Antibioottiresistenttiyden kehittyminen bakteerien metayhteisöissä

Abstract

Bakteerien antibioottiresistenssi on globaalisti kasvava ongelma, joka voi johtaa kliinisessä ja maatalouden käytössä olevien antibioottien tehon heikkenemiseen ja vaikuttaa eliöyhteisöjen toimintaan. Bakteerit ovat jakautuneet tilassa spatiaalisesti ja muodostavat monimuotoisia, vuorovaikutuksessa olevia metayhteisöjä. Bakteerit pystyvät liikkumaan tilassa ja ajassa, ja jakavat resistenssigeenejä mm. plasmidien kautta horisontaalisen geeninsiirron avulla. Antibioottiresistenssi leviää luonnonvalinnan avulla, kun resistentit bakteerit syrjäyttävät antibiooteille herkät kilpailijansa. Bakteerien sopeutuminen antibiootin läsnäoloon on erinomainen esimerkki niiden sopeutumisesta muuttuviin olosuhteisiin ja jatkuvasti käynnissä olevista evoluutioprosesseista. Kokeellisen evoluution avulla voidaan tutkia evoluutiodynamiikkaa kontrolloitujen laboratoriokokeiden avulla ja näitä menetelmiä hyödynnetään myös tässä tutkielmassa.

Tutkimuksen tavoitteena oli selvittää miten bakteerien metayhteisöjen aikaisempi antibioottistressi, kytkeytyneisyys ja geneettinen koostumus vaikuttaa fenotyyppisen antibioottiresistenssin kehittymiseen. Tutkimuksessa käytettiin erilaisia, toisessa tutkimuksessa modifioituja bakteerien metayhteisöjä, joiden diversiteettiä, keskinäistä sekoittumista ja antibioottialtistusta on kontrolloitu. Yhteisöt sisälsivät samat bakteerilajit, mutta niiden yhteisörakenne vaihteli sen mukaan, mikä yhteisöjen lajeista oli evolvoitunut (resistenssi antibiootille). Yhdessä yhteisöistä kaikki lajit olivat evolvoituneet ja mukana oli myös yhteisö, jossa kaikki lajit olivat evolvoitumattomia villityypin yksilöitä. Mikrobilääkeherkkyyttä testattiin MIC-menetelmällä, jossa näitä yhteisöjä kasvatettiin, satunnaisia klooneja eristettiin joka yhteisöstä ja klooneja käsiteltiin 14 erilaisella streptomysiinikonsentraatiolla. Kloonien OD (optical density)-arvot mitattiin spektrofotometrillä ja niiden perusteella määritettiin IC50-arvo, jossa puolet bakteerin kasvusta on estynyt. IC50-arvoja vertailemalla pystyttiin vertailemaan eroja kasvussa antibiootin läsnä ollessa eri kloonien välillä.

Mitä vahvemmalle antibioottipitoisuudelle yhteisöt olivat aikaisemmin altistuneet, sitä korkeampi fenotyyppinen resistenssi bakteeriklooneille oli kehittynyt. Myös kytkeytyneisyys edisti resistenssin kehittymistä, joten mitä useammin yhteisöt olivat sekoittuneet, sitä korkeampi antibioottiresistenssi oli. Antibioottikäsittelyn ja kytkeytyneisyyden yhteisvaikutus resistenssin kehittymiseen oli tilastollisesti merkitsevä, joten yhteisöjen sekoittumisen myötä bakteerit pystyivät levittämään resistenssikykyä. Metayhteisöjen diversiteetti ei selittänyt yhtä vahvasti resistenssin kehittymistä. Metayhteisöjen antibioottiresistenssiä ei ole juurikaan tutkittu, joten aihe kaipaa lisätutkimusta. Tulevat sekvensointitutkimukset todennäköisesti tuovat lisää tietoa resistenssin syntymekanismista. Mikrobien vuorovaikutussuhteita ja antibioottiresistentin kehittymistä tutkimalla voidaan saada lisää tietoa antibioottiresistenssin kehittymisestä ja edistää sekä ihmisten, että ympäristön hyvinvointia.

Bacterial antibiotic resistance is a growing problem globally that can lead to a decline in the efficacy of antibiotics in clinical and agricultural use and affects functioning of communities and organisms. Bacteria are spatially distributed in space and form diverse interacting metacommunities. Bacteria are able to move in space and time, sharing resistance genes for example through plasmids by horisontal gene transfer. Antibiotic resistance spreads by natural selection when resistant bacteria displace their antibiotic-sensitive competitors. The adaptation of bacteria in a presence of an antibiotic is an excellent example of their adaptation to changing conditions and constant ongoing evolutionary processes. Experimental evolution is used to study evolutionary dynamics through controlled laboratory experiments and those methods are also used in this thesis.

The aim of the study was to investigate how previous antibiotic stress, connectivity between bacterial metacommunities and genetic composition affect the development of phenotypic antibiotic resistance. Various bacterial metacommunities modified in another study with diversity, controlled connectivity and antibiotic exposure were used in this study. The communities contained the same bacterial species but their community structure varied according to which of the community species were evolved (developed antibiotic resistance). In one of the communities, all species had evolved and there also was a community in which all species were non-evolved, wild-type individuals. Antimicrobial susceptibility was tested by the MIC-method in which these communities were grown, random clones were isolated from each community and clones were treated with 14 different concentrations of streptomycin. The OD (optical density) values were measured with a spectrophotometer and the IC50-value at which half of the bacterial growth was inhibited, was determined. By comparing IC50-values it was possible to compare differences in growth between different clones in the presence of antibiotics.

The stronger antibiotic concentracion the community had exposured in the past, the higher phenotypic antibiotic resistance the bacterial clones had developed. Connectivity also promoted the development of antibiotic resistance so the more often the communities were mixed, the higher the antibiotic resistance was. The combined effect of antibiotic treatment and connectivity was statistically significant so that mixing the communities bacteria were able to spread resistance. The diversity of metacommunities didn’t explain the development of resistance as strongly. Antibiotic resistance in metacommunities has been studied very little so further research is needed. Future sequencing studies are likely to provide more information on the mechanism of development of antibiotic resistance. By studying the interactions between microbes and the development of antibiotic resistance more information can be obtained and well-being of both humans and the environment can be promoted.