ORIGINS OF ANTIBODY DIVERSITY AND THE ROLE OF BACH2 IN SOMATIC HYPERMUTATION
Lappalainen, Pauli (2021-03-16)
ORIGINS OF ANTIBODY DIVERSITY AND THE ROLE OF BACH2 IN SOMATIC HYPERMUTATION
Lappalainen, Pauli
(16.03.2021)
Julkaisu on tekijänoikeussäännösten alainen. Teosta voi lukea ja tulostaa henkilökohtaista käyttöä varten. Käyttö kaupallisiin tarkoituksiin on kielletty.
suljettu
Julkaisun pysyvä osoite on:
https://urn.fi/URN:NBN:fi-fe202103319154
https://urn.fi/URN:NBN:fi-fe202103319154
Tiivistelmä
Antibodies produced by B cells are critical for our immunological defence against pathogens. For antibodies, the ability to recognise and bind pathogenic antigens improves through time during infection. Improvement is due to somatic hypermutation (SHM) of B cells, where antibody coding DNA, located in Ig loci, is mutated. The genomic mutations change the affinity of the antibody towards its antigen.
The purpose of my study was to examine the effect of BACH2-protein on SHM activity. BACH2 is a transcription factor, that is important for B lymphopoiesis and is involved in SHM induction.
Mutations that hallmark SHM arise when activation induced cytidine deaminase -protein (AID) deaminates cytosine into uracil. The uracil is further processed into another base or removed. In addition to Ig loci, any base in the genome can be targeted by AID deamination. Off-target mutations of AID possess a significant threat to genomic integrity and at worst lead to cancer.
Mechanisms that target SHM to Ig and off target -loci are poorly understood. Chromatin structure, transcription and DNA regulatory elements are known to influence the targeting of mutations.
In this study BACH2 knockout (KO) Ramos B cell line was compared to wildtype (WT) cell line. Cells were transduced with Green fluorescent protein (GFP) with or without a powerful SHM-increasing DIVAC-element using lentivirus vector. The SHM activity was then determined using a GFP-loss assay, where the fluorescence of the cell diminishes as the mutations accumulate in the GFP-gene during 21- or 24-day culture period.
Fluorescence decreased, as anticipated, faster in DIVAC-containing cell lines. The fastest mutation rate was measured in cells containing both BACH2 and DIVAC. When comparing DIVAC-containing sub-cloned groups with different BACH2 expression profiles, we found that BACH2-KO cells had significantly lower mutation rate compared to BACH2 expressing cells. Additionally, our western blot -analysis showed a significant correlation between AID and BACH2 expression levels.
Our study shows that BACH2 has SHM-increasing action that might be mediated through DIVAC-elements. Moreover, we showed that BACH2 is not necessary for SHM, but the mutation rate is diminished in absence of BACH2 and BACH2 might play a part in AID regulation. B-solujen tuottamat vasta-aineet ovat keskeisiä elimistön puolustautuessa taudinaiheuttajia vastaan. Vasta-aineiden sitoutumiskyky taudinaiheuttajista peräisin oleviin antigeeneihin paranee infektiotaudin edetessä B-soluissa tapahtuvan somaattisen hypermutaation (SHM) ansiosta. Somaattisessa hypermutaatiossa genomin vasta-aineita koodaavaan DNA:han, joka sijaitsee Ig-lokuksessa, tehdään mutaatioita. Mutaatiot muuttavat vasta-aineen sitoutumista antigeeniinsä.
Tutkielmani tarkoituksena oli tutkia BACH2-proteiinin vaikutusta SHM:n aktiivisuuteen. BACH2 on transkriptiotekijä, joka on tärkeässä asemassa B-solujen kypsymisessä ja osallistuu SHM:n aloitukseen.
SHM:n mutaatiot syntyvät AID-proteiinin deaminoidessa sytosiinin urasiiliksi, joka edelleen prosessoidaan toiseksi emäkseksi tai poistetaan. Ig-lokuksen lisäksi mikä tahansa emäs genomissa voi joutua AID:n mutatoinnin kohteeksi, ja ajoittain näitä mutaatioita karkaa Ig-lokuksen ulkopuolelle. Pahimmillaan mutaatio väärässä paikassa voi johtaa syövän syntyyn.
Somaattisen hypermutaation kohdentumisen mekanismeja ei tunneta tarkasti. Tiedetään, että DNA:n kolmiulotteisella rakenteella, geenien transkriptioaktiivisuudella sekä tietyillä DNA:n säätelyalueilla on vaikutusta mutaatioiden kohdentumiseen.
Tutkimuksessa verrattiin BACH2-geenin suhteen hiljennettyä (Knockout, KO) RAMOS B-solulinjaa villityypin solulinjaan (Wildtype, WT). Solulinjoihin tuotiin lentivirusvektorin avulla vihreä fluoresoiva proteiini (GFP), jonka promoottori oli joko SHM:n suhteen neutraali tai sitä voimakkaasti lisäävä (DIVAC). Solulinjojen SHM-aktiivisuutta mitattiin GFP-loss -mallilla. Tässä mallissa GFP:n fluoresenssi häviää solupopulaatiossa sitä mukaa, kun mutaatioita kertyy GFP-geeniin. Fluoresenssia mitattiin virtaussytometrian avulla 21 tai 24 vuorokauden ajan.
Fluoresenssi laski odotetusti nopeammin DIVACin sisältävissä solulinjoissa. Selvästi nopeinta hypermutaatio oli sekä BACH2:n että DIVACin sisältävässä solulinjassa. Lisäksi vertailtaessa DIVACin omaavia alikloonattuja BACH2:n ilmentämisen suhteen erilaisia solulinjoja, haivattiin BACH2-KO solujen mutaationopeuden olevan selvästi muita pienempi. western blot -analyysissä todettiin BACH2:n ja AIDin ilmentymisen korreloivan. Tutkimuksen perusteella BACH2:lla on lievä SHM:a lisäävä vaikutus, joka mahdollisesti liittyy DIVAC-alueisiin. Lisäksi todettiin, että BACH2 ei ole välttämätön SHM:lle, mutta saattaa osallistua AIDin säätelyyn.
The purpose of my study was to examine the effect of BACH2-protein on SHM activity. BACH2 is a transcription factor, that is important for B lymphopoiesis and is involved in SHM induction.
Mutations that hallmark SHM arise when activation induced cytidine deaminase -protein (AID) deaminates cytosine into uracil. The uracil is further processed into another base or removed. In addition to Ig loci, any base in the genome can be targeted by AID deamination. Off-target mutations of AID possess a significant threat to genomic integrity and at worst lead to cancer.
Mechanisms that target SHM to Ig and off target -loci are poorly understood. Chromatin structure, transcription and DNA regulatory elements are known to influence the targeting of mutations.
In this study BACH2 knockout (KO) Ramos B cell line was compared to wildtype (WT) cell line. Cells were transduced with Green fluorescent protein (GFP) with or without a powerful SHM-increasing DIVAC-element using lentivirus vector. The SHM activity was then determined using a GFP-loss assay, where the fluorescence of the cell diminishes as the mutations accumulate in the GFP-gene during 21- or 24-day culture period.
Fluorescence decreased, as anticipated, faster in DIVAC-containing cell lines. The fastest mutation rate was measured in cells containing both BACH2 and DIVAC. When comparing DIVAC-containing sub-cloned groups with different BACH2 expression profiles, we found that BACH2-KO cells had significantly lower mutation rate compared to BACH2 expressing cells. Additionally, our western blot -analysis showed a significant correlation between AID and BACH2 expression levels.
Our study shows that BACH2 has SHM-increasing action that might be mediated through DIVAC-elements. Moreover, we showed that BACH2 is not necessary for SHM, but the mutation rate is diminished in absence of BACH2 and BACH2 might play a part in AID regulation.
Tutkielmani tarkoituksena oli tutkia BACH2-proteiinin vaikutusta SHM:n aktiivisuuteen. BACH2 on transkriptiotekijä, joka on tärkeässä asemassa B-solujen kypsymisessä ja osallistuu SHM:n aloitukseen.
SHM:n mutaatiot syntyvät AID-proteiinin deaminoidessa sytosiinin urasiiliksi, joka edelleen prosessoidaan toiseksi emäkseksi tai poistetaan. Ig-lokuksen lisäksi mikä tahansa emäs genomissa voi joutua AID:n mutatoinnin kohteeksi, ja ajoittain näitä mutaatioita karkaa Ig-lokuksen ulkopuolelle. Pahimmillaan mutaatio väärässä paikassa voi johtaa syövän syntyyn.
Somaattisen hypermutaation kohdentumisen mekanismeja ei tunneta tarkasti. Tiedetään, että DNA:n kolmiulotteisella rakenteella, geenien transkriptioaktiivisuudella sekä tietyillä DNA:n säätelyalueilla on vaikutusta mutaatioiden kohdentumiseen.
Tutkimuksessa verrattiin BACH2-geenin suhteen hiljennettyä (Knockout, KO) RAMOS B-solulinjaa villityypin solulinjaan (Wildtype, WT). Solulinjoihin tuotiin lentivirusvektorin avulla vihreä fluoresoiva proteiini (GFP), jonka promoottori oli joko SHM:n suhteen neutraali tai sitä voimakkaasti lisäävä (DIVAC). Solulinjojen SHM-aktiivisuutta mitattiin GFP-loss -mallilla. Tässä mallissa GFP:n fluoresenssi häviää solupopulaatiossa sitä mukaa, kun mutaatioita kertyy GFP-geeniin. Fluoresenssia mitattiin virtaussytometrian avulla 21 tai 24 vuorokauden ajan.
Fluoresenssi laski odotetusti nopeammin DIVACin sisältävissä solulinjoissa. Selvästi nopeinta hypermutaatio oli sekä BACH2:n että DIVACin sisältävässä solulinjassa. Lisäksi vertailtaessa DIVACin omaavia alikloonattuja BACH2:n ilmentämisen suhteen erilaisia solulinjoja, haivattiin BACH2-KO solujen mutaationopeuden olevan selvästi muita pienempi. western blot -analyysissä todettiin BACH2:n ja AIDin ilmentymisen korreloivan. Tutkimuksen perusteella BACH2:lla on lievä SHM:a lisäävä vaikutus, joka mahdollisesti liittyy DIVAC-alueisiin. Lisäksi todettiin, että BACH2 ei ole välttämätön SHM:lle, mutta saattaa osallistua AIDin säätelyyn.