Novel approaches for ErbB receptor tyrosine kinase inhibition
Torkkila, Jori (2020-12-14)
Novel approaches for ErbB receptor tyrosine kinase inhibition
Torkkila, Jori
(14.12.2020)
Julkaisu on tekijänoikeussäännösten alainen. Teosta voi lukea ja tulostaa henkilökohtaista käyttöä varten. Käyttö kaupallisiin tarkoituksiin on kielletty.
suljettu
Julkaisun pysyvä osoite on:
https://urn.fi/URN:NBN:fi-fe20201223102860
https://urn.fi/URN:NBN:fi-fe20201223102860
Tiivistelmä
ErbB receptor tyrosine kinases are cell-surface proteins that regulate cell proliferation, differentiation, and survival. The four ErbB family members – EGFR, ErbB2, ErbB3 and ErbB4 – function abnormally in certain types of cancer. Multiple cancer drug molecules targeting these receptors are in clinical use, but their effect is often short-lived due to acquired resistance. Thus, novel drug molecules and methods of inhibition are needed. In this study, we aimed to inhibit human ErbB receptor tyrosine kinase activity by a novel strategy targeting a critical interaction site in the kinase domains of ErbB receptors.
We utilised both peptide and small-molecule inhibitor strategies to target the kinase domain dimerization interface of the ErbB receptors. 1) A synthetic peptide inhibitor designed to disrupt ErbB4 homodimers was used to inhibit ErbB4 in vitro. 2) EGFR was targeted with an endogenous inhibitor protein carried and injected into cells by recombinant Salmonella typhimurium. 3) A cell model dependent on the ErbB3/ErbB2 dimer was built and used to screen small-molecule inhibitors targeting the kinase domain dimerization interface in ErbB3. Western blotting, MTT assay and IncuCyte live cell imaging methods were used to assess inhibition effectiveness in different parts of the study.
We observed that the ErbB4 receptor activity was notably diminished by the peptide inhibitor. This suggests that ErbB receptor inhibition can be achieved by disrupting the intracellular dimerization interface. In the bacteria-focused part of the study, the feasibility to use Salmonella typhimurium as a vector for ErbB peptide inhibitor delivery remained unclear. The cell model for assaying ErbB3-targeting inhibitors was built, and the inhibitory effect of 25 small-molecules were examined using this model system. Three of the molecules were found to be effective in diminishing cell growth. In the future, additional small molecules targeting ErbB3 could be designed based on the results of this study and tested for improved efficacy. Tämän tutkielman aiheena on ihmisen ErbB-reseptorityrosiinikinaasien toiminnan estäminen reseptoridimeerien muodostumista häiritsemällä. Tutkimuksen tarkoituksena on kehittää inhibiittorimolekyylien testaamiseen solumalli ja testata uudenlaisia pienmolekyyli- ja peptidi-inhibiittoreita, joiden vaikutuskohteena on toistaiseksi hyödyntämätön reseptorien solunsisäisten kinaasien dimerisaatiopinta. ErbB-perheen neljä reseptoria EGFR (ErbB1), ErbB2, ErbB3 ja ErbB4 ovat laajalti kehon kudoksissa ilmentyviä solun pinnan reseptoreita, jotka säätelevät muun muassa solujen jakautumista ja eloonjäämistä. Nämä reseptorit ovat usein yliaktiivisia tietyissä syöpätyypeissä ja kliinisessä käytössä on useita ErbB-reseptoreihin kohdennettuja syövän täsmälääkkeitä. Syöpäsolut useimmiten kehittävät resistenssin näille lääkkeille, ja siksi uusille lähestymistavoille ErbB-reseptorien estämiseen on tarvetta.
Tutkimuksessa lähestyttiin ErbB-reseptoreiden estämistä käyttämällä peptidi- ja pienmolekyyli-inhibiittoreita. Inhibiittorien kohteina olivat tutkimuksen eri osissa kaikki neljä reseptoriperheen jäsentä: ErbB4-reseptorin aktivaatioon pyrittiin vaikuttamaan synteettisillä peptidi-inhibiittorimolekyyleillä in vitro. Toiseksi testattiin EGFRreseptorin luontaisen inhibiittoriproteiinin viemistä syöpäsoluun Salmonella typhimurium -bakteerin avulla. Kolmanneksi rakennettiin solumalli ErbB3-reseptoria estävien pienmolekyylien testausta varten, ja tällä mallilla analysoitiin 25:n ErbB3-reseptoria inhiboivan pienmolekyylin teho in vitro. Eri lähestymistapojen tehokkuutta arvioitiin western blotting- ja MTT-menetelmillä sekä ErbB-signaalista riippuvaisten solujen kasvua seuraamalla.
ErbB4-reseptoriin sitoutuvalla peptidillä reseptorin aktiivisuus väheni. Tämän perusteella voidaan päätellä, että reseptoridimeerin dimerisaatiota häiritsemällä on mahdollista merkittävästi vähentää ErbB-reseptorien välittämää signaaliaktiivisuutta syöpäsoluissa. Sen sijaan Salmonella typhimurium -bakteerin soveltumista inhibiittorimolekyylien kuljetukseen ei voitu arvioida MTT-menetelmän puutteiden vuoksi. ErbB3-reseptoriin keskittyvässä tutkimuksen osassa onnistuttiin rakentamaan toimiva solumalli ErbB3-inhibiittorien toimivuuden testaamiseen. Solumallilla testatuista 25 pienmolekyylistä kolmen todettiin merkittävästi heikentävän solujen kasvua. Tärkeimmät jatkoaskeleet olisivat uusien paranneltujen pienmolekyylien kehittäminen nykyisten tulosten perusteella ja niiden testaaminen tässä työssä kehitetyllä solumallilla.
We utilised both peptide and small-molecule inhibitor strategies to target the kinase domain dimerization interface of the ErbB receptors. 1) A synthetic peptide inhibitor designed to disrupt ErbB4 homodimers was used to inhibit ErbB4 in vitro. 2) EGFR was targeted with an endogenous inhibitor protein carried and injected into cells by recombinant Salmonella typhimurium. 3) A cell model dependent on the ErbB3/ErbB2 dimer was built and used to screen small-molecule inhibitors targeting the kinase domain dimerization interface in ErbB3. Western blotting, MTT assay and IncuCyte live cell imaging methods were used to assess inhibition effectiveness in different parts of the study.
We observed that the ErbB4 receptor activity was notably diminished by the peptide inhibitor. This suggests that ErbB receptor inhibition can be achieved by disrupting the intracellular dimerization interface. In the bacteria-focused part of the study, the feasibility to use Salmonella typhimurium as a vector for ErbB peptide inhibitor delivery remained unclear. The cell model for assaying ErbB3-targeting inhibitors was built, and the inhibitory effect of 25 small-molecules were examined using this model system. Three of the molecules were found to be effective in diminishing cell growth. In the future, additional small molecules targeting ErbB3 could be designed based on the results of this study and tested for improved efficacy.
Tutkimuksessa lähestyttiin ErbB-reseptoreiden estämistä käyttämällä peptidi- ja pienmolekyyli-inhibiittoreita. Inhibiittorien kohteina olivat tutkimuksen eri osissa kaikki neljä reseptoriperheen jäsentä: ErbB4-reseptorin aktivaatioon pyrittiin vaikuttamaan synteettisillä peptidi-inhibiittorimolekyyleillä in vitro. Toiseksi testattiin EGFRreseptorin luontaisen inhibiittoriproteiinin viemistä syöpäsoluun Salmonella typhimurium -bakteerin avulla. Kolmanneksi rakennettiin solumalli ErbB3-reseptoria estävien pienmolekyylien testausta varten, ja tällä mallilla analysoitiin 25:n ErbB3-reseptoria inhiboivan pienmolekyylin teho in vitro. Eri lähestymistapojen tehokkuutta arvioitiin western blotting- ja MTT-menetelmillä sekä ErbB-signaalista riippuvaisten solujen kasvua seuraamalla.
ErbB4-reseptoriin sitoutuvalla peptidillä reseptorin aktiivisuus väheni. Tämän perusteella voidaan päätellä, että reseptoridimeerin dimerisaatiota häiritsemällä on mahdollista merkittävästi vähentää ErbB-reseptorien välittämää signaaliaktiivisuutta syöpäsoluissa. Sen sijaan Salmonella typhimurium -bakteerin soveltumista inhibiittorimolekyylien kuljetukseen ei voitu arvioida MTT-menetelmän puutteiden vuoksi. ErbB3-reseptoriin keskittyvässä tutkimuksen osassa onnistuttiin rakentamaan toimiva solumalli ErbB3-inhibiittorien toimivuuden testaamiseen. Solumallilla testatuista 25 pienmolekyylistä kolmen todettiin merkittävästi heikentävän solujen kasvua. Tärkeimmät jatkoaskeleet olisivat uusien paranneltujen pienmolekyylien kehittäminen nykyisten tulosten perusteella ja niiden testaaminen tässä työssä kehitetyllä solumallilla.