Validating genetic tools and molecules preventing pathological protein aggregation in mouse neurons in culture and in vivo

Abstract

Parkinson’s disease (PD) is the second most common neurodegenerative disorder characterized by a variety of motor and non-motor symptoms. Accumulation of misfolded and aggregated alpha-synuclein (alphaSyn) into intracellular inclusions known as Lewy bodies (LB) is a major pathological hallmark of PD. Currently, there is no cure for PD and the mechanisms regulating alphaSyn aggregation and LB formation remain poorly understood. In this study, genetic tools and antibodies attenuating pathological protein aggregation were validated in mouse neurons in vitro and in vivo to establish robust research tools for studying aplhaSyn aggregation and LB formation.

The dose-dependent efficacy of commercially available Accell small interfering RNAs (siRNA) to induce knockdown of two housekeeping genes in mouse primary cortical neurons without viral delivery was assessed with quantitative PCR (qPCR) and western blot analyses. The ability of an aggregate-selective BIIB054 antibody to detect monomeric and aggregated alphaSyn in vitro was evaluated in western blot analyses and immunofluorescent staining of mouse primary cortical cultures. Immunohistochemical staining of mouse brain sections was performed to assess the specificity of BIIB054 in vivo and to analyze alphaSyn aggregation in mouse brains injected with alphaSyn preformed fibrils.

Accell siRNAs were shown to efficiently induce knockdown of selected housekeeping genes both after 72-hour and 10-day treatments in qPCR analysis. Thus, Accell siRNAs targeting genes that are relevant for alphaSyn aggregation could be tested in the future. BIIB054 selectively detected aggregated alphaSyn particularly in vivo and provided a useful tool for studying alphaSyn aggregation in immunohistochemical analysis. However, the mouse model requires further development. Positive results obtained in this study establish new research tools for studying specific PD-relevant targets and identifying potential disease-modifying treatments in preclinical PD models.

Parkinsonin tauti on toiseksi yleisin hermoston rappeumasairaus, joka aiheuttaa liikehäiriöiden lisäksi lukuisia muita oireita. Sen patologisia tunnusmerkkejä ovat solunsisäiset proteiinikertymät, jotka koostuvat pääosin väärin laskostuneesta alfasynukleiinista. Näitä proteiinikertymiä kutsutaan Lewyn kappaleiksi. Parkinsonin tautiin ei ole olemassa parantavaa hoitoa, ja lisäksi Lewyn kappaleiden muodostumista säätelevät mekanismit tunnetaan edelleen huonosti. Tässä tutkimuksessa patologista proteiinien aggregaatiota estäviä geneettisiä työkaluja ja vasta-aineita validoitiin hiiren hermosoluissa in vitro ja in vivo. Tutkimuksen tarkoituksena oli kehittää uusia tutkimustyökaluja, joita voitaisiin hyödyntää tulevaisuudessa alfasynukleiinin aggregaatioon ja Lewyn kappaleiden muodostumiseen liittyvissä tutkimuksissa.

Kaupallisten Accell-teknologiaa edustavien pienten häiritsevien RNA-molekyylien (engl. small interfering RNA, siRNA) tehokkuutta hiljentää kahta taloudenpitogeeniä hiiren primäärisissä hermosoluissa ilman virusvektoreita tutkittiin kvantitatiivisen PCR:n ja western blot -analyysin avulla. Parkinsonin taudin lääkkeeksi kehitetyn BIIB054 vasta-aineen kykyä havaita alfasynukleiinimonomeereja ja -säikeitä in vitro arvioitiin western blot -analyysillä sekä primäärihermosoluviljelmien immunofluoresenssivärjäyksellä. BIIB054 vasta-aineen spesifisyyttä tutkittiin myös hiiren aivoleikkeiden immunohistokemiallisella värjäyksellä, ja samalla analysoitiin alfasynukleiinin aggregaatiota hiirien aivoissa, joihin oli injektoitu esimuodostettuja alfasynukleiinisäikeitä.

Accell siRNA:t hiljensivät tehokkaasti taloudenpitogeenejä sekä kolmen että kymmenen vuorokauden käsittelyn jälkeen. Tulevaisuudessa voidaankin arvioida Accell siRNA-molekyylien tehokkuutta hiljentää alfasynukleiinin aggregaatioon liittyviä geenejä. BIIB054 vasta-aine havaitsi kertyneen alfasynukleiinin selektiivisesti erityisesti hiiren aivoleikkeissä, joten vasta-aineen avulla voidaan analysoida alfasynukleiinikertymien muodostumista etenkin immunohistokemiallisissa värjäyksissä. Tutkimuksessa arvioitu Parkinsonin taudin hiirimalli vaatii kuitenkin lisää kehitystyötä. Saatujen positiivisten tuloksien avulla kehitetään uusia työkaluja alfasynukleiinin aggregaatiotutkimuksiin, jotka puolestaan voivat auttaa löytämään mahdollisia Parkinsonin taudin kulkua muokkaavia lääkkeitä.