Aktivaatioenergian ja pitkäaikaissäilyvyyden määrittäminen proteiiniantigeeneille

Abstract

Säilyvyys on tärkeä laadun ominaispiirre diagnostiikan ja lääketeollisuuden alalla. Säilyvyyden määrittäminen reagenssille sen elinkaaren eri vaiheissa onkin tärkeä osa tuotekehitysprosessia. Tämän diplomityön tavoitteena oli määrittää pitkäaikaissäilyvyys ja aktivaatioenergia kahdeksalle proteiiniantigeeniliuokselle, jotka ovat osa Radiometer Turku Oy:n tuotteiden metrologista jäljitettävyysprosessia. Antigeenien säilyvyystavoitteeksi asetettiin viisi vuotta -70 °C:ssa.

Tutkimusmenetelmänä käytettiin kiihdytettyä säilyvyystutkimusta ja tutkittavia antigeeneja olivat troponiini I, troponiini T, myoglobiini, c-reaktiivinen proteiini, D- dimeeri, 𝛽-istukkahormoni, kreatiinikinaasin MB-muoto sekä N-terminaalinen B-tyypin natriureettisen peptidin esiaste (NT-proBNP, engl. N-terminal pro b-type Natriuretic Peptide). Tutkimuksessa kaikki proteiiniantigeenit altistettiin kolmelle korotetulle lämpötilalle ja antigeenien konsentraation muutosta ajan suhteen seurattiin immunokemiallisesti. Arrheniuksen yhtälöä hyödynnettiin säilyvyyden ja aktivaatioenergian määrittämisessä antigeeneilla, joiden todettiin noudattavan ensimmäisen kertaluvun hajoamista.

Arviot antigeenien aktivaatioenergioista asettuivat välille 30–250 kJ/mol. Antigeenien pitkäaikaissäilyvyyden kriteeriksi asetettiin korkeintaan 2 %:n lasku proteiinikonsentraatiossa. Tutkituista antigeeneista ainoastaan NT-proBNP ei saavuttanut viiden vuoden säilyvyystavoitetta. NT-proBNP:n säilyvyyttä tutkittiin edelleen -9,5 °C:ssa ja -20 °C:ssa, jotta olosuhdemuutoksen vaikutus säilyvyyteen voitaisiin minimoida. Todettiin, että proteiini säilyi pakkaslämpötiloissa selvästi kiihdytetyn säilyvyystutkimuksen perusteella tehtyä ennustusta paremmin. NT-proBNP:n säilyvyyttä on kuitenkin tutkittava tarkemmin pitkäaikaissäilyvyyden varmentamiseksi.

Stability is an important characteristic of quality in the field of diagnostics and pharmaceuticals. Thus, stability studies are an essential part of the product development process. Stability study can be conducted in real time or as an accelerated study. In this thesis, long-term stability and activation energy were determined for eight protein antigen dilutions with the help of accelerated stability study. The antigen dilutions were used at Radiometer Turku Oy as internal standards. The goal of this study was to confirm that the antigens would stay stable in -70 °C for at least five years.

The antigens under investigation were troponin I, troponin T, myoglobin, c-reactive protein, D-dimer, 𝛽-human chorionic gonadotropin, creatine kinase-MB and N-terminal pro-B-type natriuretic peptide (NT-proBNP). Every antigen was exposed to at least three elevated temperatures and the concentrations of the antigens were determined immunochemically in relation to time. It was noted that most of the reactions followed first order kinetics. The reaction rate constant was determined by linear regression at every temperature. An Arrhenius plot was constructed from the rate constants of the three elevated temperatures and it was utilized to calculate the shelf-life in -70 °C for each antigen. Activation energy was determined from the slope of the Arrhenius plot.

Estimates of the activation energy varied from 30 to 250 kJ/mol. The criteria for stability was set at maximum of 2 % degradation and all except NT-proBNP exceeded the goal of five years in -70 °C notably. The stability of NT-proBNP was studied further in -9.5 °C and -21.5 °C in order to minimize the effect of phase transition. As a result, NT-proBNP was found to be significantly more stable in solid phase than the previous estimate indicated. Nevertheless, the stability of NT-proBNP still needs further investigation to ensure sufficient shelf-life.