Käänteisviritteisiä nanopartikkeleita hyödyntävän spatiaalisen monianalyttimäärityksen karakterisointi
Vahtera, Ulla (2021-04-27)
Käänteisviritteisiä nanopartikkeleita hyödyntävän spatiaalisen monianalyttimäärityksen karakterisointi
Vahtera, Ulla
(27.04.2021)
Julkaisu on tekijänoikeussäännösten alainen. Teosta voi lukea ja tulostaa henkilökohtaista käyttöä varten. Käyttö kaupallisiin tarkoituksiin on kielletty.
suljettu
Julkaisun pysyvä osoite on:
https://urn.fi/URN:NBN:fi-fe2021052631814
https://urn.fi/URN:NBN:fi-fe2021052631814
Tiivistelmä
Monianalyyttimääritykset mahdollistavat useamman analyytin havainnoinnin näytteestä samanaikaisesti. Tämä tekee menetelmistä kustannustehokkaampia, nopeampia ja potentiaalisesti myös luotettavampia tavallisiin yhden analyytin määrityksiin verrattaessa, maksimoiden samalla pienemmästä näytetilavuudesta saatavan informaation määrän. Spatiaalisessa, eli avaruudellisessa monianalyyttimäärityksessä analyyttien tunnistaminen perustuu niiden sitoutumiseen määrättyihin kohtiin kiintokantajalla. Leimoina voidaan käyttää fotoluminoivia leimoja, kuten esimerkiksi käänteisviritteisiä nanopartikkeleita (engl. upconverting nanoparticles, UCNP), joiden signaalit voidaan lukea suoraan määrityslevyn pinnalta. UCNP:t ovat epäorgaanisia leimoja, joiden kidemateriaaliin on seostettu tiettyjä kolmiarvoisia lantanidi-ioneita. UCNP:ssä lantanidi-ioneilla on kyky muuttaa matalaenergistä infrapunavaloa korkeampienergiseksi näkyväksi valoksi. Tämän käänteisviritykseksi kutsutun prosessin ansiosta niiden fotoluminesenssi voidaan havaita ilman havainnointia häiritsevää autofluoresenssia. Työn tarkoituksena oli karakterisoida uudenlainen spatiaalinen UCNP:tä hyödyntävä monianalyyttimääritys. Mallianalyyteiksi paneeliin valittiin raskauden aikainen plasmaproteiini A (engl. pregnancy-associated plasma protein A, PAPP-A), vapaa koriongonadotropiinin beta-alayksikkö (engl. free beta-subunit of human chorionic gonadotropin, fhCG-ß), ihmisen alfafetoproteiini (engl. human alpha-fetoprotein, AFP) sekä istukan kasvutekijä (engl. placental growth factor, PlGF), joita käytetään normaalisti esimerkiksi Downin syndrooman seulontaan.
Monianalyyttimääritys toteutettiin kaksipuoleisena ja kiintokantajana käytettiin muokattuja kaivoja, joiden pohjassa jokaiselle analyytille oli passiivisesti vasta-aineilla pinnoitettu erillinen syvennys. Jokaiselle analyytille valmistettiin oma leima biokonjugoimalla karboksyylipintaisille UCNP:lle analyyttikohtaista vasta-ainetta. Määritys suoritettiin lisäämällä monianalyyttikaivoon samanaikaisesti sekä näyte että neljästä analyyttikohtaisesta leimasta valmistettu leimasekoitus, jonka jälkeen kaivot pestiin tavallisella levypesurilla ja käänteisviritteiset leimasignaalit mitattiin analyyttikohtaisista syvennyksistä.
Tutkimuksessa kehitetyn määritysformaatin osoitettiin olevan erittäin lupaava ratkaisu spatiaalisiin monianalyyttimääritystarkoituksiin. Määrityksellä pystyttiin havaitsemaan neljä analyyttiä samanaikaisesti samasta näytteestä. Lupaavuudestaan huolimatta määritysformaatti vaatii paljon jatkotutkimuksia ennen kuin sitä voitaisiin hyödyntää kliinisissä käyttökohteissa. Määrityksen toimivuutta rajoittaviksi tekijöiksi todettiin analyyttien fysiologisten pitoisuusalueiden eroavaisuuksista johtuva kalibraattorikäyrien huomattava saturoituminen, seerumin aiheuttama matriisiefekti sekä hajontaongelmat. Multiplex assays enable simultaneous quantification of multiple analytes from one sample. This makes these methods cost-effective, fast, and potentially more reliable while maximizing the information obtained from smaller sample volumes. In spatial multiplexing the analytes are identified based on their location on the solid phase. Reporters suitable for the spatial resolution include photoluminescent labels, such as upconverting nanoparticles (UCNP), the emission signal of which can be measured directly from the solid phase. UCNPs are inorganic nanosized crystals doped with trivalent lanthanide ions. In this crystalline matrix, the lanthanide ions can convert lower energy infrared light into higher energy visible light in the optical process called upconversion. This enables autofluorescence-free emission. The study aimed to characterize a novel spatial multiplex assay for model analytes: human alpha-fetoprotein (AFP), pregnancy-associated plasma protein-A (PAPP-A), placental growth factor (PlGF), and the free beta-subunit of the chorionic gonadotropin (fhCGβ). These markers are usually used together for the screening of Down syndrome.
The developed assay was a multiplexed sandwich immunoassay. Modified wells with four analyte-specific indentations coated by passive adsorption were used as the solid phase. Carboxyl-functionalized UCNPs were bioconjugated with analyte-specific antibodies. The multiplexed assay was carried out by simultaneously adding the sample and the UCNP-mix containing analyte-specific UCNPs for each analyte. The assay was finished by washing away the excess components with a standard plate washer and measuring the analyte-specific upconversion emission signals from the indentations.
The study demonstrated the potential of the developed spatial multiplexed assay format. The assay could be used for simultaneous detection of four analytes from one sample. Despite the potential, the assay format needs further research before it could be utilized for clinical purposes. The main challenges limiting the functionality of the format were the interference caused by the serum matrix, variation, and especially saturation challenges originating from highly different physiological ranges of the analytes.
Monianalyyttimääritys toteutettiin kaksipuoleisena ja kiintokantajana käytettiin muokattuja kaivoja, joiden pohjassa jokaiselle analyytille oli passiivisesti vasta-aineilla pinnoitettu erillinen syvennys. Jokaiselle analyytille valmistettiin oma leima biokonjugoimalla karboksyylipintaisille UCNP:lle analyyttikohtaista vasta-ainetta. Määritys suoritettiin lisäämällä monianalyyttikaivoon samanaikaisesti sekä näyte että neljästä analyyttikohtaisesta leimasta valmistettu leimasekoitus, jonka jälkeen kaivot pestiin tavallisella levypesurilla ja käänteisviritteiset leimasignaalit mitattiin analyyttikohtaisista syvennyksistä.
Tutkimuksessa kehitetyn määritysformaatin osoitettiin olevan erittäin lupaava ratkaisu spatiaalisiin monianalyyttimääritystarkoituksiin. Määrityksellä pystyttiin havaitsemaan neljä analyyttiä samanaikaisesti samasta näytteestä. Lupaavuudestaan huolimatta määritysformaatti vaatii paljon jatkotutkimuksia ennen kuin sitä voitaisiin hyödyntää kliinisissä käyttökohteissa. Määrityksen toimivuutta rajoittaviksi tekijöiksi todettiin analyyttien fysiologisten pitoisuusalueiden eroavaisuuksista johtuva kalibraattorikäyrien huomattava saturoituminen, seerumin aiheuttama matriisiefekti sekä hajontaongelmat.
The developed assay was a multiplexed sandwich immunoassay. Modified wells with four analyte-specific indentations coated by passive adsorption were used as the solid phase. Carboxyl-functionalized UCNPs were bioconjugated with analyte-specific antibodies. The multiplexed assay was carried out by simultaneously adding the sample and the UCNP-mix containing analyte-specific UCNPs for each analyte. The assay was finished by washing away the excess components with a standard plate washer and measuring the analyte-specific upconversion emission signals from the indentations.
The study demonstrated the potential of the developed spatial multiplexed assay format. The assay could be used for simultaneous detection of four analytes from one sample. Despite the potential, the assay format needs further research before it could be utilized for clinical purposes. The main challenges limiting the functionality of the format were the interference caused by the serum matrix, variation, and especially saturation challenges originating from highly different physiological ranges of the analytes.