Hyppää sisältöön
    • Suomeksi
    • In English
  • Suomeksi
  • In English
  • Kirjaudu
Näytä aineisto 
  •   Etusivu
  • 1. Kirjat ja opinnäytteet
  • Pro gradu -tutkielmat ja diplomityöt sekä syventävien opintojen opinnäytetyöt (kokotekstit)
  • Näytä aineisto
  •   Etusivu
  • 1. Kirjat ja opinnäytteet
  • Pro gradu -tutkielmat ja diplomityöt sekä syventävien opintojen opinnäytetyöt (kokotekstit)
  • Näytä aineisto
JavaScript is disabled for your browser. Some features of this site may not work without it.

Assessing the effects of ANO7 mutations on mRNA splicing using a minigene splicing assay

Tulonen, Nea (2021-12-08)

Assessing the effects of ANO7 mutations on mRNA splicing using a minigene splicing assay

Tulonen, Nea
(08.12.2021)
Katso/Avaa
Tulonen_Nea_opinnayte.pdf (1.497Mb)
Lataukset: 

Julkaisu on tekijänoikeussäännösten alainen. Teosta voi lukea ja tulostaa henkilökohtaista käyttöä varten. Käyttö kaupallisiin tarkoituksiin on kielletty.
avoin
Näytä kaikki kuvailutiedot
Julkaisun pysyvä osoite on:
https://urn.fi/URN:NBN:fi-fe2021121761564
Tiivistelmä
Prostate cancer (PrCa) is the most common cancer type in men. Dysregulated splicing
is considered a hallmark of cancer, and PrCa has its own characteristic splicing
landscape. Alternative splicing (AS) enables production of multiple protein isoforms
from a single gene by altering splicing of exons and introns. AS outcomes can be
studied with reverse transcription PCR (RT-PCR) or a minigene splicing assay, which
allows comparison of wild type and mutant sequences in identical conditions.
This MSc study focused on two splicing mutations in ANO7, a PrCa susceptibility gene.
Variant rs77559646 in the splice donor site of intron 4 leads to exon skipping and
increased intronic expression presumably by disrupting binding of an essential splicing
factor. The variant was corrected by CRISPR-Cas9 base-editing, also producing a new
unwanted mutation upstream. This study aimed to determine whether normal splicing
would be restored regardless. Ultimately, RT-PCR analysis revealed that intron 3
expression was not reduced. Additionally, the region exhibited deletions related to Alu
repeat elements. Splicing assay showed that exon 4 splicing was improved, but only
slightly.
Variant rs78154103 in intron 7 causes cryptic splice site selection and partial intron
retention. The variant’s effect on splicing was studied with a minigene splicing assay
using a longer construct than in a previous study, allowing formation of endogenous
secondary structures, suspected of contributing to dysregulated splicing. As
anticipated, more exon skipping was detected compared to reference, but inclusion of
cryptic exon did not differ between the constructs, contrary to what was expected.
 
Eturauhassyöpä on miesten yleisin syöpä. Eturauhassyövässä, kuten muissakin syö vissä, havaitaan häiriintynyttä esiaste-RNA:n silmukointia. Vaihtoehtoinen silmukointi
mahdollistaa useamman erilaisen proteiinituotteen tuoton yhdestä geenistä vaihtoeh toisilla eksoni-introni-yhdistelmillä. Vaihtoehtoista silmukointia voidaan tutkia esimerkik si RT-PCR-tekniikalla (reverse transcriptase - polymerase chain reaction) tai minigee nien silmukointianalyysillä (engl. minigene splicing assay), joka mahdollistaa villityypin ja mutanttisekvenssin vertailun identtisissä olosuhteissa.
Tässä tutkielmassa tutkin kahta ANO7-eturauhassyöpäalttiusgeenissä ilmenevää sil mukointimutaatiota. Variantti rs77559646 sijaitsee introni 4:n luovuttaja-alueella, josta
silmukointi tavallisesti alkaa. Variantti johtaa eksoni 4:n poissilmukointiin ja lisäänty neeseen introni 3:n ekspressioon oletettavasti estämällä silmukointiin tarvittavan ribo nukleoproteiinin sitoutumisen. Mutaatio on korjattu CRISPR-Cas9 ba se-editing -tekniikalla, mutta samanaikaisesti syntyi uusi mutaatio yläjuosteessa. Tut kimuksen tavoitteena oli selvittää, palautuuko asianmukainen silmukointi tahattomasta
muutoksesta huolimatta. Asiaa tutkittiin RT-PCR-tekniikalla ja minigeenien silmukointi analyysillä. RT-PCR-analyysi osoitti, että introni 3:n ekspressio ei eronnut muokatun ja
varianttisekvenssin välillä. Lisäksi tutkitulla introni 3 -alueella havaittiin deleetioita, jotka
olivat yhteydessä Alu-toistojaksoihin. Silmukointianalyysistä kävi ilmi, että eksoni 4:n
silmukointi palautui, mutta odotettua heikommin.
Introni 7:ssä sijaitseva variantti rs78154103 aiheuttaa kryptisen silmukointikohdan akti vaation, johtaen kryptisen eksonin (eksoni + osa intronia) muodostumiseen. Variantin
vaikutusta silmukointiin tutkittiin minigeenien silmukointianalyysillä käyttäen pidempää
minigeenikonstruktia, kuin aiemmassa tutkimuksessa. Pidempi sekvenssi mahdollistaa
RNA:n sekundaarirakenteiden muodostumisen, joiden rakennemuutosten epäillään
aiheuttavan häiriintynyttä silmukointia kyseisellä geenialueella. Odotusten mukaisesti
variantti aiheutti lisääntynyttä eksonin poistoa verrattuna villityyppiin. Kryptinen eksoni
kuitenkin ekspressoitui yhtä vahvasti molemmilla konstrukteilla, toisin kuin odotettiin.
 
Kokoelmat
  • Pro gradu -tutkielmat ja diplomityöt sekä syventävien opintojen opinnäytetyöt (kokotekstit) [9153]

Turun yliopiston kirjasto | Turun yliopisto
julkaisut@utu.fi | Tietosuoja | Saavutettavuusseloste
 

 

Tämä kokoelma

JulkaisuajatTekijätNimekkeetAsiasanatTiedekuntaLaitosOppiaineYhteisöt ja kokoelmat

Omat tiedot

Kirjaudu sisäänRekisteröidy

Turun yliopiston kirjasto | Turun yliopisto
julkaisut@utu.fi | Tietosuoja | Saavutettavuusseloste