuutta, tarkkuutta ja toistettavuutta. Lisäksi haluttiin parantaa dissosiaatiotehostetun lantanoidifluoresenssi-immunomäärityksen (DELFIA) herkkyyttä, jotta korkean biotinylointisaannon Bio-mAb:ien biotinylointisaannot voidaan määrittää mahdollisimman tarkasti. Myös käyttäjäystävällisyyttä pyrittiin kehittämään ja optimoimaan juuri käyttötarkoitukseen sopivat parametrit. Optimointi suoritettiin testaamalla eri pituisia inkubaatioaikoja, reagenssien pitoisuuksia ja muita vaihtoehtoisia menetelmiä. Lisäksi määritettiin toimivampi standardikäyrä, optimoitiin näytteen ja standardien pitoisuudet sekä näytereplikoiden määrä. Myös streptavidiinin ja eri streptavidiinilevyerien vaikutusta määritykseen tutkittiin. Optimoinnin ansiosta määritys parani ja lisäksi saatiin tärkeää tietoa siitä, että miten erilaiset parametrit vaikuttavat määritykseen.