Transgeenisten Caenorhabditis elegans -sukkulamatojen käyttö bioindikaattoreina glyfosaattitutkimuksessa

Abstract

Glyfosaatti on tehokas ja edullinen kasvintorjunta-aine, jota on käytetty laajasti sekä maa- että metsätaloudessa 1970-luvulta saakka. Sen teho perustuu kasvien sikimaattikierron estämiseen ja siksi sen ei ole uskottu olevan haitallinen eläimille ja ihmisille, joilla tätä kiertoa ei esiinny. Kuitenkin viime vuosina yleinen huoli glyfosaatin laajan ja intensiivisen käytön vaikutuksista on lisääntynyt. Tämän pro gradu -tutkielman tarkoituksena oli tutkia glyfosaatin ja glyfosaattia sisältävien kasvintorjunta-aineiden (RoundUp®) vaikutuksia Caenorhabditis elegans -sukkulamatoihin, mittaamalla oksidatiivisen ja ksenobioottisen stressin ilmenemistä GFP reportterikantojen avulla. Lisäksi tutkielman tarkoituksena oli havainnoida glyfosaatin vaikutuksia sukkulamatojen kuolleisuuteen, lisääntymiskykyyn ja liikkumiseen. Akuuttialtistuskokeissa sekä oksidatiivisen että ksenobioottisen stressin vaste saavutettiin puhtaan glyfosaatin ja RoundUp® Gold -kasvintorjunta-aineen altistuksissa useissa pitoisuuksissa. Myös RoundUp® Garden aiheutti ksenobioottista stressiä useissa pitoisuuksissa. Sukkulamatojen liikkuvuus laski melko lineaarisesti glyfosaattipitoisuuden kasvaessa, paitsi RoundUp® Garden -kasvintorjunta-aineella, jonka suurimmissa pitoisuuksissa sukkulamadot liikkuivat kontrollejakin nopeammin. Pitkäaikaisaltistuskokeessa seurattiin jälkeläisten määrää ja tutkittiin miten kasvuympäristön sisältämä glyfosaatti vaikuttaa sukkulamatojen lisääntymiskykyyn. Kasvatusmaljojen agar sisälsi glyfosaattia ja sitä oli levitetty myös agarin pintaan. Lisäksi ruokabakteerikasvustoa oli altistettu glyfosaattiliuokselle yhden tunnin ajan ennen maljoille levitystä. Sukkulamadot munivat enemmän munia RoundUp®:a sisältävillä maljoilla ja näistä munista valtaosa kuoriutui. Puhdasta glyfosaattia sisältävillä maljoilla munia oli huomattavan paljon vähemmän. Kontrolli- ja glyfosaattimaljojen tulosten vaihteluvälit olivat suuria ja tulosten päällekkäisyys on mahdollista. Siten on vaikea varmasti sanoa, että glyfosaatti olisi erityisen haitallista sukkulamatojen lisääntymiselle. Maaperänäytteiden analyysissa tutkittiin näytteistä uutettujen nesteiden sisältämiä glyfosaatti- ja fosforijäämiä. Näillä näytteillä stressivasteita ei juuri löytynyt tai ne olivat erittäin heikkoja. Kaiken kaikkiaan voi kuitenkin todeta, että altistustavasta riippuen C. elegans -sukkulamadot osoittavat stressireaktioita jo hyvin pienillä glyfosaatin pitoisuuksilla. Erot eri kasvintorjunta-aineiden välillä saattavat selittyä tuotteiden lisäaineilla.

Glyphosate is an effective and inexpensive pesticide that has been widely used in both agriculture and forestry since the 1970s. Its efficacy is based on the inhibition of the Shikimate pathway in plants and therefore it has not been believed to be harmful to animals and humans without this pathway. However, in recent years, general concern about the effects of the widespread and intensive use of glyphosate has increased. The purpose of this master's thesis was to investigate the effects of glyphosate and glyphosate-containing pesticides (RoundUp®) on Caenorhabditis elegans nematodes by measuring the expression of oxidative and xenobiotic stress using GFP reporter strains. In addition, the aim of the thesis was to observe the effects of glyphosate on nematode mortality, reproductive capacity, and motility. In acute exposure experiments, a response to both oxidative and xenobiotic stress was achieved with exposures of pure glyphosate and RoundUp® Gold pesticide at multiple concentrations. RoundUp® Garden also caused xenobiotic stress at several concentrations. The nematode mobility decreased fairly linearly with increasing glyphosate concentration, except for RoundUp® Garden, where at the highest concentrations the nematode mobility even exceeded the value of the control animals. The long-term exposure study monitored the number of offspring and examined how glyphosate in the growth medium affects the reproductive capacity of nematodes. The agar of the culture dishes contained glyphosate and it had also been applied to the surface of the agar. In addition, the food bacterial had been exposed to glyphosate for one hour before application to the plates. Nematodes laid more eggs on plates containing RoundUp® and most of these eggs hatched. Plates containing pure glyphosate had significantly fewer eggs. The results ranged widely between control and glyphosate plates and overlap of results is possible. Thus, it is difficult to say with certainty that glyphosate would be particularly detrimental to nematode reproduction. In the analysis of soil samples, glyphosate and phosphorus residues in liquids extracted from the samples were examined. With these samples, stress responses were hardly found or were very weak. Taken together depending on the route of exposure, C. elegans nematodes show stress reactions even at very low glyphosate concentrations. Differences between distinct pesticides may be explained by product additives.