Utilization of activation-induced cytidine deaminase (AID) in mammalian cell display for therapeutic antibody discovery
Östman, Saara (2022-09-27)
Utilization of activation-induced cytidine deaminase (AID) in mammalian cell display for therapeutic antibody discovery
(27.09.2022)
Julkaisu on tekijänoikeussäännösten alainen. Teosta voi lukea ja tulostaa henkilökohtaista käyttöä varten. Käyttö kaupallisiin tarkoituksiin on kielletty.
suljettu
Julkaisun pysyvä osoite on:
https://urn.fi/URN:NBN:fi-fe2022102763388
https://urn.fi/URN:NBN:fi-fe2022102763388
Tiivistelmä
Mammalian cell display is a method which enables controlled selection and screening conditions for antibody discovery, making it possible to select binders against different targets from a large pool of variants. However, constructing large libraries in mammalian cells is difficult. The size of the library is a vital feature because the probability of finding desirable antibodies against the target increases as the library size grows. A credible solution to increasing the library size and improving its diversity could be to implement the process of antibody affinity maturation in vitro by utilizing activation-induced cytidine deaminase (AID). The purpose of this study was to find out how different factors affect the accumulation and localization of AID induced mutations in scFv genes in CHO cells.
The study included two variations of the same gene with and without quadruplex structures (G4s). The cells were transfected with eight different variants of AID and the mutations were examined with next generation sequencing. CHO enhancers were added to the target gene constructs and their effect on transcription level was studied with qPCR. The expression of AID in CHO cells was examined with western blot.
Distinct differences between AID variants in mutation targeting and accumulation could not be detected but the results suggested that G4s could attract mutations 10.1 % more compared to the constructs without said structures. The observed mutation types could be an indication of DNA repair mechanisms’ important role in AID induced mutations. Transcription level of the target gene was decreased in cells including CHO enhancers and their use requires optimization. The expression of AID seemed to decrease significantly after transfection leading to the conclusion that by repeating the AID transfection the probability of mutations could be increased. Further studies are needed to detect and confirm trends in mutations to develop the use of AID towards a reliable and controllable tool for antibody discovery. Nisäkässolunäyttö on menetelmä, joka mahdollistaa kontrolloidut selektio- ja seulontaolosuhteet vasta-aineiden löytämiseksi. Tämä mahdollistaa sitojien valitsemisen eri kohteita vastaan suuresta varianttijoukosta. Suurten kirjastojen rakentaminen nisäkässoluihin on kuitenkin vaikeaa. Kirjaston koko on sen tärkeä ominaisuus, koska todennäköisyys löytää sopivia vasta-aineita kohdetta vastaan kasvaa kirjaston koon kasvaessa. Mahdollinen ratkaisu kirjaston laajentamiseen ja sen monimuotoisuuden parantamiseen voisi olla vasta-aineiden affiniteettimaturaation toteuttaminen in vitro aktivaatioindusoitua sytidiinideaminaasia (AID) hyödyntämällä. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää, kuinka eri tekijät vaikuttavat AID:n aiheuttamien mutaatioiden kohdentumiseen ja kertymiseen scFv-geeneissä CHO-soluissa.
Tutkimus toteutettiin saman geenin kahdella muunnelmalla quadruplex(G4) -rakenteilla ja ilman. Solut transfektoitiin kahdeksalla eri AID-variantilla ja mutaatiot karakterisoitiin uuden sukupolven sekvensoinnilla. Kohdegeenirakenteisiin lisättiin CHO-tehostajia ja niiden vaikutusta transkriptiotasoon tutkittiin qPCR:llä. AID:n ekspressiota CHO- soluissa tutkittiin Western blot -menetelmällä.
Selkeitä eroja AID-varianttien välillä mutaatioiden kohdentumisessa ja kertymisessä ei havaittu, mutta tulokset viittasivat siihen, että G4-rakenteet voisivat houkutella mutaatioita 10,1 % enemmän verrattuna konstrukteihin ilman mainittuja rakenteita. Havaitut mutaatiotyypit ovat mahdollinen osoitus DNA:n korjausmekanismien tärkeästä roolista AID:n aiheuttamissa mutaatioissa. Kohdegeenin transkriptiotaso laski CHO- tehostajan sisältämissä soluissa ja niiden käyttö vaatii optimointia. AID:n ekspressio näytti laskevan merkittävästi transfektion jälkeen, mistä voidaan päätellä, että mutaatioiden kertymisen todennäköisyyttä voitaisiin parantaa toistamalla AID- transfektio. Lisätutkimuksia tarvitaan mutaatiotrendien havaitsemiseksi ja vahvistamiseksi, jotta AID:n käyttöä voidaan kehittää luotettavaksi ja hallittavaksi työkaluksi vasta-aineiden löytämiseen.
The study included two variations of the same gene with and without quadruplex structures (G4s). The cells were transfected with eight different variants of AID and the mutations were examined with next generation sequencing. CHO enhancers were added to the target gene constructs and their effect on transcription level was studied with qPCR. The expression of AID in CHO cells was examined with western blot.
Distinct differences between AID variants in mutation targeting and accumulation could not be detected but the results suggested that G4s could attract mutations 10.1 % more compared to the constructs without said structures. The observed mutation types could be an indication of DNA repair mechanisms’ important role in AID induced mutations. Transcription level of the target gene was decreased in cells including CHO enhancers and their use requires optimization. The expression of AID seemed to decrease significantly after transfection leading to the conclusion that by repeating the AID transfection the probability of mutations could be increased. Further studies are needed to detect and confirm trends in mutations to develop the use of AID towards a reliable and controllable tool for antibody discovery.
Tutkimus toteutettiin saman geenin kahdella muunnelmalla quadruplex(G4) -rakenteilla ja ilman. Solut transfektoitiin kahdeksalla eri AID-variantilla ja mutaatiot karakterisoitiin uuden sukupolven sekvensoinnilla. Kohdegeenirakenteisiin lisättiin CHO-tehostajia ja niiden vaikutusta transkriptiotasoon tutkittiin qPCR:llä. AID:n ekspressiota CHO- soluissa tutkittiin Western blot -menetelmällä.
Selkeitä eroja AID-varianttien välillä mutaatioiden kohdentumisessa ja kertymisessä ei havaittu, mutta tulokset viittasivat siihen, että G4-rakenteet voisivat houkutella mutaatioita 10,1 % enemmän verrattuna konstrukteihin ilman mainittuja rakenteita. Havaitut mutaatiotyypit ovat mahdollinen osoitus DNA:n korjausmekanismien tärkeästä roolista AID:n aiheuttamissa mutaatioissa. Kohdegeenin transkriptiotaso laski CHO- tehostajan sisältämissä soluissa ja niiden käyttö vaatii optimointia. AID:n ekspressio näytti laskevan merkittävästi transfektion jälkeen, mistä voidaan päätellä, että mutaatioiden kertymisen todennäköisyyttä voitaisiin parantaa toistamalla AID- transfektio. Lisätutkimuksia tarvitaan mutaatiotrendien havaitsemiseksi ja vahvistamiseksi, jotta AID:n käyttöä voidaan kehittää luotettavaksi ja hallittavaksi työkaluksi vasta-aineiden löytämiseen.