Yhdisteryhmäspesifisen UHPLC-MS/MS-menetelmän kehittäminen flavoniglykosidien detektointiin
Väisänen, Tuuli (2024-11-06)
Yhdisteryhmäspesifisen UHPLC-MS/MS-menetelmän kehittäminen flavoniglykosidien detektointiin
(06.11.2024)
Julkaisu on tekijänoikeussäännösten alainen. Teosta voi lukea ja tulostaa henkilökohtaista käyttöä varten. Käyttö kaupallisiin tarkoituksiin on kielletty.
suljettu
Julkaisun pysyvä osoite on:
https://urn.fi/URN:NBN:fi-fe2024110789815
https://urn.fi/URN:NBN:fi-fe2024110789815
Tiivistelmä
Flavonit ovat yleisiä kasveista löytyviä flavonoideihin kuuluvia yhdisteitä, jotka voidaan erottaa muista flavonoidesta C-renkaan rakenteellisten erojen perusteella. Flavonit yhdessä muiden flavonoidien kanssa suojaavat kasveja niin eläviltä kuin elottomiltakin tekijöiltä, ja lisäksi niillä on terveydelle hyödyllisiä ominaisuuksia.
Flavonien niin kuin muidenkin flavonoidien analytiikassa käytetään useimmiten UHPLC-MS/MS- tekniikkaa ja ionisaatiomenetelmänä sähkösumutusionisaatiota (ESI). Yhdisteryhmäspesifisiä usean reaktion seurantaan (MRM) perustuvia menetelmiä on kehitetty jo useammalle muulle yhdisteryhmälle, mutta ei flavoneille. Tässä työssä luotiin yhdiste- ja ryhmäspesifinen UHPLC- MS/MS-menetelmä kolmoiskvadrupolilaitteella 20 flavoniglykosidille, ja menetelmän avulla voidaan nähdä yleiskuva näytteen sisältämistä flavoneista sekä pystytään kvantitoimaan eri flavonijohdannaiset. Menetelmä kehitettiin optimoimalla kartiojännite kunkin flavoniryhmän prekursori- eli aglykoni-ionille ja törmäysenergia neljälle tuoteionille. Lopuksi kehitetty menetelmä validoitiin eli määritettiin lineaarinen alue, toistettavuus sekä havaitsemis- ja määritysraja (LOD ja LOQ).
Kaikille flavoniryhmille valittiin neljä aglykoni>fragmentti-siirtymää, joita vertailtiin ionisuhteiden ja väärien positiivisten osumien avulla, ja lisäksi kaikki validoinnin osa-alueet määritettiin kaikille neljälle siirtymälle. Positiivisella ionisaatiolla vasteet olivat suuremmat kuin negatiivisella ionisaatiolla kaikilla yhdisteillä. Kvantitatiiviseksi siirtymäksi valittiin ionipari, joka antoi suurimman vasteen ja jonka lineaarinen alue oli laajin. Negatiivisella ionisaatiolla apigeniini- ja luteoliinijohdannaisille ei kuitenkaan pystytty valitsemaan yksikäsitteisesti kvantitatiivista siirtymää, sillä intensiivisin fragmentti vaihteli yhdisteryhmän yhdisteiden välillä.
Validointituloksissa oli vaihtelua flavoniryhmien ja yhdisteiden välillä. Laajin lineaarinen alue oli positiivisella ionisaatiolla apigeniinin ja akasetiinin kvantitatiivisilla siirtymillä (0,0074–1,9 μg ml- 1). LOD oli positiivisella ionisaatiolla kvantitatiivisilla siirtymillä 0,023–7,4 ng ml-1 ja LOQ 0,091– 7,4 ng ml-1, ja LOD kuitenkin aina pienempi kuin LOQ. Negatiivisella ionisaatiolla akasetiini- ja diosmetiinijohdannaisilla kvantitatiivisen siirtymän LOD oli 0,0057–2,5 ng ml-1 ja LOQ 0,0057–7,4 ng ml-1 ja apigeniini- ja luteoliinijohdannaisilla kaikilla siirtymillä vastaavasti 0,82–120 ng ml-1 ja 0,82–470 ng ml-1.
Flavonien niin kuin muidenkin flavonoidien analytiikassa käytetään useimmiten UHPLC-MS/MS- tekniikkaa ja ionisaatiomenetelmänä sähkösumutusionisaatiota (ESI). Yhdisteryhmäspesifisiä usean reaktion seurantaan (MRM) perustuvia menetelmiä on kehitetty jo useammalle muulle yhdisteryhmälle, mutta ei flavoneille. Tässä työssä luotiin yhdiste- ja ryhmäspesifinen UHPLC- MS/MS-menetelmä kolmoiskvadrupolilaitteella 20 flavoniglykosidille, ja menetelmän avulla voidaan nähdä yleiskuva näytteen sisältämistä flavoneista sekä pystytään kvantitoimaan eri flavonijohdannaiset. Menetelmä kehitettiin optimoimalla kartiojännite kunkin flavoniryhmän prekursori- eli aglykoni-ionille ja törmäysenergia neljälle tuoteionille. Lopuksi kehitetty menetelmä validoitiin eli määritettiin lineaarinen alue, toistettavuus sekä havaitsemis- ja määritysraja (LOD ja LOQ).
Kaikille flavoniryhmille valittiin neljä aglykoni>fragmentti-siirtymää, joita vertailtiin ionisuhteiden ja väärien positiivisten osumien avulla, ja lisäksi kaikki validoinnin osa-alueet määritettiin kaikille neljälle siirtymälle. Positiivisella ionisaatiolla vasteet olivat suuremmat kuin negatiivisella ionisaatiolla kaikilla yhdisteillä. Kvantitatiiviseksi siirtymäksi valittiin ionipari, joka antoi suurimman vasteen ja jonka lineaarinen alue oli laajin. Negatiivisella ionisaatiolla apigeniini- ja luteoliinijohdannaisille ei kuitenkaan pystytty valitsemaan yksikäsitteisesti kvantitatiivista siirtymää, sillä intensiivisin fragmentti vaihteli yhdisteryhmän yhdisteiden välillä.
Validointituloksissa oli vaihtelua flavoniryhmien ja yhdisteiden välillä. Laajin lineaarinen alue oli positiivisella ionisaatiolla apigeniinin ja akasetiinin kvantitatiivisilla siirtymillä (0,0074–1,9 μg ml- 1). LOD oli positiivisella ionisaatiolla kvantitatiivisilla siirtymillä 0,023–7,4 ng ml-1 ja LOQ 0,091– 7,4 ng ml-1, ja LOD kuitenkin aina pienempi kuin LOQ. Negatiivisella ionisaatiolla akasetiini- ja diosmetiinijohdannaisilla kvantitatiivisen siirtymän LOD oli 0,0057–2,5 ng ml-1 ja LOQ 0,0057–7,4 ng ml-1 ja apigeniini- ja luteoliinijohdannaisilla kaikilla siirtymillä vastaavasti 0,82–120 ng ml-1 ja 0,82–470 ng ml-1.