Ultranopeaan immunomäärityskonseptiin perustuvan kiintokantajan kehittäminen

Abstract

Immunomääritykset ovat vasta-aineisiin perustuvia diagnostisia menetelmiä, joilla voidaan mitata näytteistä analyyttien pitoisuuksia niille spesifisten vasta-aineiden avulla. Kiinnostava analyytti voi olla esimerkiksi sairauteen yhdistetty merkkiaine. Analyytin nopea ja tarkka analyysi mahdollistaisi hoidon varhaisen aloituksen ja optimitilanteessa tulos voitaisiin saada jo näytteenoton yhteydessä.

Tämän tutkimuksen tavoitteena oli kehittää uudenlaisen, nopeaan sekoitusmenetelmään perustuvan kiintokantajaprototyypin pintaa. Pinnan streptavidiinin sitoutumistiheyttä oli tarkoitus kasvattaa edeltävästä passiiviseen adsorptioon perustuvasta pinnoitusmenetelmästä ja prototyypin herkkyyttä häiritseviä tekijöitä oli tarvetta karsia.

Polystyreenisiä kiintokantajaprototyyppejä pinnoitettiin silikalla ja silikaan kiinnitettiin kovalenttisesti streptavidiinia, johon biotinyloituja vasta-aineita oli mahdollista immobilisoida. Streptavidiinin sitoutumistiheyttä ja menetelmän kinetiikkaa analysoitiin immunomäärityksillä. Määritykset tehtiin ohjelmoitavalla CNC-laitteella, joka suoritti määritykset mittausvalmiiksi. Lisäksi prototyyppejä kuvannettiin pyyhkäisyelektronimikroskoopilla pinnan analysoimiseksi.

Kehitetty pinnanmuokkausmenetelmä viisinkertaisti prototyypin streptavidiinitiheyden ja menetelmällä päästiin lähelle kaupallisesti valmistettujen mikrolevyjen streptavidiinitiheyttä. Menetelmä pärjäsi kineettisessä vertailussa kaupallisille mikrolevyille, mutta prototyyppikappaleiden välinen hajonta pysyi suurena. Prototyypit sitoivat veriplasmasta immunomääritystä merkittävästi häiritseviä komponentteja, eikä elektronipyyhkäisymikroskoopilla otetuissa kuvissa havaittu varmasti piitä, joka olisi vahvistanut silikapinnoituksen onnistumisen. On luultavaa, ettei silika ole kiinnittynyt polystyreeniin ja streptavidiini on kiinnittynyt kovalenttisesti suoraan polystyreenin sivuryhmiin.

Immunometric assays are diagnostic methods based on antibodies that are capable of measuring analyte concentrations from samples based on antibody-antigen-interactions. An analyte of interest may, for example, be a biomarker associated with a disease. A rapid and accurate analysis of the analyte would allow for an early treatment and in an optimal scenario, the result could be obtained promptly after sampling.

The aim of this study was to develop the surface of a solid phase to work with a novel immunoassay concept based on a rapid mixing technique. Streptavidin density of the solid phase was to be increased and there was a need to analyze and reduce factors that interfere the sensitivity of the solid phase.

Solid phase prototypes made of polystyrene were coated with silica and streptavidin was covalently bound to silica's modified side chains to allow immobilization of biotinylated antibodies. Streptavidin density of the surface and kinetics of the mixing technique was analyzed through immunometric assays. The assays were performed on a CNC-device. Additionally, the solid phases were imaged with a scanning electron microscope.

The developed surface treatment multiplied streptavidin density of the solid phase by 5 which came close to that of commercially coated microplates. The mixing technique came pretty much even in comparison to shaking of microplates, but deviation was large and challenged most of the conclusions. The developed surface treatment was unable to solve the problem with blood plasma. Scanning electron microscope images did not certainly contain silicon which would have proven the treatment to be successful. It is likely that silica was not attached to the polystyrene, but streptavidin's binding to the polystyrene surface was more efficient due to the covalent binding.